王紫潔，馬靈珍

0 引言

小兒康顆粒由太子參、山楂、白芍、白術、茯苓等12味中藥材按照“君、臣、佐、使”中醫(yī)藥理論配伍而成，主要用于食滯蟲痢、煩躁不安、精神疲倦、脘腹脹滿、面色萎黃等病癥的治療[1]?，F(xiàn)代藥理和臨床研究表明，小兒康顆?？捎行Ц纳乒δ苄愿雇碵2]、再發(fā)性腹痛[3]的臨床癥狀，對小兒腹瀉[4]、小兒功能性便秘[5]治療效果顯著，同時還具有增強小兒厭食癥患者食欲[6]、降低高血鉛和輕度鉛中毒患兒的血鉛水平[7]等作用。小兒康顆?，F(xiàn)收載于衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第六冊[1]，質量標準中尚未對其所含成分進行定量控制，文獻報道[8]中也僅對其佐藥白芍所含的芍藥苷進行了定量研究。中藥及其制劑所含成分繁多且復雜，具有多靶點、多組分協(xié)同增效、多點微調(diào)等特點，為全面評價中成藥復方制劑整體質量，多指標成分質量控制模式近年來已廣泛應用于其質量控制中。本實驗根據(jù)中醫(yī)配伍理論，結合中藥質量標志物確定原則，采用HPLC梯度洗脫法對小兒康顆粒中君藥太子參的主要活性成分太子參環(huán)肽B，臣藥山楂的代表性成分牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷和金絲桃苷，佐藥白芍的代表性成分氧化芍藥苷、芍藥苷和苯甲酰芍藥苷含量進行同時測定，采用化學計量學分析方法對不同生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的小兒康顆粒目標成分含量進行聚類分析和主成分分析，為全面評價小兒康顆粒整體質量、提高其質量控制標準提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；AE240型電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；KQ-300DA型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 芍藥苷對照品(批號:110736-201943，含量95.1%，CAS號23180-57-6)、金絲桃苷對照品(批號:111521-201809，含量94.9%，CAS號482-36-0)和牡荊素葡萄糖苷對照品(批號:111979-201501，含量92.8%，CAS號178468-00-3)均來源于中國食品藥品檢定研究院；牡荊素鼠李糖苷對照品(批號:16042941，含量98.1%，CAS號64820-99-1)、氧化芍藥苷對照品(批號:18031641，含量98.8%，CAS號:39011-91-1)、苯甲酰芍藥苷對照品(批號:18031622，含量99.3%，CAS號38642-49-8)和太子參環(huán)肽B對照品(批號:18031328，含量99.9%，CAS號145459-19-4)均來源于上海同田生物技術股份有限公司；乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。小兒康顆粒(規(guī)格：每袋裝10 g；批號：190303、190305、190801，編號依次為S1～S3，來源于海南葫蘆娃藥業(yè)集團股份有限公司，簡稱企業(yè)1；批號：7381902、7382201、7382401、7382801、8381802、8382203、8382501，編號依次為S4～S10，來源于廣州諾金制藥有限公司，簡稱企業(yè)2；批號：1902002、200101，編號依次為S11～S12，來源于江西佑美制藥有限公司，簡稱企業(yè)3)。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品儲備液 精密稱取牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B對照品適量，用甲醇制成質量濃度分別為0.436、3.178、0.544、0.278、2.536、0.192、0.158 mg/ml的混合對照品儲備液。

2.1.2 混合對照品溶液 精密吸取混合對照品儲備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和2.5 ml，分別置于6個20 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成6個系列質量濃度線性考察混對溶液Ⅰ～Ⅵ；取混對溶液Ⅳ作為混合對照品溶液(牡荊素葡萄糖苷21.8 μg/ml、牡荊素鼠李糖苷158.9 μg/ml、金絲桃苷27.2 μg/ml、氧化芍藥苷13.9 μg/ml、芍藥苷126.8 μg/ml、苯甲酰芍藥苷9.6 μg/ml、太子參環(huán)肽B 7.9 μg/ml)。

2.1.3 供試品溶液和陰性樣品溶液 取小兒康顆粒樣品適量，除去內(nèi)包裝，取內(nèi)容物研成細粉，取約2.0 g，精密稱定，置25 ml量瓶中，精密加入甲醇25 ml，超聲處理45 min，放冷后用甲醇補重，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，制成小兒康顆粒供試品溶液。按小兒康顆粒的處方工藝[1]，分別制備缺山楂、缺白芍和缺太子參的陰性樣品，再按上述方法制成陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件及專屬性試驗 以Waters SunFire C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)為液相色譜柱，柱溫：30 ℃；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～14.0 min，15.0%A；14.0～25.0 min，15.0%A→27.0%A；25.0～41.0 min，27.0%A→39.0%A；41.0～47.0 min，39.0%A→52.0%A；47.0～55.0 min，52.0%A→15.0%A)，流速：1.0 ml/min；進樣量：10 μl；檢測波長分別為340 nm (0～25.0 min檢測牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷和金絲桃苷)[9-11]，230 nm (25.0～41.0 min檢測氧化芍藥苷、芍藥苷和苯甲酰芍藥苷)[12-14]和203 nm (41.0～55.0 min檢測太子參環(huán)肽B)[15-17]。精密吸取混合對照品溶液、小兒康顆粒供試品溶液和各陰性樣品溶液各10 μl，進樣檢測，記錄色譜圖。結果小兒康顆粒供試品色譜圖中牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B色譜峰峰形對稱，分離度均>1.5，理論板數(shù)按各目標化合物色譜峰計均≥3 500，陰性樣品對小兒康顆粒中太子參環(huán)肽B等7種目標成分的測定不干擾，色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.3 線性關系考察 精密吸取“2.1.2”項下系列質量濃度線性考察混對溶液Ⅰ～Ⅵ各10 μl，依次進樣測定小兒康顆粒中太子參環(huán)肽B等7種目標化合物的峰面積，以牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B質量濃度(X，μg/ml)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸，得7種成分的回歸方程、線性范圍及r值見表1。

表1 7種化合物的回歸方程、相關系數(shù)和線性范圍

2.4 精密度、重復性、穩(wěn)定性考察

2.4.1 精密度考察 取“2.1.2”項下混合對照品溶液連續(xù)進樣6次，記錄牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B的峰面積，結果儀器精密度良好，太子參環(huán)肽B等7種目標成分峰面積的RSD分別為1.05%、0.52%、1.06%、1.09%、0.57%、1.10%和1.22%。

2.4.2 重復性考察 取小兒康顆粒樣品，按“2.1.3”項下方法配制6份小兒康顆粒供試品溶液，依法進樣分析，記錄牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B的峰面積并計算各目標化合物的含量，結果方法重復性良好，太子參環(huán)肽B等7種目標成分含量的RSD分別為1.82%、0.86%、1.61%、0.73%、1.08%、1.75%和1.89%。

2.4.3 穩(wěn)定性考察 臨用新配1份小兒康顆粒供試品溶液，于0、2、4、8、18和24 h進樣檢測牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B的峰面積，結果小兒康顆粒供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定，太子參環(huán)肽B等7種目標成分峰面積的RSD分別為0.99%、0.56%、1.07%、1.12%、0.60%、1.15%和1.18%。

2.5 加樣回收率試驗 取牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B含量均已知的同一批次小兒康顆粒樣品適量，除去內(nèi)包裝取內(nèi)容物研成細粉，取約1.0 g，精密稱定(共稱取9份，3份隨機分為1組)，依據(jù)《中國藥典》2015年版四部規(guī)定(對照品加入量約為樣品原有量的50%、100%和150%)，分別精密加入混合對照品溶液(另行配制，牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B的質量濃度分別為0.127、0.863、0.159、0.078、0.715、0.057、0.043 mg/ml)1.0、2.0和3.0 ml，再按“2.1.3”項下方法制成加樣回收樣品溶液，依法進樣測定牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B的峰面積，并計算其含量，用測得量與樣品原有量之差除以對照品加入量，計算太子參環(huán)肽B等7種目標成分的回收率及RSD值，結果見表2。

表2 小兒康顆粒中7種成分的加樣回收率試驗結果

續(xù)表

2.6 樣品含量測定 取12個批次的小兒康顆粒樣品(編號S1～S12)，按“2.1.3”項下方法制成供試品溶液(每個批次平行制備3份)，依法進樣測定牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B的峰面積，并計算目標成分的含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果(mg/g)

2.7 聚類分析 為考察不同批次小兒康顆粒中太子參環(huán)肽B等7種目標成分的含量差異，采用SPSS 26.0軟件系統(tǒng)聚類分析法(聚類方法：組間聯(lián)接，測度：歐氏距離)對12個批次小兒康顆粒樣品進行聚類分析，結果見圖2。由圖2所得結果可知，當類間距離為15時，12批小兒康顆粒樣品聚為3類，樣品S6、S10、S5、S7、S9、S4和S8聚為一類，樣品S11和S12聚為一類，樣品S1、S3和S2聚為一類。從分類結果可以看出，同一生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的小兒康顆粒樣品聚為一類，表明同一生產(chǎn)企業(yè)樣品各成分含量相對穩(wěn)定、均勻，企業(yè)2樣品質量較為穩(wěn)定，而不同生產(chǎn)企業(yè)樣品間存在一定差異。

圖2 12批小兒康顆粒聚類分析樹狀圖

2.8 主成分分析 采用SPSS 26.0軟件對12批小兒康顆粒中太子參環(huán)肽B等7種目標成分的含量數(shù)據(jù)進行主成分分析，將表3測得數(shù)值導入分析軟件，得樣品主成分分析碎石圖見圖3，主成分特征值和方差貢獻率結果見表4。

表4 主成分特征值和方差貢獻率

圖3 主成分分析碎石圖

根據(jù)累積貢獻率>85%的原則，以初始特征值>1為提取標準，前3個主成分分別為3.219、1.461、1.282，初始特征值均>1，對方差貢獻率分別為45.987%、20.869%和18.312%，累積貢獻率為85.168%，大于85%，表明提取前3個主成分即可代表小兒康顆粒中太子參環(huán)肽B等7種目標成分85.168%的信息，可以用于對小兒康顆粒的質量評價。

3 討論

3.1 多指標成分的選擇 小兒康顆粒由太子參、山楂、白芍、白術、茯苓等12味中藥材組方而來，方中太子參益氣健脾、生津潤肺，白術健脾益氣、燥濕利水，共為君藥；山楂消食健胃、化濁降脂，茯苓健脾滲濕，葫蘆茶消痰散瘀，麥芽行氣消食、健脾開胃，合為臣藥；白芍養(yǎng)血斂陰、柔肝止痛，烏梅斂肺生津，蟬蛻斂肺止痛，榧子消積潤肺、潤燥通便，檳榔行氣消積，合為佐藥；陳皮健脾和胃、行氣寬中，引藥達病所，為使藥。諸藥合用，共奏健脾開胃、消食化滯、驅蟲止痛之功。太子參環(huán)肽B為君藥太子參特征成分；牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷等黃酮類為臣藥山楂主要活性成分；氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷等單萜類化合物為佐藥白芍主要藥效成分。本實驗根據(jù)中藥質量標志物確認原則選取牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B為小兒康顆粒多指標定量測定成分，以期全面評價小兒康顆粒的整體質量。

3.2 供試品溶液制備方法的優(yōu)化 在確定供試品溶液制備方法時，以小兒康顆粒中牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B的綜合提取率為指標，同時結合雜質干擾程度，對比考察了50%甲醇[11]、70%甲醇[9]、甲醇[13,15-17]和50%乙醇[12,14]提取溶劑以及超聲提取[9-11,13-17]、加熱回流[12]提取方式對考察指標的影響，結果顯示，以甲醇超聲提取時，小兒康顆粒中太子參環(huán)肽B等7種目標成分綜合提取率最佳，雜質成分干擾較小，在此基礎上對提取時間進行優(yōu)化，最終確定采用甲醇超聲提取45 min對小兒康顆粒進行供試品溶液的制備。

3.3 流動相的優(yōu)化選擇 在流動相優(yōu)化選擇時，參考相關文獻，依次考察了乙腈-水[15,17]、乙腈-0.1%甲酸溶液[10-11,16]和乙腈-0.1%磷酸溶液[12-14]流動相體系對小兒康顆粒中牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B色譜峰峰形、分離度的影響。結果顯示，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相系統(tǒng)進行梯度洗脫時，色譜圖基線平穩(wěn)，太子參環(huán)肽B等7種目標成分色譜峰峰形對稱，與相鄰色譜峰均能有效分離。在此基礎上對流動相中有機相和水相比例進行優(yōu)化，最終確定采用“2.2”項色譜條件下的流動相梯度洗脫程序對小兒康顆粒中牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B含量進行同時檢測。

本實驗采用HPLC法對小兒康顆粒中牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、太子參環(huán)肽B含量進行了同時測定，建立了該制劑的多指標成分質量控制評價模式，所建立的方法操作簡便、結果準確，為全面評價小兒康顆粒的整體質量提供了參考依據(jù)，同時采用聚類分析、主成分分析對3個不同生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的12批次小兒康顆粒樣品質量進行了綜合評價。結果顯示，同一生產(chǎn)企業(yè)樣品相對穩(wěn)定，不同生產(chǎn)企業(yè)樣品間存在一定差異，可能與各生產(chǎn)企業(yè)原藥材質量控制和生產(chǎn)過程參數(shù)控制存在一定差異有關，提示藥品生產(chǎn)企業(yè)應加強原藥材產(chǎn)地、采收季節(jié)等源頭控制，不斷提升原藥材內(nèi)控質量標準，優(yōu)化制劑生產(chǎn)過程控制參數(shù)，確保產(chǎn)品質量和臨床療效的一致性。