祖慶學(xué)，李宏江，聶忠揚，于曉飛，張翼飛，李昊熙*

（1.貴州省貴陽市煙草公司開陽縣分公司 貴陽市 550300；2.貴州大學(xué)煙草學(xué)院/貴州省煙草品質(zhì)研究重點實驗室 貴陽市 550025）

烤煙是貴州省的一種重要經(jīng)濟作物，但是烤煙生產(chǎn)受到多種病蟲害的威脅。煙草花葉病毒（To?bacco mosaic virus，TMV）、黃瓜花葉病毒（Cucum?ber mosaic virus，CMV）和馬鈴薯Y病毒（Potato vi?rus Y，PVY）3種正義單鏈核糖核酸（+ssRNA）病毒長期困擾了貴州各個主要煙區(qū)[1-4]。病毒病不僅降低了烤煙產(chǎn)量，還影響了產(chǎn)品的質(zhì)量和分級，造成了巨大的經(jīng)濟損失[5]。由于植物病毒的治療手段非常有限，抗病毒品種的選育和早期染病植株的清除是控制病毒病的主要手段[6]。3種病毒中，CMV和PVY主要經(jīng)過蚜蟲等介體昆蟲進行非持續(xù)性傳播，而TMV則主要依靠機械摩擦傳播，因此，針對性開展的阻斷傳播的防控手段就不盡相同。所以，病毒種類的快速和高效地檢測是非常重要的工作。3種RNA病毒寄主范圍很廣，主要包括辣椒、馬鈴薯等蔬菜作物，還有許多種雜草。在烤煙植株上，TMV和CMV都表現(xiàn)出了相似的“花葉”病狀，主要表現(xiàn)在幼株葉片不規(guī)則褪綠、葉片卷曲，以及成株矮小甚至整片葉面黃化等現(xiàn)象。而PVY的田間癥狀與前面2種差異較大，比如沿著葉脈的褪綠[7]。而病毒病癥狀易受煙株的發(fā)育程度、氣候條件和病毒株系的影響，增加了田間判斷發(fā)病與否以及區(qū)分癥狀種類的難度。近年來，多種病毒的復(fù)合侵染烤煙的報道逐漸增多[8-9]，進一步加大了病毒檢測工作的難度。

目前植物病毒檢測主要采取血清學(xué)和分子生物學(xué)方法[6]。血清學(xué)方法常借助于預(yù)先準備特異性抗體相關(guān)的材料[9-11]，而分子生物學(xué)檢測所需的PCR儀等常規(guī)裝置，因其實驗條件、設(shè)備以及操作方法簡單等優(yōu)點，更容易成為生產(chǎn)實踐推廣的快速檢測技術(shù)。本研究利用基層檢測站點的PCR儀等設(shè)備，通過靶定外殼蛋白基因特異性區(qū)域設(shè)計引物和PCR條件，開發(fā)一套針對貴州煙區(qū)3種RNA病毒（TMV、CMV和PVY）的檢測方法。

1 材料方法

1.1 烤煙樣品的采集

2020年7月采集烤煙旺長期的感染病毒葉片，葉片樣品包括4種癥狀類型，使用Agdia牌試紙條檢測了感染病毒的種類，詳細標本的名稱、癥狀、采集地與煙草品種的信息如表1所示。

表1 染病煙葉樣品的相關(guān)信息

1.2 樣品總RNA的提取及其c DNA的合成

每個樣品稱取100 m g的葉片組織，加入液氮后充分碾磨，將碾碎的粉末加入離心管中用于總RNA的提取。提取步驟參照RNeasy?Plant Mini Kit（Qiagen）試劑盒：首先在碾磨充分的樣品加入450μL的RLT緩沖液，振蕩均勻；然后將混合液體轉(zhuǎn)入配套的QIAshredder層析管中，14 000 r/min離心2 min，在上清液中加入1/2體積的無水乙醇；又將混合液體轉(zhuǎn)入配套的RNeasy層析管中，14 000 r/min離心15 s后，用RW1緩沖液洗脫1次，RPE緩沖液洗脫2次；最后用30μL去RNA酶溶解總RNA產(chǎn)物。RNA提取前用0.1%的DEPC水處理所有工具與操作臺，杜絕RNA酶干擾。

使用2μL的總RNA作為模板進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（ThermoScientific）的25μL反應(yīng)體系，包括了：1μL的Oligo（dT）18引物混合物，4μL的5×Reaction Buffer，1μL的RiboLockRNase Inhibitor（20 U/μL），2μL的dNTP混合液（10 mM），1μL的RevertAid MMuLV RT（200 U/μL）。得到的cDNA保存用于后續(xù)檢測反應(yīng)。

1.3 PCR引物設(shè)計及PCR反應(yīng)

從GenBank中下載得到TMV（No.NC_001 367）和PVY（No.NC_001 616）的全基因組序列，CMV基因組中包含了外殼蛋白（Coat Protein，CP）基因的第III片段（No.NC_001 440）的序列，以及各個基因組中外殼蛋白編碼基因的具體范圍信息。分別針對3種病毒的外殼蛋白基因特異性區(qū)域設(shè)計了3對引物，如表2所示。主要的設(shè)置條件是3對引物覆蓋的基因片段的長度具有較大的差異，分別為：TMV-120 bp，CMV-240 bp和PVY-660 bp，退火溫度均為55?C。

表2 3種病毒的引物序列

PCR反應(yīng)的程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共25個循環(huán)；最后72℃延伸7 min，4℃保存。

1.4 單一引物檢測

將3對引物分別與3種病毒的cDNA進行PCR反應(yīng)，檢測所設(shè)計引物的特異性。具體操作如下：利用3個單一病毒侵染葉片樣品（T、C和P）得到的cDNA作為模板，分別與設(shè)計的3對特異性引物進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為25μL，包括：1μL的cDNA模板，10 mmol/L的上、下游引物，13μL的2X SanTaq PCR Master Mix（with Blue Dye，生工 生物）。反應(yīng)條件同1.3。PCR反應(yīng)的結(jié)果用凝膠電泳檢測。

1.5 3對引物的混合體系檢測

構(gòu)建3對引物的混合體系，反應(yīng)體系為25μL，包括：1μL的cDNA模板，10 mmol/L的全部3對上、下游引物的混合物，13μL的Qiagen Multiplex PCR Master Mix，然后對樣品進行PCR反應(yīng)，檢測感染病毒的種類。首先將3個單一病毒侵染樣品（T、C和P）的cDNA分別作為模板，無DNA模板的反應(yīng)（N）作為空白對照進行反應(yīng)。其次利用同時被2種病毒感染的葉片（D）得到的cDNA作為模板，無DNA模板的體系（N）作為空白對照，分別重復(fù)2次進行反應(yīng)。然后利用3個單一感染樣品的cDNA的混合物（M）作為模板，無DNA模板的體系（N）作為空白對照，也分別重復(fù)2次進行反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件全部同1.3。PCR反應(yīng)的結(jié)果用凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果和分析

2.1 樣品的免疫試劑條檢測

采集到的感染病毒的烤煙葉片樣品的免疫試紙條檢測結(jié)果如表1所示，樣品T、C和P分別僅僅感染了煙草花葉病毒（TMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）和馬鈴薯Y病毒（PVY），樣品D同時感染了CMV和PVY。

2.2 引物特異性的PCR檢測

在相同的PCR反應(yīng)程序下，3對引物分別能夠特異性地從3種病毒的cDNA中擴增出外殼蛋白片段條帶。如圖1所示，TMV引物（TMV_CP_F1與TMV_CP_R1）僅僅只能從含TMV的樣品T的cDNA模板中擴增出對應(yīng)的120 bp的片段，而CMV（CMV_CP_F1與CMV_CP_R1）和PVY（PVY_CP_F1與PVY_CP_R1）的引物僅能從對應(yīng)的引物中擴增出240 bp和660 bp的特異性片段。

圖1 3對引物（A-TMV引物，B-CMV引物，C-PVY引物）分別針對3種病毒（T-TMV，C-CMV，P-PVY）的c DNA的PCR電泳圖

2.3 單一感染的檢測結(jié)果

在相同的反應(yīng)程序下，通過1次相同的PCR反應(yīng)，3對引物的混合體系就分別特異性地從3種病毒的cDNA中擴增出對應(yīng)大小的外殼蛋白片段條帶。如圖2所示，引物混合體系僅能從樣品T、P和C的cDNA模板中擴增出120 bp（TMV）、660 bp（PVY）和240 bp（CMV）片段，空白對照無反應(yīng)。

圖2 3對引物混合檢測單一感染樣品（T-TMV，P-PVY，C-CMV，N-空白對照）的病毒種類PCR反應(yīng)電泳圖

2.4 雙重感染的檢測結(jié)果

通過3對引物混合體系的PCR反應(yīng)，也能夠根據(jù)擴增出條帶的大小檢測雙重侵染樣品中2種病毒的種類。如圖3所示，引物混合體系從樣品D的2個重復(fù)反應(yīng)（D1和D2）中擴增出2條條帶，大小分別是240 bp（CMV）和660 bp（PVY），空白對照（N1和N2）無反應(yīng)。

圖3 3對引物混合檢測雙重感染樣品（D-CMV和PVY，N-空白對照）的病毒種類PCR反應(yīng)電泳圖

2.5 3種病毒c DNA混合物的檢測結(jié)果

通過3對引物混合體系的PCR反應(yīng)，還能夠根據(jù)擴增出條帶的大小檢測3種病毒DNA混合物的種類。如圖4所示，引物混合體系從TMV、CMV和PVY 3種病毒cDNA混合物M的2個重復(fù)反應(yīng)（M1和M2）中擴增出3條條帶，大小分別是120 bp（TMV）、240 bp（CMV）和660 bp（PVY），空白對照（N1和N2）無反應(yīng)。

圖4 3對引物混合檢測3種病毒混合DNA（M-TMV、CMV和PVY混合，N-空白對照）的種類PCR反應(yīng)電泳圖

3 小結(jié)

目前貴州煙區(qū)主要病毒病的鑒定是依靠癥狀表現(xiàn)，但是由于田間癥狀的差異性不明顯，加上相關(guān)寄主、介體昆蟲和復(fù)合侵染的廣泛存在，鑒定烤煙是否感染病毒以及確定病毒的種類都給經(jīng)驗缺乏的煙農(nóng)和基層煙葉站人員增加了困擾。病毒檢測試紙條則大大提高了準確性，如開陽在內(nèi)的部分分公司、煙葉站配置了試紙條，精確性非常高。但是在同時檢測大量癥狀類似的材料時，尤其是復(fù)合侵染材料檢測，成本就提高了，時間上的效率也下降?；旌蠘悠返臋z測技術(shù)就應(yīng)運而生，這種利用混合引物設(shè)計反應(yīng)條件的PCR檢測方法在國內(nèi)外被廣泛報道，如檢測日本紅薯的4種RNA病毒[12]、匈牙利辣椒的3種RNA病毒[13]、我國西紅柿的6種病毒[14]與甘薯的3種RNA病毒[15]。在這些研究中，外殼蛋白都是重要的分子標記，因為外殼蛋白是病毒基因組的主要組成部分，也在很大程度上體現(xiàn)了病毒種類的多樣性[16]。我國烤煙生產(chǎn)中也先后開發(fā)了2套PCR檢測體系，分別針對3種[17]與5種[18]RNA病毒，而且2套檢測方法均涉及到了退火溫度與cDNA模板濃度的優(yōu)化，因而具有非常高的檢測精確性，而基層檢測站點往往不能達到相應(yīng)的工序要求。目前，貴州煙區(qū)還比較缺乏相關(guān)方面的研究。

本研究針對貴州煙區(qū)田間感染病毒的鮮煙葉樣品材料，靶向3種+ssRNA病毒（TMV、CMV和PVY）外殼蛋白基因，設(shè)計了3對特異性引物的混合體系與相同退火溫度（55?C）配套的PCR反應(yīng)程序，其中的6條引物全部是單義堿基。通過1次PCR反應(yīng)，就可以根據(jù)擴增條帶的長度，一次性檢測RNA病毒的種類，可一次性檢測出復(fù)合侵染的2種病毒，也可以檢測出3種病毒cDNA混合物的種類，因而具備檢測出其他類型復(fù)合侵染的理論可能性。PCR反應(yīng)不需要調(diào)節(jié)DNA模板的濃度與退火溫度梯度，產(chǎn)生條帶的大小差異也很大，適合經(jīng)驗不足的操作人員辨認，整套工序利用基層檢測站點的PCR儀等設(shè)備就可以完成操作與識別。綜上所述，本套檢測方法非常適合基層檢測站點快速和高效地檢測大批量煙葉樣品，為后續(xù)的被侵染煙株的提早清除等病毒防控工作打下了基礎(chǔ)，積累的貴州煙區(qū)的數(shù)據(jù)也是我國花葉病研究的重要補充。