晚期糖基化終產物及其胞膜受體在口腔領域的研究進展*

鄧涵丹，張 嵐，劉 瀏，黃定明

（口腔疾病研究國家重點實驗室，國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心，四川大學華西口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，四川 成都610041）

晚期糖基化終產物（advanced glycation end products，AGEs）是還原糖分子（如葡萄糖、果糖、戊糖等）與蛋白質、脂質或核酸進行非酶化學反應形成的一組不可逆共價化合物［1］。AGEs能與細胞膜上的AGEs受體（receptor for AGEs，RAGE）結合而啟動下游信號級聯(lián)反應，參與神經退行性疾病、動脈粥樣硬化、骨質疏松、衰老和某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程［2］。

人口腔上皮、牙髓組織、牙周組織及唾液腺中均存在RAGE［3-4］。口腔癌、舍格倫綜合征、糖尿病相關的牙周炎等口腔疾病與AGEs的升高和RAGE的高表達密切相關，通過RAGE抑制劑阻斷AGE-RAGE及其下游信號通路可緩解上述疾病［5-7］。本文就AGEs及其胞膜受體RAGE進行概述，總結目前AGERAGE信號轉導通路在口腔病理生理方面的研究進展。

1 AGEs及其胞膜受體概述

1.1 AGEs的形成、結構與分布 還原糖的醛基與蛋白質、脂質或核酸的氨基縮合成不穩(wěn)定的Schiff堿基中間體，緩慢重組形成相對穩(wěn)定的Amadori糖胺類中間產物，這兩種早期糖基化產物經歷一系列脫水和重排等pH依賴反應，產生羧基化合物（如丙酮醛）等中期糖基化產物，再進一步地與蛋白質的自由氨基共價結合形成穩(wěn)定交聯(lián)結構的AGEs，該生成過程被稱為美拉德反應（Maillard reaction）或糖基化反應（glyca‐tion reaction）［8］?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)至少四十種AGEs，其中大部分含有賴氨酸或（和）精氨酸殘基，廣泛分布于人體血液、肌腱、腸道和肝臟等全身組織器官［9］。

1.2 RAGE的配體、結構與異構體 RAGE是免疫球蛋白超家族的一種多配體模式識別受體，除AGEs外，還可識別高遷移率族盒蛋白1（high mobility group box protein 1，HMGB1）、鈣結合蛋白S100家族等具有多個β折疊結構特征的配體。RAGE作為一種跨膜蛋白，結構分為胞外、胞內和跨膜結構域。胞外區(qū)由3個免疫球蛋白樣區(qū)域（1個“V”型區(qū)域和2個“C”型區(qū)域）組成，“V”型結構域對于AGEs的結合是關鍵的，胞內區(qū)則是由數(shù)十個氨基酸組成的胞漿尾巴，對于RAGE介導的細胞內信號轉導是必不可少的［8］。

大部分RAGE是包含所有結構域的完整跨膜蛋白，但體內也存在單個或多個結構域缺失的RAGE異構體。例如因內含子和外顯子選擇性剪切導致跨膜結構域和胞漿尾巴編碼區(qū)域缺失而形成的內源性分泌型RAGE（endogenous secretory RAGE，esRAGE），或者在翻譯表達后被金屬蛋白酶水解胞外結構域、伽馬酶裂解跨膜結構域后形成的裂解型RAGE（cleaved RAGE，cRAGE）［10］。esRAGE和cRAGE以可溶性RAGE（soluble RAGE，sRAGE）形式被釋放到全身循環(huán)，正常結合AGEs后因為缺乏胞漿尾巴無法進行細胞內信號轉導，從而抑制AGE-RAGE信號通路［11］。慢性牙周炎患者的齦溝液和血清中sRAGE均低于健康人水平［12］，因此可以將齦溝液和血清sRAGE作為慢性牙周炎的生物學標志。

2 AGEs和RAGE與口腔疾病的相關性

口腔作為人體與外環(huán)境交通的重要門戶之一，烹飪的食物、富含多肽的飲料和香煙煙霧均能在口腔微環(huán)境中形成AGEs［6］。AGEs和RAGE與口腔炎癥性疾病高度相關，牙周炎人群牙齦上皮RAGE的表達較健康對照組增加［13］。炎癥牙髓組織中成牙本質細胞、牙髓成纖維樣細胞和牙髓炎時組織襯里的內皮樣細胞中RAGE明顯上調［14］。根尖周肉芽腫組織中AGE-RAGE共表達的細胞數(shù)量明顯高于S100-RAGE共表達的細胞數(shù)量，提示AGEs與RAGE的結合可能在炎癥誘導中占主導地位［15］。RAGE同樣表達于唇腺等唾液腺的肌上皮細胞和黏膜細胞中，AGEs聚集后結合和激活RAGE，從而導致唾液腺的炎癥性破壞，與唾液腺炎癥性疾病如舍格倫（Sjo‐gren）綜合征的形成有關［7］。在舌、牙齦、口腔黏膜和硬腭中發(fā)現(xiàn)RAGE與口腔癌高度相關，并且可能與癌變侵襲性有關［16-17］。

3 AGE-RAGE信號通路在口腔疾病中作用的研究進展

口腔環(huán)境的AGEs與細胞膜表面受體RAGE結合后，形成AGE-RAGE信號通路，在不同組織細胞中通過對炎癥反應，細胞的凋亡、增殖和自噬，以及成骨分化的調控，影響口腔疾病進程。

3.1 炎癥反應 AGE-RAGE信號通路在口腔疾病發(fā)生中起促炎作用［18］。將牙齦上皮細胞暴露于富含AGEs的煙草煙霧中，細胞膜內側的Ras（p21）表達增加，核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路被激活，白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和IL-1β等炎性細胞因子釋放［19］。人牙周膜細胞中，核苷酸結合寡聚化結構域（nucleotide-binding oligomerization do‐main，NOD）樣受體（NOD-like receptors，NLRs）家族中NLRP1和NLRP3形成的炎癥小體在AGEs的刺激下被啟動，通過轉錄后調控刺激IL-1β大量生成［20］，從而加重炎癥反應。

在體外培養(yǎng)的大鼠牙髓細胞中，AGEs通過RAGE激活p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogenactivated protein kinase，p38 MAPK）和細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號通路，進而誘導鈣結合蛋白家族S100A8和S100A9表達增加，分泌到胞膜外的S100A9與胞膜上Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）結合，激活NF-κB、p38、ERK和JNK等經典炎癥信號通路，擴大炎癥反應環(huán)［21-22］。而使用糖基化交聯(lián)抑制劑N-苯甲酰噻唑溴化物（N-phenacylthiazolium bromide），AGE-RAGE軸被阻斷，腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IL-6等炎性細胞因子產生減少，牙周炎得到有效緩解［23］。

然而AGE-RAGE軸對炎癥的促進作用在某些情況下并不明顯，在種植體骨整合的Wistar大鼠模型中，高AGEs無法觸發(fā)種植體周圍炎［3］；抗RAGE的免疫治療對Zucker肥胖大鼠AGEs相關的牙周炎沒有影響［24］。AGE-RAGE信號通路對口腔組織炎癥反應起到抑制作用。將人口腔上皮細胞TR146與分化的中性粒細胞D-HL-60共同培養(yǎng)于Transwell中，在TR146中，AGEs通過RAGE促進ERK和p38磷酸化，激活NF-κB，上調炎癥因子脂質運載蛋白2（lipo‐calin-2，LCN2）的表達。LCN2具有高濃度促炎、低濃度抑炎的雙重調節(jié)作用，在TR146分泌的LCN2濃度較低的情況下，抑制共培養(yǎng)環(huán)境中性粒細胞IL-6的表達，促進中性粒細胞的遷移，發(fā)揮抑炎和免疫調節(jié)的作用，因此AGE-RAGE-LCN2可能通過調節(jié)炎癥反應影響牙周炎的病理狀態(tài)［25］。見圖1。

Figure 1.The role of AGE-RAGEsignal pathway in inflammation.圖1 AGE-RAGE信號通路在炎癥反應中的作用

3.2 細胞生理活動 AGE-RAGE信號通路能夠調控凋亡、增殖、自噬等細胞活動從而影響細胞的狀態(tài)。人牙周膜成纖維細胞用AGEs處理后表達較高水平的RAGE，下調Bcl-2，上調Bax和caspase-3的表達，細胞凋亡率較對照組明顯上升［26］。同時，AGE-RAGE導致人牙周膜細胞線粒體氧化應激增強，線粒體形態(tài)以及動力學發(fā)生改變，引起線粒體依賴性凋亡［27］。大鼠頜下腺中也發(fā)現(xiàn)AGEs刺激RAGE表達上調，凋亡標志因子BAD、Bax和caspase-3均強于對照組，腫瘤蛋白p53被早期激活［28］。此外，AGEs環(huán)境下，間充質干細胞的增殖能力和遷移能力均下降，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等生長因子的mRNA和蛋白表達水平顯著降低［29］。而RAGE抑制劑FPS-ZM1的使用可阻斷RAGE-NF-κB信號通路，進而恢復其增殖能力［30］。

在口腔腫瘤組織中，AGE-RAGE軸對細胞活動表現(xiàn)出與上述相反的影響。在口腔鱗癌細胞系中，AGEs通過RAGE促進ERK磷酸化，上調Ras和蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT），激活細胞內NFκB信號通路，促進基質金屬蛋白酶2/9（matrix metal‐loproteinase-2/9，MMP-2/9）的 表 達，細 胞 遷 移 加強［31-32］；同時，ERK磷酸化抑制下游核因子E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）-血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）信號，抑制抑癌蛋白p53和Bax的表達，而Bcl-2家族中凋亡調節(jié)因子Bcl-xL蛋白表達增強，協(xié)同抑制p53信號通路，抑制細胞凋亡［33］；此外AGE-RAGE導致VEGF上調，增強腫瘤血管生成能力，為腫瘤細胞生長提供所需的營養(yǎng)環(huán)境［34］。

在人牙周膜細胞，AGE-RAGE還能通過激活ERK1/2通路下調p62表達，促使自噬分子標志物微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）的胞漿型（LC3-I）向自噬體膜型（LC3-II）轉換，產生自噬小體，減少細胞的凋亡［27］。在血管內皮細胞中，AGEs通過AKT介導的信號通路誘導自噬水平升高，減輕AGEs誘導的凋亡程度［35］。這可能是AGEs促進細胞存活的另一種保護機制，為AGE-RAGE相關口腔疾病提供一種新的治療策略。見圖2。

Figure 2.The role of AGE-RAGEsignal pathway in cellular physiological activity.A：cellular protection；B：cellular injury.圖2 AGE-RAGE信號通路在細胞生理活動中的作用

3.3 成骨分化 AGE-RAGE信號通路對成骨分化存在雙重調控作用。在人牙周膜干細胞中，AGEs通過激活RAGE和胞內信號轉導分子蛋白激酶Cβ2（protein kinase Cβ2，PKCβ2）負向調控成骨分化標志物Runt相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）和骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）的表達；胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）通過抑制PKCβ2磷酸化可逆轉AGEs對成骨分化的負面影響［36］。AGEs與RAGE的結合還能增加DNA甲基化程度，上調糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β），使β-連環(huán)蛋白（β-catenin）和淋巴樣增強子結合因子1（lymphoid enhancer-binding factor 1，Lef1）出現(xiàn)時間依賴性下調，Wnt信號通路受到抑制，從而抑制細胞成骨向分化［37］。

但也有研究表明，AGEs作用于牙髓細胞后，RAGE、OPN和骨鈣素（osteocalcin，OCN）的mRNA和蛋白水平表達都增加，對ALP活性和鈣化結節(jié)形成有明顯的促進作用，而對牙齦成纖維細胞無明顯影響［38］。

4 糖尿病通過AGE-RAGE信號通路影響口腔病理生理狀態(tài)

糖尿病作為口腔疾病最相關的全身系統(tǒng)性疾病之一，主要特點是AGEs的高表達?；继悄虿〉难乐苎兹巳狠^單純牙周炎人群，RAGE的表達更高，齦溝液中炎癥因子如TNF-α和IL-1β均增加，牙周炎癥更重［39-40］。在大鼠模型中，糖尿病顯著增加牙齦和牙周膜炎癥反應的強度和持續(xù)時間［41］；同時，AGE-RAGE刺激血管細胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）和細胞間黏附分子1（intercel‐lular adhesion molecule-1，ICAM-1）的表達增強，血管通透性增加，從而加重炎癥反應［42］。

成骨細胞的RAGE在高糖環(huán)境中表達水平較高，此時牙槽骨對AGE-RAGE的調控更加敏感［43］。糖尿病病人和大鼠血清中AGEs的存在能夠顯著降低成骨細胞在鈦種植體表面的黏附，從而延遲種植體的骨整合［44］。此外，高糖環(huán)境可通過促進牙周膜成纖維細胞、成骨細胞和成骨細胞前體細胞的凋亡而對牙周組織造成負面影響，形成糖尿病第六大并發(fā)癥——牙周病［45-46］。

AGE-RAGE在唾液腺中能夠激活NF-κB通路，產生唾液腺炎，同時上調Bax和caspase-3導致腺體細胞凋亡，從而引起唾液腺分泌功能障礙［47］。在牙髓細胞中，AGE-RAGE上調OPN和OCN，增加成骨向分化，這在一定程度上解釋了糖尿病患者牙髓組織常出現(xiàn)病理性鈣化的原因［38］。

5 小結

AGEs通過RAGE及其下游NF-κB、MAPK、AKT等信號通路在口腔組織疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著復雜的作用。目前病理生理學研究主要集中于炎癥反應、以凋亡為主的細胞生理活動以及成骨分化三大方面，對細胞自噬僅進行了初步探究。上述各方面的生物學效應仍存在爭議，應在口腔疾病模型中進一步研究。

此外，全身系統(tǒng)性疾病糖尿病通過AGE-RAGE與牙周病、唾液腺疾病、牙髓鈣化等口腔疾病建立聯(lián)系，提示了全身與口腔的關鍵性結點，在AGE-RAGE信號通路中有望找到相關疾病的治療靶點。