袁 婷，秦利軍，趙德剛，2

（1.貴州大學 生命科學學院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，貴州 貴陽 550025；2.山地植物資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550006）

杜仲Eucommia ulmoidesOliv.是我國特有的古生且分布較廣的藥用樹種和重要的膠源樹種，具有較高的經(jīng)濟價值，杜仲在我國的種植面積為天然橡膠樹Hevea brasiliensis的數(shù)倍[1-3]。杜仲葉片、樹皮和翅果中均含有一種特殊物質(zhì)，外力作用下會出現(xiàn)一種白色絲狀物，該物質(zhì)即為杜仲膠（Eucommiarubber，EuR），不同組織中含膠量不同，葉片中含膠量為3%～5%，樹皮中為6%～10%，而翅果中為12%～18%[4-7]。分子結(jié)構(gòu)測定表明，杜仲膠為反式聚異戊二烯（trans-polyisoprene），與天然橡膠（Natural rubber，NR）（順式聚異戊二烯，cis-polyisoprene）互為同分異構(gòu)體[8]。兩者結(jié)構(gòu)的微觀差異引起宏觀性能的不同，杜仲膠屬于硬橡膠（Hard rubber）具橡塑二重性，而天然橡膠屬于軟橡膠（Soft rubber）具高彈性[9-11]，與三葉橡膠樹的天然橡膠相比，杜仲膠常溫下結(jié)晶，具有耐疲勞性能、粘接性能、物理機械性能等優(yōu)點[12]，杜仲膠的優(yōu)良特性決定了其在綠色輪胎、醫(yī)療器械和海底電纜等領(lǐng)域的潛在應(yīng)用前景[13-15]。盡管杜仲樹皮中的杜仲膠含量僅次于杜仲翅果，但由于樹皮采割量有限和新皮生長周期長等缺點，極大限制了杜仲皮作為杜仲膠規(guī)模化提取的原材料。與杜仲皮相比，杜仲翅果因收獲周期短、含膠量高及再生性能好等特點，可被用作杜仲膠提取的理想材料[16]。不同于天然橡膠，杜仲膠在杜仲植株中分布于特化的含膠細胞中，因為杜仲含膠細胞中杜仲膠的含量比較低并且黏度高，因此杜仲膠不能像天然橡膠一樣通過割膠直接收集，所以通常需采用物理、化學或生物等方法，如強酸堿或使用生物酶處理破碎植物器官和組織獲得杜仲粗膠后，才能實現(xiàn)杜仲膠的有效提取和分離[12,15,17-21]。這些方法中大多以強機械力、強化學作用等引起植物組織破裂，從而分離出杜仲膠，而這樣的處理也勢必會引起杜仲膠分子結(jié)構(gòu)和聚合度的改變，從而改變杜仲膠的性能[22]。

本研究采用堿浸提法、苯-CH3OH 法和酶水解法對杜仲翅果皮中杜仲膠進行提取，分析不同提取方法對杜仲精膠提取率的影響；同時，對不同方法提取的杜仲膠的熱穩(wěn)定性進行分析，探討3 種提取法對膠性能的影響，以期為優(yōu)化杜仲膠的提取工藝、實現(xiàn)杜仲膠的規(guī)?；a(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑

杜仲翅果為2019年7月采自貴州大學實驗農(nóng)場杜仲資源圃中樹齡為15 a 的新鮮翅果。收集的翅果置于烘箱中，經(jīng)120℃殺青30 min 后90℃下烘干至恒質(zhì)量，依次經(jīng)去種留殼、粉碎、過篩（100目）處理得到翅果皮干粉樣備用。氫氧化鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉均購于天津科密歐化學試劑有限公司；石油醚、苯、甲醇、乙醚和無水乙醇均購于天津科密歐化學試劑有限公司，均為分析純；纖維素酶購于和氏璧生物科技有限公司。

索氏提取器，SC 100 恒溫金屬水浴鍋（Thermo），SXKW 數(shù)顯控溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），TP-213 電子天平（北京丹佛儀器有限公司），DHG-9070A 電熱鼓風干燥箱等儀器（上海一恒科學儀器有限公司），F(xiàn)E 20/EL 20 pH 計（上海梅特勒-托利多儀器有限公司），92/262 系列（Haier 醫(yī)用低溫保存箱），F(xiàn)Z 102 微型植物粉碎機（上海諾萱科學有限公司），STA 449F3 同步熱分析儀（德國布魯克公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 堿浸提法

參照歐陽輝等[23]、吳可心等[24]和龔兆全等[25]的方法略做改動，準確稱量杜仲果皮干粉8.00 g，加入100 mL 10%的NaOH 溶液，90℃下對杜仲果皮進行預處理3 h 后過濾，濾渣用蒸餾水沖洗至pH 為7.0，然后置于50℃烘箱中烘至恒質(zhì)量得杜仲粗膠。以石油醚作為溶劑在90℃下回流提取26 h，將提取液置于-20℃低溫冷凍3 h，待杜仲膠析出后除去（自然揮發(fā)）或回收石油醚（離心收集），將提取的杜仲精膠置于37℃烘箱中烘干。每組設(shè)3 個重復。

1.2.2 苯-CH3OH 提取法

參照陸志科等[17]的方法略做改動，準確稱量杜仲果皮干粉8.00 g，置于索氏提取器中用苯進行浸提26 h，提取液中加入1.5 倍量的CH3OH 沉淀2 h，棄去沉淀液、干燥沉淀物即得杜仲粗膠，再用乙醚溶解，所得白色沉淀物置于37℃烘箱中烘干即為杜仲精膠。每組設(shè)3 個重復。

1.2.3 酶水解提取法

參照張學俊等[26]和賀揚潔等[27]的方法略做改動，準確稱量杜仲果皮干粉8.00 g。加入濃度為5%的NaOH 溶液100 mL，于37℃水浴中對杜仲果皮進行預處理6 h 后過濾，將濾渣用蒸餾水沖洗至pH 為7.0 后，置于50℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量得杜仲粗膠，加入100 mL 預配置的0.1 g/L 纖維素酶溶液（pH 4.0），放入45℃恒溫箱中處理27 h，取出、過濾、烘干后用石油醚作為溶劑在90℃下回流提取26 h，將提取液置于-20℃低溫冷凍3 h后析出白色沉淀，棄去石油醚，將白色沉淀置于37℃烘箱中烘干，烘干物即為杜仲精膠。每組設(shè)3個重復。

1.2.4 杜仲膠產(chǎn)率

粗膠產(chǎn)率=預處理所得杜仲膠干質(zhì)量/樣品總干質(zhì)量×100%；

精膠產(chǎn)率=精提所得杜仲膠干質(zhì)量/樣品總干質(zhì)量×100%。

1.2.5 杜仲膠熱穩(wěn)定性測定

參照Sarina 等[28]、弓銘等[29]和牟悅興等[30]略做修改，準確稱取10 mg 以3 種方法提取的杜仲精膠，樣品經(jīng)室溫至700℃變溫熱分解后，用STA449F3 對杜仲膠的熱穩(wěn)定性進行分析。升溫速率為10℃/min，以N2作為保護氣體。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0 軟件對杜仲膠提取率進行單因素方差分析，用LSD 法及Duncan 法進行多重比較及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取法對杜仲膠形態(tài)的影響

不同提取方法所得杜仲膠形態(tài)上存在一定差異。堿浸提法所得杜仲膠整體色澤偏淺黃色，形態(tài)結(jié)構(gòu)致密、呈薄塊（片）狀，膠塊延展性一般（圖1A）；苯-CH3OH 法所得杜仲膠整體顏色偏暗綠色，形態(tài)結(jié)構(gòu)松散，呈凝集的團狀，膠塊較松軟且有一定較粘稠性（圖1B）；而酶水解法提取的杜仲膠，整體色澤偏蠟黃色，結(jié)構(gòu)緊湊致密、呈厚塊（片）狀，膠塊的延展性較好（圖1C）。

2.2 不同提取法對杜仲粗膠得率的影響

苯-CH3OH 法通過將杜仲膠及非極性物質(zhì)溶解于苯中溶解粗膠，而堿浸提法和酶水解法主要通過堿液去除角質(zhì)及極性物質(zhì)獲得粗膠。因此，不同提取方法所得杜仲粗膠得率有一定差異。酶水解法、堿浸提法和苯-CH3OH 法的提取的杜仲粗膠產(chǎn)率分別為56.33%、33.29%和9.94%，說明以酶水解法處理所得粗膠中雜質(zhì)含量較高，而苯-CH3OH 法所得粗膠雜質(zhì)最低。

2.3 不同提取方法對杜仲精膠得率的影響

3 種提取法對杜仲精膠得率有一定影響。其中，酶水解法的提取率最高，為5.36%，苯-CH3OH法次之，為4.56%，以堿浸提法的提取率最低，僅為1.85%。另外，酶解法提取后所剩的植物殘渣結(jié)構(gòu)松散、無粘稠狀，也暗示該方法能有效地將植物細胞壁降解，更好地釋放細胞內(nèi)中橡膠分子。

表2 不同提取方法對杜仲精膠產(chǎn)率的影響Table 2 Effects of different extraction methods on the yield of extracted Eucommia rubber (Mean ± SE)

2.4 不同溫度處理對杜仲膠熱力學性能的影響

差示掃描量熱法（Differential scanning calorimetry，DSC）和熱重法（Thermogravimetry，TG）曲線分析杜仲膠熱力學性能表明，發(fā)現(xiàn)3 種方法提取的杜仲膠在質(zhì)量損失5%、30%和50%時的溫度（分別記為T5%、T30%和T50%）有一定差異，但不顯著（表3）。在溫度小于300℃的低溫區(qū)，杜仲膠質(zhì)量損失微小，推測這主要是由于杜仲膠樣品吸附的水分的解吸附造成的；杜仲膠質(zhì)量損失主要發(fā)生在300～470℃范圍內(nèi)（圖2），在此溫度范圍內(nèi)苯-CH3OH 法所提取的杜仲膠質(zhì)量損失占總損失的95.05%，而堿浸提法和酶解法所得杜仲膠質(zhì)量損失分別占總損失的97.33%和97.90%。說明杜仲膠在300～470℃范圍內(nèi)熱穩(wěn)定較差，相比較3 種方法，苯-CH3OH 法提取的杜仲膠損失率較其它兩種方法略低。另外，盡管在杜仲膠分解率為5%時，苯-CH3OH 法所得的杜仲膠的熱分解溫度較堿提法和酶解法的低，但在其分解率為30%和50%時，熱分解溫度都比后兩者高。綜上，3 種提取法所得杜仲膠的熱穩(wěn)定性能差異不顯著。通過研究堿浸提、苯-CH3OH 法和酶水解法3 種方法提取杜仲膠的結(jié)晶吸熱曲線（圖3）發(fā)現(xiàn)杜仲膠的吸熱熔融峰只由一個峰型組成，表明用這3 種方法提取的杜仲膠只由1 種結(jié)晶晶型組成，推測為α晶型，且3 種方法所得杜仲膠該晶型的熔點分別為70.99℃、67.40℃和69.39℃。通過對比DSC 的吸熱光譜圖發(fā)現(xiàn)，酶水解法所提取的杜仲膠的結(jié)晶熱焓比另外2 種方法提取的略高。

表3 不同熱失重率時杜仲膠的熱分解溫度Table 3 Decomposition temperature of Eucommia rubber at different thermo-gravimetric rates ℃

圖2 不同提取所得杜仲膠TG 曲線分析Fig.2 TG curve of Eucommia rubber with different extraction methods

圖3 不同提取所得杜仲膠DSC 曲線分析Fig.3 DSC curve of Eucommia rubber with different extraction methods

3 結(jié)論與討論

杜仲E.ulmoidesOliv.為杜仲科Eucommiaceae杜仲屬Eucommia雌雄異株的多年生落葉喬木[31]，杜仲葉片、果皮、樹皮及根皮中均含杜仲膠，杜仲膠又稱古塔波膠（gutta-percha），是杜仲次生代謝合成的一種重要天然高分子化合物[32]，具有較為廣泛的應(yīng)用價值。本研究以3 種不同方法對杜仲翅果皮中杜仲膠進行提取，其得率存在一定差異。堿浸提法和酶水解法均采用NaOH 進行前期處理獲得杜仲粗膠，比較杜仲粗膠得率發(fā)現(xiàn)，以NaOH 預處理杜仲翅果皮樣品最佳的提取條件為10% NaOH 溶液90℃處理3 h，粗膠得率為33.29%，說明在該條件下大量的極性可溶物質(zhì)被強堿所分解，而保留了杜仲膠等非極性物質(zhì)，該結(jié)果與陸志科等[17]的實驗結(jié)果一致。由此推測，隨著溫度和堿液濃度的升高，纖維素、木質(zhì)素分解速度加快，樹脂成分的皂化速度也加快，即升高溫度和堿液濃度有利于翅果殼中的非膠成分分解。另外，3 種提取法中以酶水解法所得粗膠產(chǎn)率和精膠產(chǎn)率都最高，分別為56.33%和5.36%，表明低濃度堿處理結(jié)合溫和的酶處理不僅能保留大量的膠組分和雜質(zhì)組分（杜仲粗膠），還能使雜質(zhì)組分在后續(xù)提膠過程中迅速去除，進而實現(xiàn)杜仲精膠的高提取率。盡管酶解法所得杜仲精膠得率較高，但與歐陽輝等[23]以相同方法提取杜仲翅果皮中杜仲膠相比，提取率有一定程度下降，推測造成此現(xiàn)象的原因可能是選用的翅果齡期不同導致的差異，一方面不同月份翅果中膠含量有一定差異[33]，另一方面本實驗采用的翅果皮干樣過篩（100 目）后引起了杜仲膠組分的喪失，進而導致較低的杜仲膠提取率。

杜仲膠具有優(yōu)良的耐熱性，為了研究這3 種提取法對杜仲膠耐熱性能的影響，對杜仲膠熱力學分析發(fā)現(xiàn)，苯-CH3OH 法所提取的杜仲膠在T30%和T50%熱分解溫度比其余2 種方法所提杜仲膠略高，但差異不顯著；另外，一般認為杜仲膠至少存在兩種確定的晶型，即α 晶型和β 晶型，前者適于在高溫形成，后者則適于在低溫下形成。通過對比張?zhí)祧蝃34]和劉奇等[13]的研究結(jié)果，本研究中3 種方法所得杜仲膠的DSC 曲線只含有一個吸熱熔融峰，熔解溫度在70℃左右，暗示這些方法所得杜仲膠均為高溫形成晶型，即α 晶型。推測造成此現(xiàn)象的原因可能是杜仲植株間品種或提取方法本身的差異導致了杜仲膠的晶型種類和熔解溫度的不同。通過對比DSC 曲線的吸熱光譜圖發(fā)現(xiàn)，酶水解法所提取的杜仲膠的結(jié)晶熱焓比另外2 種方法提取的略高，說明該法所提取的杜仲膠分子結(jié)構(gòu)相似度更高、結(jié)晶度更好。因此，在杜仲膠提取的實際生產(chǎn)中可考慮使用苯-CH3OH法和酶水解法。2 種方法相比較，后者不僅可滿足杜仲膠得率高、雜質(zhì)少且所得杜仲膠分子結(jié)構(gòu)一致、結(jié)晶度高，而且所使用的試劑溫和對植物材料破壞小且對人體危害小。

本研究采用不同提取方法對杜仲翅果皮中的杜仲膠進行提取，其中以酶水解法提取杜仲膠得率最高。進一步通過對所提取的杜仲膠進行性能分析，3 種方法提取所得杜仲膠的耐酸堿性和熱穩(wěn)定性均無顯著差異，但對杜仲膠的結(jié)晶度有一定影響，以酶水解法提取的杜仲膠得率較高且結(jié)晶度也最好。目前，本研究僅在實驗室開展杜仲膠提取比較實驗，因此如果將該法用于杜仲膠規(guī)模化提取，還需進一步摸索酶解提取法的提取工藝參數(shù)，以為實現(xiàn)杜仲膠的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。