水通道蛋白3在大鼠結(jié)腸黏膜中的表達(dá)

劉耀文　曾玉娟　瞿丹　粟慧敏　陳行　徐賽群

摘要：目的：探討水通道蛋白3（aquaporins，AQP3） 在大鼠結(jié)腸黏膜中的表達(dá)。方法：挑選10只Sprague-Dawley（SD） 大鼠，體重（200±50） g，雌雄各半，并將動(dòng)物麻醉處死后取近端結(jié)腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸組織，用冰PBS溶液沖洗干凈后分成三部分，一部分置于凍存管中-70℃保存用于提取RNA，一部分置于凍存管中-70℃保存用于提取蛋白，剩余的組織放入4 %多聚甲醛中進(jìn)行固定，石蠟包埋后制備組織切片（厚度4 ?m） 。結(jié)果：RT-PCR結(jié)果表明在近端結(jié)腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸有豐富的AQP3 mRNA表達(dá)，且遠(yuǎn)端結(jié)腸AQP3 mRNA表達(dá)明顯高于近端結(jié)腸AQP3 mRNA表達(dá);Westernblot來(lái)檢測(cè)大鼠結(jié)腸AQP3蛋白的表達(dá)，AQP3的光密度值除以β-Actin的光密度值用以做標(biāo)準(zhǔn)化。結(jié)果顯示近端結(jié)腸有兩條AQP3條帶：一條位于27 kDa，代表未糖基化的AQP3;另一條位于30-40 kDa，代表糖基化的AQP3。而遠(yuǎn)端結(jié)腸僅有一條位于30-40 kDa的糖基化的AQP3條帶。定量結(jié)果顯示近端結(jié)腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸有豐富的AQP3表達(dá);免疫組化來(lái)檢測(cè)大鼠消化系統(tǒng)AQP3的定位。在大鼠結(jié)腸中AQP3主要表達(dá)單層柱狀上皮;且在近端結(jié)腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸，AQP3常表達(dá)于表面吸收上皮細(xì)胞的基底側(cè)膜上和腸隱窩的頸部。結(jié)論：AQP3表達(dá)于單層柱狀上皮細(xì)胞（近端結(jié)腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸） 的基底側(cè)膜上。

關(guān)鍵詞：AQP3;AQP3 mRNA;結(jié)腸黏膜

水通道蛋白（aquaporins，AQPs） 是一類(lèi)存在于細(xì)胞膜的小分子蛋白，在動(dòng)植物體內(nèi)廣泛表達(dá)。AQP3廣泛表達(dá)于消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和皮膚系統(tǒng)的上皮組織中。AQP3陰性的小鼠中角質(zhì)層水合作用減少，皮膚的彈性降低。消化系統(tǒng)中也可能有類(lèi)似的作用[1]。另一個(gè)可能作用是指向固有層的跨上皮液體流動(dòng)，作為小腸中水吸收的機(jī)制。AQP3基因敲除小鼠存在腸上皮細(xì)胞增殖受損和單核細(xì)胞功能存在缺陷，提示AQP3不僅在感染和炎癥狀態(tài)下對(duì)免疫功能有著重要的調(diào)節(jié)作用，而且對(duì)腸上皮細(xì)胞增殖起重要的作用[2]。因此，本文采取real-time PCR、westernblot和免疫組化實(shí)驗(yàn)來(lái)系統(tǒng)性的驗(yàn)證AQP3在正常結(jié)腸中的表達(dá)量。現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境

10只Sprague-Dawley（SD） 大鼠，體重（200±50） g，雌雄各半。飼養(yǎng)于長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)室相對(duì)濕度保持在40 %～60 %，實(shí)驗(yàn)大鼠統(tǒng)一置于22～25℃的溫度下進(jìn)行飼養(yǎng)，光照充足，安靜衛(wèi)生，通風(fēng)良好。10只大鼠單籠飼養(yǎng)，飼料充足，實(shí)驗(yàn)大鼠可自由攝取清潔飲水，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵守《湖南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2 主要藥品與試劑

AQP3抗體（兔抗大鼠） 、PCR試劑盒、二步法免疫組化檢測(cè)試劑。智能水分測(cè)定儀TMP-300 S，石蠟切片機(jī)LEICA CM1850，光學(xué)顯微鏡CX31，LightCycler96熒光定量PCR儀（顯微照相機(jī)BX-50） ，電子分析天平METTLER-AB304-S。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集

動(dòng)物麻醉處死后取近端結(jié)腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸組織，用冰PBS溶液沖洗干凈后分成三部分，一部分置于凍存管中-70℃保存用于提取RNA，一部分置于凍存管中-70℃保存用于提取蛋白，剩余的組織放入4 %多聚甲醛中進(jìn)行固定，石蠟包埋后制備組織切片（厚度4 ?m） 。

1.3.2 RT-PCR檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織AQP3的表達(dá)

首先將組織石蠟切片脫臘，3 %H2 O2室溫孵30 min，然后PBS沖洗，滴加10 %正常山羊血清封閉液37℃孵育30 min;加入一抗兔抗大鼠抗體（1：100稀釋?zhuān)?孵育，PBS沖洗，滴加二抗山羊抗兔IgG孵育，PBS沖洗，滴加試劑辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP） 孵育，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。陰性對(duì)照：一抗用PBS代替。陽(yáng)性細(xì)胞胞漿呈棕褐色。結(jié)果判定：染色指數(shù)=染色強(qiáng)度積分×染色面積比。染色強(qiáng)度積分，按顯色強(qiáng)弱記錄為：陰性0分，弱陽(yáng)性1分，陽(yáng)性2分，強(qiáng)陽(yáng)性3分。染色面積比為腺體中染色細(xì)胞數(shù)占總體細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.3.3 Westernblot檢測(cè)結(jié)腸AQP3蛋白的表達(dá)

取大鼠結(jié)腸組織分別放于玻璃勻漿器中，按照1：10加入裂解液，0℃下進(jìn)行勻漿，4℃裂解30 min，4℃12000 r/min離心30 min，取上清液備用。BCA法測(cè)定蛋白含量后上樣（蛋白濃度每孔50 ug） ，每孔20 uL，加入緩沖液，100℃下水浴5 min使蛋白充分變性。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） ，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF） 膜上。5 %脫脂牛奶封閉后，加入一抗（AQP3，1∶300） ，4℃過(guò)夜，TBST洗膜3次，10分鐘/次，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，TBST洗膜3次，10分鐘/次，ECL試劑與膜作用后，Bio-Rad公司圖像攝取系統(tǒng)曝光，采集圖像并進(jìn)行分析。計(jì)算AQP3與tubulin產(chǎn)物A積分的比值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 結(jié)腸組織AQP3 mRNA表達(dá)

將結(jié)腸標(biāo)本放入液氮預(yù)冷的研缽中研磨，按照常規(guī)方法提取總RNA，然后用RT-PCR方法測(cè)定各組大鼠結(jié)腸組織AQP3基因的mRNA，進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。

RT-PCR引物序列：AQP3上游引物：5'-TGGTGGCTTCCTCACCATCAA-3'，下游引物：5'-AGAGCCCAAAAACAATCCCAGC-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為209 bp;β-actina上游引物：5'-ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG-3'，下游引物：5'-TGTATGCCTCTGGTCGTACCAC-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為592 bp。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 23.0軟件對(duì)臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用（%） 表示，行χ²檢驗(yàn);計(jì)量資料用（x±s） 表示，行t檢驗(yàn)。P < 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠結(jié)腸AQP3 mRNA的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果表明在近端結(jié)腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸有豐富的AQP3 mRNA表達(dá)，且遠(yuǎn)端結(jié)腸AQP3 mRNA表達(dá)明顯高于近端結(jié)腸AQP3 mRNA表達(dá)。

2.2 大鼠結(jié)腸AQP3蛋白的表達(dá)

采用Westernblot來(lái)檢測(cè)大鼠結(jié)腸AQP3蛋白的表達(dá)，AQP3的光密度值除以β-Actin的光密度值用以做標(biāo)準(zhǔn)化。結(jié)果顯示近端結(jié)腸有兩條AQP3條帶：一條位于27 kDa，代表未糖基化的AQP3;另一條位于30-40 kDa，代表糖基化的AQP3。而遠(yuǎn)端結(jié)腸僅有一條位于30-40 kDa的糖基化的AQP3條帶。定量結(jié)果顯示近端結(jié)腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸有豐富的AQP3表達(dá)。

2.3 大鼠結(jié)腸AQP3免疫組化染色

采用免疫組化來(lái)檢測(cè)大鼠消化系統(tǒng)AQP3的定位。在大鼠結(jié)腸中AQP3主要表達(dá)單層柱狀上皮;且在近端結(jié)腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸，AQP3常表達(dá)于表面吸收上皮細(xì)胞的基底側(cè)膜上和腸隱窩的頸部。具體見(jiàn)下圖。

3 討論

Agre研究發(fā)現(xiàn)，水通道蛋白（Aquaporin，AQP） 廣泛分布在哺乳動(dòng)物和植物細(xì)胞膜上，是一組與水通道有關(guān)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是影響水的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境平衡調(diào)節(jié)的主要蛋白，并因此獲2003年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。迄今為止已從哺乳動(dòng)物中鑒定并克隆了11種水通道蛋白（AQP0-AQP10） [3]。水通道蛋白是一類(lèi)相對(duì)分子量為20～30 kD左右膜蛋白的大家族，每一種水通道蛋白均含6個(gè)跨膜區(qū)及細(xì)胞內(nèi)氨基和羧基末端的蛋白質(zhì)。Verkman成功建立了AQP1、3、4、5基因敲除鼠模型，系統(tǒng)研究AQP對(duì)腎臟濃縮功能的影響，對(duì)肺水腫和腦水腫等的影響。國(guó)內(nèi)學(xué)者已做了類(lèi)似的研究，但至今未見(jiàn)AQP對(duì)腹瀉病影響的研究報(bào)道，特別是有關(guān)AQP3對(duì)腹瀉病的相關(guān)研究，國(guó)內(nèi)外更未見(jiàn)報(bào)道。

AQP3從腎臟中分離獲得，定位于腎集合管主細(xì)胞的基底膜上，和頂端膜上的AQP2共同參與對(duì)水的重吸收[4]。AQP3的表達(dá)通過(guò)高滲和高張而上調(diào)，其是水甘油通道蛋白的一員，允許水、尿素和甘油的通過(guò)。我們檢測(cè)了AQP3在大鼠結(jié)腸的免疫組化定位。AQP3表達(dá)于單層上皮細(xì)胞。AQP3可能的作用就是為上皮細(xì)胞補(bǔ)充水分，為這些上皮細(xì)胞面臨惡劣的環(huán)境等。

參考文獻(xiàn)

[1]張靜霞，黎兆軍.AQP3在皮膚病發(fā)病機(jī)制中的作用研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2013，19（17）：3.

[2]張迪，蘇維恒，趙元，等.水通道蛋白AQP3缺失對(duì)小鼠坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)的影響[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2017，53（10）：4.

[3]張玉婷，張琪，郭抗抗，等.水通道蛋白在動(dòng)物疾病發(fā)生過(guò)程中的作用研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2021，42（3）：4.

[4]張冬梅，許鐘鎬，辛麗，等.AQP1、AQP2和AQP3在腎小球疾病腎組織中的表達(dá)及其意義[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，2009，25（1）：3.