王曦悅 張秀艷 董馨 馬飛祥 劉杰 喬俊纏 薛培鳳*

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000

2.內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市蒙中醫(yī)院藥劑科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是由于多種原因引起的骨量丟失與降低、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加、骨密度(bone mineral density，BMD)下降從而導(dǎo)致患者易出現(xiàn)骨折的全身代謝性骨病[1-2]?；颊咦畛Ｒ姷呐R床表現(xiàn)為腰背疼痛或全身骨痛，通常在姿勢(shì)改變時(shí)及長(zhǎng)時(shí)間行走后出現(xiàn)，夜間或負(fù)重活動(dòng)時(shí)疼痛加重，有可能出現(xiàn)行動(dòng)受限，疼痛多為彌散性。其他臨床表現(xiàn)為骨折、脊柱變形等，嚴(yán)重者可能壓迫心肺，出現(xiàn)循環(huán)、呼吸系統(tǒng)的功能異常，且長(zhǎng)時(shí)間會(huì)對(duì)患者造成巨大心理負(fù)擔(dān)[3]。一些早期的OP患者沒有癥狀或只有疼痛，往往會(huì)被人忽視，等到病情加重時(shí)常常已經(jīng)發(fā)展到了較為嚴(yán)重的階段，所以O(shè)P又被稱為“寂靜的疾病”。目前OP的發(fā)病機(jī)制以及治療方法需要進(jìn)一步研究，建立骨質(zhì)疏松模型是進(jìn)行發(fā)病機(jī)制及治療藥物研究的必要條件，根據(jù)研究需要，應(yīng)盡可能選擇與人類相似度高、重復(fù)性好、經(jīng)濟(jì)有效的模型。斑馬魚(zebrafish)作為現(xiàn)今常用模式生物，在骨骼疾病研究中，以獨(dú)特的結(jié)構(gòu)與生理提供了靈活高效的動(dòng)物模型。本文擬對(duì)OP研究現(xiàn)狀及斑馬魚骨質(zhì)疏松模型建立方法和研究應(yīng)用進(jìn)行綜述，為相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 骨質(zhì)疏松癥的研究現(xiàn)狀

骨質(zhì)疏松癥可分為原發(fā)性、繼發(fā)性和特發(fā)性三大類[4]。不同類型的骨質(zhì)疏松有不同的病因，是多種因素共同作用的結(jié)果[5]。 OP的具體分類和病因?qū)W研究見表1。骨骼發(fā)育涉及多種關(guān)鍵的生物學(xué)途徑或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，全基因組關(guān)聯(lián)研究報(bào)道了60多個(gè)影響B(tài)MD的位點(diǎn),證實(shí)了BMD基因的多態(tài)性。由表1可看出OP涉及到其中多種關(guān)鍵的生物學(xué)途徑[11]，如Wnt信號(hào)通路、維生素D內(nèi)分泌途徑、雌激素內(nèi)分泌途徑、核因子κB受體活化因子-核因子κB受體活化因子配體-骨保護(hù)素(RANK-RNAKL-OPG)途徑等。

表1 骨質(zhì)疏松癥按病因分類及病因?qū)W研究進(jìn)展

2 斑馬魚骨質(zhì)疏松模型的建立

斑馬魚的骨骼由軟骨和硬骨兩種不同的組織組成,與其他脊椎動(dòng)物骨骼發(fā)育過程極其相似。軟骨由軟骨細(xì)胞形成,硬骨由成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)和破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)組成，間充質(zhì)細(xì)胞(mesenchymal cells，MSCs)是軟骨細(xì)胞和OB的共同起源，OC則起源于髓單核細(xì)胞系。斑馬魚的OB和OC都與哺乳動(dòng)物具有相似的功能。和高等脊椎動(dòng)物一樣，斑馬魚既有膜內(nèi)成骨，即顱骨的形成是由OB直接形成骨骼；也有軟骨內(nèi)骨化，是由OB和OC通過逐步替換軟骨模板的方式，從頭到尾的順序分體節(jié)在配卵后的2～3 d開始發(fā)育形成斑馬魚的脊椎骨骼[12-13]。

斑馬魚體型小，成熟周期短，繁殖效率高，其行為學(xué)特性易于觀察,可動(dòng)態(tài)觀察生命健康狀態(tài)和病理變化表觀特征。斑馬魚基因與人類基因相似率可達(dá)到 87%。斑馬魚模型在基因轉(zhuǎn)錄與敲除等方面可塑性也比較強(qiáng)[14-15]。傳統(tǒng)上，斑馬魚突變系是通過正向遺傳篩選產(chǎn)生的，使用誘變劑[例如乙基亞硝基脲(ENU)]在后代中誘導(dǎo)隨機(jī)點(diǎn)突變，然后篩選出感興趣的表型[16-17]?，F(xiàn)有的斑馬魚骨質(zhì)疏松模型的建立方法都是將斑馬魚培養(yǎng)在適宜濃度造模藥物的生活環(huán)境中，處理一段周期后，使斑馬魚的骨密度發(fā)生改變。誘導(dǎo)斑馬魚建立骨質(zhì)疏松癥模型的藥物見表2?，F(xiàn)有的斑馬魚骨質(zhì)疏松癥造模方法，使得斑馬魚骨質(zhì)疏松模型的應(yīng)用存在限制。

表2 斑馬魚骨質(zhì)疏松模型的建立方法

目前研究斑馬魚骨骼模型的最常用方法是通過經(jīng)典骨骼染色并在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。常用的化學(xué)染料有茜素紅(alizarin red)和鈣黃綠素(calcein)等。茜素紅染色為固定染色，通過與骨中的鈣結(jié)節(jié)引起的顯色現(xiàn)象來(lái)檢測(cè)魚的骨形態(tài)和BMD，毒性強(qiáng)具有特異性，用于斑馬魚硬骨染色,但實(shí)驗(yàn)前期步驟較多,耗時(shí)較長(zhǎng)。鈣黃綠素染色為活體染色，與骨骼中的鈣化離子結(jié)合，在熒光的照射下發(fā)出綠色熒光來(lái)顯示骨骼鈣化程度，熒光信號(hào)強(qiáng)、毒性弱、染色時(shí)間短,但無(wú)特異性，可以實(shí)時(shí)觀測(cè)胚胎骨所有時(shí)期的發(fā)育，需要注意染色過程要避光且要將染色液清洗干凈,防止對(duì)熒光信號(hào)產(chǎn)生影響[22]?；铙w熒光染色主要研究斑馬魚幼魚的骨骼鈣化及成魚尾鰭的再生等,而影像學(xué)技術(shù)也被用于斑馬魚骨骼的觀察，如X線檢測(cè)、顯微CT等，能夠更精準(zhǔn)的評(píng)價(jià)骨的質(zhì)量,更適用骨質(zhì)疏松癥的早期檢測(cè)[23]。

3 斑馬魚骨質(zhì)疏松模型的應(yīng)用

3.1 斑馬魚骨質(zhì)疏松模型在藥物活性篩選中的應(yīng)用

在斑馬魚骨質(zhì)疏松模型建立中常選野生型品系的斑馬魚，采用潑尼松龍或地塞米松造模，因其可以顯著抑制斑馬魚早期的骨骼發(fā)育形成[24]。徐宇等[25]分別用25、50、100 μg/mL 濃度的醋酸潑尼松龍?jiān)炷?通過死亡率及脊椎熒光染色的個(gè)數(shù)來(lái)確定潑尼松龍對(duì)斑馬魚的最佳造模濃度為25 μg/mL。斑馬魚模型能快速、動(dòng)態(tài)地觀察骨的早期發(fā)育，為大規(guī)模篩選抗骨質(zhì)疏松藥物提供可能。斑馬魚骨質(zhì)疏松模型抗骨質(zhì)疏松藥物活性成分的篩選見表3。

表3 斑馬魚骨質(zhì)疏松模型抗骨質(zhì)疏松藥物活性成分的篩選

3.2 斑馬魚骨質(zhì)疏松模型在藥物安全性中的應(yīng)用

斑馬魚骨質(zhì)疏松模型不僅可以快速篩選抗骨質(zhì)疏松藥物，也可同時(shí)檢測(cè)藥物毒性。凌潔等[30]用高效液相色譜分析捕獲補(bǔ)骨脂成分/組分聯(lián)合潑尼松龍誘導(dǎo)的斑馬魚骨質(zhì)疏松模型快速篩選抗骨質(zhì)疏松活性成分，并同時(shí)考察死亡率，確定補(bǔ)骨脂酚毒性較大，高劑量會(huì)達(dá)到100%死亡率。王茉等[31]提出形成斑馬魚代謝-效應(yīng)/毒性(M-Act /Tox) 一體化評(píng)價(jià)的新方法。葛靜等[32]基于斑馬魚代效毒一體化有效的評(píng)價(jià)箭葉淫羊藿的代謝、抗骨質(zhì)疏松效應(yīng)及毒性。實(shí)現(xiàn)化合物用量少(微克至毫克級(jí))、微板中快速進(jìn)行的兼顧體內(nèi)外有效成分和安全性的高效系統(tǒng)篩選，為抗骨質(zhì)疏松藥物篩選提供新的思路方法。

3.3 斑馬魚骨質(zhì)疏松模型在研究作用機(jī)制中的應(yīng)用

在斑馬魚骨質(zhì)疏松模型研究藥物抗骨質(zhì)疏松活性時(shí)，也可以聯(lián)合電感耦合等離子發(fā)射光譜串聯(lián)質(zhì)譜(inductively coupled plasma massspectrometry，ICP-MS)、實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)(quantitative real-time，qPCR)和分子對(duì)接技術(shù)等同時(shí)研究藥物作用機(jī)理，為藥物在人體的作用機(jī)制做出鋪墊。斑馬魚骨質(zhì)疏松模型在研究藥物等作用機(jī)制中的應(yīng)用見表4。

表4 斑馬魚骨質(zhì)疏松模型在藥物藥效機(jī)制研究方面的應(yīng)用

4 總結(jié)和展望

體外細(xì)胞藥物篩選模型可高通量、多指標(biāo)、多靶點(diǎn)同時(shí)檢測(cè),但是忽略了藥物在體內(nèi)ADME等生理過程,因此篩選出的一些有效成分具有活性低、毒性高、生物利用度低等缺點(diǎn)。目前用于高通量藥物篩選的果蠅和線蟲模型可以滿足高通量、多靶點(diǎn)篩選,但不能反映脊椎動(dòng)物的體內(nèi)藥效過程。斑馬魚具有與人體相關(guān)性高、可以活體實(shí)驗(yàn)、樣品用量少、篩選快、準(zhǔn)確率高等優(yōu)勢(shì),在藥物活性成分或天然產(chǎn)物化合物的篩選等方面都有顯著優(yōu)勢(shì)。但斑馬魚骨質(zhì)疏松模型仍存在一定局限性：斑馬魚不是哺乳動(dòng)物，體內(nèi)臟器病理變化與哺乳動(dòng)物有區(qū)別；斑馬魚軀體小，除骨染色觀察、其他檢測(cè)方法難以進(jìn)行等?？傮w而言，對(duì)于骨質(zhì)疏松癥及相關(guān)疾病的研究，斑馬魚模型仍然是最佳選擇，具有廣闊的研究市場(chǎng)。