雷嗣超，張家音，趙泓濤，李浩楠，楊 芳

（武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北武漢 430205）

板栗是我國(guó)傳統(tǒng)的農(nóng)副產(chǎn)品，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。截至2017 年，我國(guó)板栗總種植面積達(dá)180萬(wàn)hm2，年產(chǎn)量200 萬(wàn)t，占世界板栗總產(chǎn)量的84%[1]。目前，板栗加工以果肉為主，其他加工副產(chǎn)物往往被浪費(fèi)，未得到充分利用[2]。研究表明，板栗的花、樹(shù)葉、皮和果實(shí)提取物中均含有大量的多酚類(lèi)物質(zhì)，而板栗皮中多酚含量最多。板栗皮包括板栗內(nèi)皮（也稱(chēng)為板栗囊衣）和板栗外皮（也稱(chēng)為板栗殼）。在板栗皮中的多酚物質(zhì)中，兒茶素類(lèi)物質(zhì)屬于類(lèi)黃酮化合物中的黃烷-3-醇類(lèi)[3]，具有酚類(lèi)化合物的共同特性，如抗菌[4]、抗氧化[5]、抗動(dòng)脈硬化[6]、抗血栓形成[7]以及抗腫瘤等作用[8]。因此，兒茶素類(lèi)化合物被廣泛應(yīng)用于功能性食品開(kāi)發(fā)[9]、食品保鮮[10-12]以及食品護(hù)色等領(lǐng)域。研究表明，兒茶素類(lèi)物質(zhì)因其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，易受外界環(huán)境的影響而使其生物利用率降低[13]，影響其在食品行業(yè)的應(yīng)用[14]。

目前對(duì)板栗皮多酚物質(zhì)的研究主要集中在提取工藝優(yōu)化、抗氧化性以及抑菌活性等方面，但是，對(duì)于板栗皮兒茶素類(lèi)物質(zhì)的研究較少，而關(guān)于其在人體胃腸消化道內(nèi)消化情況的研究則更為少見(jiàn)。因此，本試驗(yàn)采用基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）的廣泛靶向代謝組學(xué)研究板栗皮兒茶素類(lèi)物質(zhì)在口腔、胃腸道模擬消化體系中的組成變化，為板栗皮兒茶素類(lèi)物質(zhì)在功能性食品開(kāi)發(fā)方面的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

板栗，產(chǎn)自山東省沂蒙山。

乙醇、甲醇、乙腈、乙酸，德國(guó)墨客公司；α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、膽汁提取物，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

THZ-100 恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FW80 型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司；RE-2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；LGJ-10 普通實(shí)驗(yàn)型真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；MM 400 研磨儀，Retsch 公司；超高效Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A 液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC），島津公司；Applied Biosystems 6500 Q TRAP 串聯(lián)質(zhì)譜（tandem mass spectrometry，MS/MS），島津公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)處理

將板栗皮樣品分為4 組進(jìn)行代謝研究，每組樣品進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，4 組樣品分別為“消化前的板栗外皮提取物（chestnut shell extract，CSE）”、“消化前的板栗內(nèi)皮提取物（chestnut pellicle extract，CPE）”、“消化后的板栗外皮提取物（digested chestnut shell extract，DCSE）”、“消化后的板栗內(nèi)皮提取物（digestedchestnut pellicle extract，DCPE）”。

1.3.2 板栗皮粗提物的制備

將板栗皮除雜后用水清洗，采用自然干燥（室溫）和干燥箱干燥（45～50 ℃）結(jié)合的方式將板栗皮中的水分烘干。干燥后，用粉碎機(jī)將板栗皮進(jìn)行多次粉碎，過(guò)40 目篩，以分離板栗內(nèi)皮與板栗外皮。分別稱(chēng)取一定量粉碎后的板栗內(nèi)皮和外皮，參考蘇云霞等[15]方法進(jìn)行提取，料液比為1∶15（板栗殼粉末∶70%的乙醇溶液，g/mL），乙醇水溶液體積分?jǐn)?shù)為70%，恒溫培養(yǎng)搖床溫度55 ℃，振蕩時(shí)間90 min，冷卻后對(duì)溶液進(jìn)行真空抽濾，再將濾液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去其中的乙醇和部分水，而后對(duì)剩余溶液進(jìn)行冷凍干燥，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 體外模擬消化系統(tǒng)的構(gòu)建

（1）體外模擬口腔消化

在50 mL 錐形瓶中依次加入板栗皮粗提物0.2 g、α-淀粉酶0.4 mL 和9 mg/mL 氯化鈉溶液3.6 mL，將錐形瓶放入搖床中（250 r/min、37 ℃）震蕩反應(yīng)3 min[16]。

（2）體外模擬胃消化

人工胃消化液配制：將0.4 g 胃蛋白酶溶于90 mL、9 mg/mL 的NaCl 溶液中，用1 mol/L 的HCl 溶液調(diào)節(jié)pH至2～2.3[17]。

模擬胃消化試驗(yàn)：向上述經(jīng)過(guò)模擬口腔消化的消化液樣品中加入16 mL 胃消化液，在37 ℃水浴中震蕩（250 r/min）2 h 后，滴加1 mol/L NaOH 溶液至pH 為7，終止模擬胃消化反應(yīng)。

（3）體外模擬小腸消化

人工腸消化液配制：取225 mg 胰蛋白酶和225 mg膽汁提取物溶于90mL、9mg/mL 的NaCl 溶液中，用1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至7～7.2[18]。

模擬腸消化試驗(yàn)：向上述經(jīng)過(guò)模擬胃消化的消化液樣品中加入20 mL 腸道消化液，反應(yīng)2 h 后，得到樣品腸消化液。

1.3.4 板栗皮樣品前處理

將胃消化和腸消化后的板栗內(nèi)皮及外皮粗提物樣品分別進(jìn)行真空冷凍干燥，而后加入研磨儀（30 Hz）中研磨1.5 min，稱(chēng)取100 mg 樣品粉末，溶解于1.0 mL、70%的甲醇水溶液中，將溶解后的樣品放在4 ℃冰箱中過(guò)夜，并在放置過(guò)程中渦旋3 次，提高提取率。離心10min（10000g離心力下），吸取上清液，用微孔濾膜（0.22 μm 孔徑）過(guò)濾樣品，將過(guò)濾后的樣品保存在進(jìn)樣瓶中，用于LC-MS/MS 分析。

1.3.5 液相色譜儀分析條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）。流動(dòng)相：A 為0.04%乙酸水溶液，B 相為乙腈（含0.04%的乙酸）。流速：0.4 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

洗脫梯度：洗脫劑由（A）含有0.04%乙酸的水和(B)含有0.04%乙酸的乙腈組成，洗脫程序設(shè)置為二元梯度，具體如下：0～11.0 min，5%（A）；11.0～12.0 min，5%（A）；12.0～12.1 min，從5%～95%（A）；12.1～15.0 min，95%（A）。流速設(shè)定為0.40 mL/min。流出物交替連接到電噴霧三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜。

1.3.6 質(zhì)譜分析條件

質(zhì)譜參數(shù)如下：電噴霧離子源溫度為500 ℃，噴霧電壓為5 500 V，離子源簾氣為25 psi。儀器調(diào)優(yōu)和質(zhì)量校準(zhǔn)分別在QQQ 和LIT 模式下在10 μmol/L 和100 μmol/L聚丙二醇溶液中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)使用的碰撞氣體（氮?dú)猓┰O(shè)置為5 psi，進(jìn)行多個(gè)反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）實(shí)驗(yàn)得到QQQ 掃描。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

樣品進(jìn)入超高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜得到一系列代謝物質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)，通過(guò)軟件Analyst 1.6.3 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，根據(jù)代謝物保留時(shí)間與峰型的信息，對(duì)每個(gè)代謝物在不同樣本中檢測(cè)到的質(zhì)譜峰進(jìn)行校正，以確保定性定量的準(zhǔn)確。校正后數(shù)據(jù)顯示若合格，則采用Statistix 9 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和Duncan 多重比較分析，并采用SIMCA 軟件進(jìn)行無(wú)監(jiān)督模式識(shí)別的主成分分析（principal component analysis，PCA），而后對(duì)代謝物含量數(shù)據(jù)進(jìn)行Zsore 值歸一化處理，通過(guò)Tbtools 軟件繪制聚類(lèi)熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本質(zhì)控分析

質(zhì)控樣本（QC）由樣本提取物混合制備而成，通過(guò)對(duì)不同質(zhì)控QC 樣本質(zhì)譜檢測(cè)分析的總離子流圖（TIC 圖）進(jìn)行重疊展示分析，可以判斷代謝物提取和檢測(cè)的重復(fù)性。QC 樣本質(zhì)譜檢測(cè)總離子流圖見(jiàn)圖1。

圖1 QC 樣本質(zhì)譜檢測(cè)總離子流圖（TIC 圖）的疊加圖Fig.1 Overlay diagram of TIC diagram detected by mass spectrometry of QC sample

由圖1 可以看出，代謝物檢測(cè)總離子流的曲線重疊性高，即保留時(shí)間和峰強(qiáng)度均一致，表明質(zhì)譜對(duì)同一樣品不同時(shí)間檢測(cè)時(shí)，信號(hào)穩(wěn)定性較好。

2.2 方差分析及主成分分析

2.2.1 板栗外皮消化前后兒茶素類(lèi)物質(zhì)含量的變化

對(duì)圖1 的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行篩選，得到表1 數(shù)據(jù)結(jié)果，利用SIMCA 軟件對(duì)8 種兒茶素類(lèi)物質(zhì)消化前后的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行無(wú)監(jiān)督模式的主成分分析（PCA），得到板栗外皮消化前后兒茶素類(lèi)物質(zhì)的PCA 得分圖（圖2）和板栗內(nèi)皮消化前后兒茶素類(lèi)物質(zhì)的PCA 得分圖（圖3）。并對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行方差分析、Duncan 多重比較分析，結(jié)果如表2 和表3 所示。

表1 8 種兒茶素類(lèi)物質(zhì)消化前后的數(shù)據(jù)結(jié)果Table 1 Data results of 8 catechins before and after digestion

表2 板栗外皮消化前后兒茶素類(lèi)物質(zhì)的含量變化Table 2 Changes of catechins content in chestnut skin before and after digestion

圖2 板栗外皮消化前后兒茶素類(lèi)物質(zhì)的PCA 得分圖Fig.2 PCA scores of catechins in CSE before and after digestion

圖3 板栗內(nèi)皮消化前后兒茶素類(lèi)物質(zhì)的PCA 得分圖Fig.3 PCA scores of catechins in CPE before and after digestion

由圖2 得出，消化前后板栗外皮兒茶素類(lèi)物質(zhì)的數(shù)據(jù)點(diǎn)在得分圖上有顯著區(qū)別，消化前板栗外皮兒茶素類(lèi)物質(zhì)的數(shù)據(jù)點(diǎn)位于第一、四象限內(nèi)，消化后板栗外皮兒茶素類(lèi)物質(zhì)的數(shù)據(jù)點(diǎn)位于第二、三象限內(nèi)?？傮w來(lái)說(shuō)，消化前后板栗外皮樣品中的兒茶素類(lèi)物質(zhì)含量存在顯著差異。

表2 結(jié)果顯示，在經(jīng)過(guò)模擬消化體系后，板栗外皮中的兒茶素類(lèi)物質(zhì)含量較消化前含量均有顯著降低（P＜0.05），可能是因?yàn)閮翰杷仡?lèi)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)易受影響性，在經(jīng)過(guò)模擬體系時(shí)，pH 的變化和消化酶的存在使得兒茶素類(lèi)物質(zhì)降解，導(dǎo)致其含量降低。

2.2.2 板栗內(nèi)皮消化前后兒茶素類(lèi)物質(zhì)含量的變化

從圖3 可以看出，消化前后板栗內(nèi)皮兒茶素類(lèi)物質(zhì)的數(shù)據(jù)點(diǎn)在得分圖上也有顯著區(qū)別，消化前板栗內(nèi)皮兒茶素類(lèi)物質(zhì)的數(shù)據(jù)點(diǎn)位于第一、四象限內(nèi)，消化后板栗內(nèi)皮兒茶素類(lèi)物質(zhì)的數(shù)據(jù)點(diǎn)位于第二、三象限內(nèi)，表明消化前后板栗內(nèi)皮樣品中的兒茶素類(lèi)物質(zhì)含量同樣存在顯著差異。

表3 結(jié)果顯示，在經(jīng)過(guò)模擬消化體系后，板栗內(nèi)皮中的兒茶素類(lèi)物質(zhì)含量均比消化前的含量顯著降低（P＜0.05），與板栗外皮兒茶素類(lèi)物質(zhì)消化前后所發(fā)生的變化一致，原因也大體一致。

表3 板栗內(nèi)皮消化前后兒茶素類(lèi)物質(zhì)的含量變化Table 3 Changes of catechins content in chestnut before and after endothelial digestion

2.3 代謝前后差異組分聚類(lèi)分析

為進(jìn)一步解析代謝物變化規(guī)律，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Zsore值歸一化處理后，對(duì)所有樣品進(jìn)行聚類(lèi)熱圖分析，并通過(guò)Tbtools 軟件繪制聚類(lèi)熱圖（圖4 和圖5）。圖中橫坐標(biāo)表示樣品名稱(chēng)，縱坐標(biāo)表示代謝物名稱(chēng)，顏色代表相關(guān)系數(shù)值大小，紅色越深代表含量越高，藍(lán)色越深代表含量越低。

圖4 板栗外皮兒茶素類(lèi)物質(zhì)消化前后顯著差異代謝物Fig.4 Significant difference of metabolites of catechins in CSE before and after digestion

圖5 板栗內(nèi)皮兒茶素類(lèi)物質(zhì)消化前后顯著差異代謝物Fig.5 Significant difference of metabolites of catechins in CPE before and after digestion

圖4 結(jié)果顯示，在對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后，板栗外皮消化前兒茶素類(lèi)物質(zhì)含量均較高，且相互之間含量的差距不明顯，均顯示為紅色并規(guī)則地進(jìn)行聚集，消化后則均顯示為藍(lán)色。由此可得，板栗外皮消化前兒茶素類(lèi)物質(zhì)含量（CSE）顯著高于經(jīng)過(guò)模擬消化體系后的兒茶素類(lèi)物質(zhì)含量（DCSE）。

圖5 結(jié)果顯示，板栗內(nèi)皮地聚類(lèi)情況與板栗外皮相似，即所得結(jié)果一致，可見(jiàn)消化前的板栗內(nèi)皮（CPE）兒茶素類(lèi)物質(zhì)含量顯著高于經(jīng)過(guò)模擬消化體系后樣品（DCPE）的兒茶素類(lèi)物質(zhì)含量。

2.4 代謝差異物分析

2.4.1 板栗外皮消化前后兒茶素類(lèi)物質(zhì)中的代謝差異物

板栗外皮消化前后的兒茶素類(lèi)物質(zhì)中的顯著代謝差異物見(jiàn)表4，由表4 可得，板栗外皮消化前后的兒茶素類(lèi)物質(zhì)含量均存在顯著降低，其中沒(méi)食子兒茶素降低程度最高，達(dá)94.96%。表沒(méi)食子酸兒茶素和表兒茶素次之，分別達(dá)89.70%和87.77%。沒(méi)食子酸兒茶素沒(méi)食子酸酯、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、兒茶素沒(méi)食子酸酯、兒茶素分別為78.98%、77.88%、63.94%、60.58%、55.08%。

表4 板栗外皮消化前后兒茶素類(lèi)物質(zhì)中的顯著代謝差異物Table 4 Significant metabolic differences of catechins in CSE before and after digestion

2.4.2 板栗內(nèi)皮消化前后兒茶素類(lèi)物質(zhì)中的代謝差異物

板栗內(nèi)皮消化前后兒茶素類(lèi)物質(zhì)中的顯著代謝差異物分析見(jiàn)表5，由表5 可得，板栗內(nèi)皮消化前后的兒茶素類(lèi)物質(zhì)含量均存在顯著降低，其中沒(méi)食子兒茶素降低程度最高，達(dá)95.20%。表沒(méi)食子酸兒茶素和表兒茶素次之，分別達(dá)90.71%和90.61%。沒(méi)食子酸兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、兒茶素沒(méi)食子酸酯、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯及兒茶素分別為78.42%、78.08%、78.05%、75.97%及65.81%。

表5 板栗內(nèi)皮消化前后兒茶素類(lèi)物質(zhì)中的顯著代謝差異物Table 5 Significant metabolic differences of catechins in CPE before and after digestion

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用體外消化模擬體系，通過(guò)超高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜得到一系列代謝物質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)，而后通過(guò)方差分析、Duncan 多重比較分析、無(wú)監(jiān)督模式識(shí)別的PCA 分析及聚類(lèi)分析等方法對(duì)板栗內(nèi)皮和外皮提取物中兒茶素類(lèi)物質(zhì)消化前后的組成進(jìn)行分析。試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)模擬消化體系后板栗皮中的8 種兒茶素類(lèi)物質(zhì)含量均比消化前顯著降低，原因可能與pH 的變化和消化酶的存在有關(guān)。未來(lái)，可進(jìn)一步研究?jī)翰杷仡?lèi)物質(zhì)在體內(nèi)的穩(wěn)定性，采用負(fù)載等包埋方法將其靶向輸送到吸收部位，以提高其生物利用率，為將其開(kāi)發(fā)為功能性食品提供參考依據(jù)。