• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      胞苷合成途徑改造對(duì)大腸桿菌嘧啶核苷發(fā)酵的影響

      2021-07-06 13:06:54劉益寧秦臻李旋蔣帥吳鶴云謝希賢
      食品與發(fā)酵工業(yè) 2021年12期
      關(guān)鍵詞:胞苷核苷嘧啶

      劉益寧,秦臻,李旋,蔣帥,吳鶴云,謝希賢,3*

      1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津,300457)2(天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,天津,300457) 3(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,天津,300457)

      嘧啶核苷包括尿嘧啶核苷(尿苷,uridine)和胞嘧啶核苷(胞苷,cytidine),廣泛應(yīng)用在食品、保健品、化妝品和醫(yī)藥等諸多行業(yè)。作為抗病毒抗腫瘤藥物的前體[1],嘧啶核苷是生物醫(yī)藥研究必不可少的原料。隨著抗病毒抗腫瘤藥物研發(fā)的深入以及嘧啶核苷功能性研究的不斷拓展,嘧啶核苷的市場(chǎng)需求不斷擴(kuò)大,迫切需要開(kāi)發(fā)廉價(jià)的可規(guī)?;瘧?yīng)用的嘧啶核苷生產(chǎn)工藝。微生物發(fā)酵法具有原料來(lái)源廣泛、生產(chǎn)效率高和環(huán)境友好可持續(xù)等諸多優(yōu)勢(shì)[2],是當(dāng)前嘧啶核苷生產(chǎn)研究的重點(diǎn)。

      嘧啶核苷的生物合成可分為3部分(圖1):首先谷氨酰胺、碳酸氫鹽、腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)、天冬氨酸和5-磷酸核糖-1-焦磷酸(5-phosphoribosyl 1-pyrophosphate,PRPP)等前體物質(zhì)經(jīng)6步酶促反應(yīng)生成尿苷酸(uridylic monophosphate,UMP),然后一部分UMP直接脫去磷酸基團(tuán)生成尿苷,一部分UMP則經(jīng)過(guò)一系列的磷酸化,胺化再去磷酸后生成胞苷[3]。該合成途徑會(huì)受到嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)控,如在大腸桿菌中,嘧啶核苷操縱子基因轉(zhuǎn)錄會(huì)受到尿苷酸或者胞苷酸的反饋?zhàn)瓒簦掖呋谝徊椒磻?yīng)的氨甲酰磷酸合成酶的活性還受到UMP的反饋抑制[4-5]。另外,胞苷合成的關(guān)鍵酶UMP激酶和三磷酸胞苷(cytidine triphosphate,CTP)合酶的活性還分別受到三磷酸尿苷(uridine triphosphate,UTP)和CTP的反饋抑制[5]。嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆答佌{(diào)控機(jī)制,冗長(zhǎng)復(fù)雜的反應(yīng)過(guò)程以及對(duì)多種重要前體物的需求是限制嘧啶核苷生物合成的主要因素。早期研究中,通過(guò)誘變篩選結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性菌株是選育嘧啶核苷生產(chǎn)菌的主要方法,但是誘變菌株往往存在負(fù)向突變的累積,菌株的持續(xù)改良也受限制[6-7]。隨著系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展,代謝工程等理性構(gòu)建的方法逐漸成為工業(yè)菌株從頭構(gòu)建和持續(xù)改良的首選方法[8-9]。WU等[4]和FAN等[10]綜合運(yùn)用高通量篩選和代謝工程的方法構(gòu)建了1株產(chǎn)尿苷的菌株UR6,5 L罐上發(fā)酵64 h,可生產(chǎn)70.3 g/L的尿苷。YANG等[11]通過(guò)阻斷降解途徑,促進(jìn)關(guān)鍵酶的表達(dá),增強(qiáng)前體物的供應(yīng)等代謝工程策略的運(yùn)用,成功構(gòu)建產(chǎn)胞苷的工程菌株。但是現(xiàn)存胞苷工程菌株的發(fā)酵性能還較低,很難應(yīng)用于胞苷的工業(yè)化生產(chǎn)。

      優(yōu)化胞苷合成途徑,構(gòu)建高產(chǎn)胞苷的微生物細(xì)胞工廠,逐步提高菌株的胞苷發(fā)酵指標(biāo),對(duì)胞苷發(fā)酵生產(chǎn)意義重大。課題組前期構(gòu)建的尿苷高產(chǎn)菌UR6的UMP從頭合成途徑已經(jīng)得到了有效強(qiáng)化,本研究接著對(duì)UR6的胞苷合成途徑進(jìn)行了系統(tǒng)的代謝工程改造(圖1),期望通過(guò)強(qiáng)化胞苷合成途徑,將UR6逐步改造為胞苷的高產(chǎn)菌株。主要考察了阻斷胞苷及其前體物的降解途徑,過(guò)表達(dá)關(guān)鍵酶增強(qiáng)胞苷合成途徑,以及融合蛋白表達(dá)改變UMP分別到胞苷和尿苷的流量分配對(duì)大腸桿菌嘧啶核苷發(fā)酵的影響,為胞苷高產(chǎn)菌株的構(gòu)建提供新的借鑒和參考。

      圖1 嘧啶核苷生物合成途徑和本研究的代謝工程改造策略Fig.1 Biosynthetic pathway of pyrimidine nucleoside and the metabolic engineering strategies used in this study 注:CMP為胞嘧啶核苷酸(cytidine monophosphate);CDP為二磷酸胞苷(cytidine diphosphate);UDP為二磷酸尿苷(uridine diphosphate); TCA為三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle);PPP為磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway)

      1 材料與方法

      1.1 菌株和質(zhì)粒

      本研究所涉及的菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表1。

      表1 本研究中涉及的菌株和質(zhì)粒Table 1 Bacterial strains and plasmids used in this study.

      1.2 主要試劑

      引物及基因,蘇州金唯智科技有限公司;Primer STAR HS DNA聚合酶,大連寶生物科技有限公司;2×Rapid Taq Mix、ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit,南京諾唯贊生物科技有限公司;質(zhì)??焖偬崛≡噭┖小NA凝膠純化回收試劑盒、胞苷和尿苷標(biāo)準(zhǔn)品,美國(guó)Omega公司;其余生化試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

      1.3 培養(yǎng)基

      斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 1,蛋白胨 10,牛肉膏 10,酵母粉 5,NaCl 2.5,瓊脂 20。

      種子培養(yǎng)基(g/L):酵母粉 5,蛋白胨 3,KH2PO4·3H2O 1.2,MgSO4·7 H2O 0.5,F(xiàn)eSO4·7 H2O 0.01,MnSO4·H2O 0.01,苯酚紅 0.008,VB1、VB3、VB5、VB12、VH各0.001。

      發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):酵母粉 4,蛋白胨 5,檸檬酸鈉 2,KH2PO4·3 H2O 2,MgSO4·7 H2O 2, FeSO4·7 H2O 0.02,MnSO4·H2O 0.02,苯酚紅 0.008,VB1、VB3、VB5、VB12、VH各0.002。

      1.4 基因編輯方法

      本研究采用LI等[12]報(bào)道的CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯方法進(jìn)行工程菌株的構(gòu)建。該方法中CRISPR-Cas9系統(tǒng)包括pGRB和pREDCas9兩個(gè)質(zhì)粒,其中pREDCas9攜帶pGRB的消除系統(tǒng)、λ噬菌體的Red重組系統(tǒng)及Cas9蛋白表達(dá)系統(tǒng),攜帶奇霉素抗性(工作質(zhì)量濃度為100 mg/L),32 ℃培養(yǎng)。pGRB以pUC18為骨架,包含gRNA-Cas9結(jié)合區(qū)域序列和終止子序列,攜帶氨芐青霉素抗性(工作質(zhì)量濃度為100 mg/L),37 ℃培養(yǎng)。

      1.4.1 pGRB質(zhì)粒和重組片段的構(gòu)建

      為構(gòu)建含有不同靶位點(diǎn)序列的重組pGRB質(zhì)粒,首先使用工具CRISPR RGEN Tools選擇靶序列(PAM:5′-NGG-3′),設(shè)計(jì)合成2條完全反向互補(bǔ)的單鏈DNA,然后通過(guò)退火形成雙鏈DNA,該雙鏈DNA中間序列是靶位點(diǎn)的特定gRNA間隔序列,兩端序列與pGRB具有同源序列。利用ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit,將雙鏈DNA與線性化pGRB通過(guò)同源重組構(gòu)建出含有靶點(diǎn)序列的重組pGRB質(zhì)粒。

      構(gòu)建重組片段時(shí),先利用引物設(shè)計(jì)軟件primer 5,以待敲除基因或待整合位點(diǎn)的上下游序列為模板,設(shè)計(jì)上下游同源臂引物(擴(kuò)增長(zhǎng)度約400~500 bp)。以待整合基因?yàn)槟0?,設(shè)計(jì)整合基因的擴(kuò)增引物,擴(kuò)增上下游同源臂和目的基因片段后,通過(guò)重疊PCR的方法連接成重組片段。

      1.4.2 DNA片段重組

      制備出發(fā)菌株的感受態(tài)細(xì)胞,先將pREDCas9質(zhì)?;D(zhuǎn)至感受態(tài)細(xì)胞,平板培養(yǎng)并篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。將陽(yáng)性菌株接種到含LB培養(yǎng)基的搖管中培養(yǎng)12 h,再接種于2 XYT培養(yǎng)基(蛋白胨16 g/L,酵母粉10 g/L,NaCl 5 g/L,奇霉素100 mg/L)中培養(yǎng),待OD600值為0.1~0.2時(shí)加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷,OD600增至0.3~0.4時(shí)收集菌體,用10%(體積分?jǐn)?shù))的甘油洗滌,制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)。將重組pGRB質(zhì)粒和重組片段同時(shí)電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中,復(fù)蘇2 h后涂布在含氨芐青霉素和奇霉素抗性的LB平板上,32 ℃培養(yǎng)。待長(zhǎng)出單菌落后,通過(guò)菌落PCR篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,再消除pGRB和pREDCas9質(zhì)粒,獲得目標(biāo)菌株。

      1.5 搖瓶培養(yǎng)方法

      用接種環(huán)刮取1環(huán)斜面種子接種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,9層紗布封口,37 ℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)8 h;按10%接種量接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中(終體積為30 mL),9層紗布封口,37 ℃,200 r/min振蕩培養(yǎng);發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)補(bǔ)加氨水維持pH值為7.0~7.2;初始葡萄糖耗盡后,補(bǔ)加600 g/L葡萄糖溶液維持發(fā)酵進(jìn)行,發(fā)酵周期為24 h。

      1.6 檢測(cè)方法

      利用分光光度計(jì)測(cè)量發(fā)酵液在600 nm處的吸光度(OD600)表征生物量;采用HPLC對(duì)尿苷和胞苷濃度進(jìn)行定量分析:所用儀器為T(mén)hermo U3000,色譜柱為phenomenex Gemini 5u C18110A(150 mm×4.6 mm);流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(水)=2∶98;流速為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為20 μL;紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為270 nm。

      1.7 數(shù)據(jù)分析方法

      發(fā)酵數(shù)據(jù)代表3組平行發(fā)酵數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。利用T檢驗(yàn)雙尾分布對(duì)改造菌和對(duì)應(yīng)出發(fā)菌的2組發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行單向方差分析?!?”表示P<0.05,說(shuō)明結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;“**”表示P<0.01,說(shuō)明結(jié)果具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 阻斷胞苷及前體物降解途徑對(duì)嘧啶核苷發(fā)酵的影響

      阻斷降解途徑是促使目標(biāo)產(chǎn)物過(guò)量積累的重要方法。胞苷或尿苷可由核苷水解酶(rihA/B/C,UR6中此3個(gè)基因已被敲除)水解為胞嘧啶或尿嘧啶,也可被胞苷/尿苷激酶(udk,UR6中此基因也已敲除)磷酸化為CMP和UMP,同胞苷或者尿苷的合成方向相悖[4]。此外,胞苷還可被胞苷脫氨酶(cdd)降解為尿苷[13]。另外,胞苷合成的直接前體物CMP可在核苷酶(ygdH)的作用下降解為胞嘧啶[14],也可在胞苷酸激酶(cmk)的作用下磷酸化成CDP[15],是胞苷合成的逆向反應(yīng)。

      分別敲除UR6中的cdd,cmk和ygdH基因,構(gòu)建了菌株CYT1-1,CYT1-2和CYT1-3。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖2所示,搖瓶發(fā)酵24 h后,4株菌的尿苷產(chǎn)量基本相同,且只有CYT1-1積累了0.2 g/L胞苷,說(shuō)明胞苷脫氨酶的敲除是胞苷積累的關(guān)鍵因素,而cmk基因和ygdH基因的單敲除對(duì)發(fā)酵結(jié)果基本無(wú)影響。逐一敲除CYT1-1的cmk和ygdH基因后,所得菌株CYT1-4和CYT1-5的胞苷產(chǎn)量分別提高1.3和2.8 g/L,尿苷產(chǎn)量變化不明顯。結(jié)果表明,胞苷脫氨酶催化的反應(yīng)是胞苷的主要降解途徑,同先前的研究報(bào)道相符[11]。而cmk基因和ygdH基因的敲除,切斷胞苷合成主要前體物質(zhì)CMP的主要分支代謝,有利于提高胞內(nèi)CMP的濃度,進(jìn)而促進(jìn)胞苷的生成。

      圖2 cdd、cmk和ygdH基因的敲除對(duì)嘧啶核苷 發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of knockout of cdd, cmk and ygdH genes on pyrimidine nucleoside fermentation 注:“*”代表差異顯著(P<0.05);“**”代表差異極顯著(P<0.01)(下同)

      2.2 加強(qiáng)胞苷合成途徑對(duì)嘧啶核苷發(fā)酵的影響

      為進(jìn)一步提高胞苷產(chǎn)量,本研究接著對(duì)CYT1-5胞苷合成途徑的主要限速步驟進(jìn)行了強(qiáng)化。UMP由尿苷酸激酶(pyrH基因編碼)催化生成UDP是UMP合成胞苷的第一個(gè)限速步驟,而尿苷酸激酶的催化活性受三磷酸鳥(niǎo)苷 (guanosine triphosphate, GTP)的變構(gòu)激活和UTP的變構(gòu)抑制。研究表明,將大腸桿菌尿苷酸激酶第93位的天冬氨酸替換為丙氨酸可降低該酶與UTP的結(jié)合從而減弱尿苷酸激酶所受的反饋抑制作用[16]。胞苷合成途徑的第二個(gè)限速步驟是pyrG基因編碼的CTP合酶所催化的反應(yīng),該反應(yīng)受到CTP的反饋抑制。據(jù)報(bào)道,在谷氨酸棒狀桿菌的CTP合酶中引入3個(gè)位點(diǎn)的突變(D160E,E162A,E168K),所得CTP合酶突變體所受CTP的抑制作用大幅減弱[17]。另外,由nudG編碼的CTP二磷酸酶可催化CTP至CMP的反應(yīng)。強(qiáng)化nudG基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)理論上也有利于胞苷的生成。

      本研究首先在CYT1-5中的ilvG、tehB和yeeP3個(gè)假基因位點(diǎn)分別整合了PyrHecj(D93A)、PyrGcgl(D160E、E162、E168K)的編碼基因pyrH*和pyrG*,以及nudG基因,并都由啟動(dòng)子Ptrc啟動(dòng),構(gòu)建了菌株CYT2-1、CYT2-2和CYT2-3。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖3所示,CYT2-1的胞苷和尿苷產(chǎn)量分別為4.2和7.4 g/L,相比于CYT1-5,胞苷產(chǎn)量提高了50%,尿苷產(chǎn)量降低了35.1%。另外,CYT2-1的OD600值為27.5,較CYT1-5降低了29%;CYT2-2的發(fā)酵結(jié)果同CYT1-5基本無(wú)變化;CYT2-3的胞苷產(chǎn)量為4.4 g/L,較CYT1-5提高了57.1%,而尿苷產(chǎn)量和OD600值與CYT1-5相比基本無(wú)變化。結(jié)果表明,PyrHecj(D93A)的表達(dá)有效促進(jìn)了胞苷的積累,但是中間代謝物如UDP或UTP的濃度也可能提高,從而造成代謝不平衡妨礙了菌體的生長(zhǎng);PyrGcgl(D160E、E162A、E168K)在CYT1-5中的表達(dá)對(duì)其嘧啶核苷的發(fā)酵基本無(wú)影響,分析可能是底物UTP供應(yīng)不足,于是本研究對(duì)PyrHecj(D93A)和PyrGcgl(D160E、E162A、E168K)進(jìn)行了組合表達(dá),構(gòu)建了菌株CYT2-4,搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示,CYT2-4的胞苷和尿苷產(chǎn)量分別為4.9和8.4 g/L,相較于CYT2-2,胞苷產(chǎn)量有了顯著提升,而尿苷產(chǎn)量和菌體生長(zhǎng)情況也得以恢復(fù),說(shuō)明這2個(gè)酶的組合過(guò)表達(dá)更有利于胞苷合成途徑的強(qiáng)化,有效促進(jìn)了胞苷的積累。最后在CYT2-4上對(duì)nudG基因進(jìn)行了雙拷貝,構(gòu)建了菌株CYT2-5,搖瓶結(jié)果顯示CYT2-5的胞苷和尿苷產(chǎn)量分別為5.6和9.3 g/L,OD600值為34.5。相較于CYT2-4,CYT2-5的胞苷產(chǎn)量提升了14.3%,尿苷產(chǎn)量提升了12.0%,菌體生長(zhǎng)基本無(wú)變化。

      圖3 pyrH*、pyrG*和nudG基因的整合對(duì) 嘧啶核苷發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of integration of pyrH*、pyrG* and nudG genes on pyrimidine nucleoside fermentation

      突變體PyrHecj(D93A)和PyrGcgl(D160E、E162A、E168K)的組合表達(dá)以及內(nèi)源nudG基因表達(dá)的強(qiáng)化有效促進(jìn)了胞苷的積累。但是盡管胞苷產(chǎn)量得到了顯著提升,CYT2-5中主要產(chǎn)物仍舊是尿苷,需進(jìn)一步改變UMP的流量分配,將更多地UMP導(dǎo)向胞苷的合成。

      2.3 5′-核苷酸酶對(duì)嘧啶核苷發(fā)酵的影響

      從前述結(jié)果來(lái)看,在嘧啶核苷合成代謝中,尿苷是優(yōu)先合成的,原因可能有兩方面:一是因?yàn)榘蘸铣傻闹苯忧绑wCMP來(lái)源于尿苷合成的直接前體UMP,且UMP向CMP的合成還受到嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)控,因此相比CMP,胞內(nèi)更容易積累UMP,從而有利于尿苷的合成;二是大腸桿菌中,5′-核苷酸酶的專(zhuān)一性較弱,嘌呤和嘧啶核苷酸都可被5′-核苷酸酶催化生成相應(yīng)的核苷,而且相對(duì)于胞苷酸,大腸桿菌中的5′-核苷酸酶可能對(duì)UMP的親和力更強(qiáng),因此在前體物UMP充足的條件下,細(xì)胞更容易積累尿苷。選擇對(duì)UMP親和力較弱,而對(duì)CMP具有更高親和力,甚至專(zhuān)一性結(jié)合CMP的5′-核苷酸酶會(huì)更有利于胞苷的合成。

      大腸桿菌中已被注釋的編碼5′-核苷酸酶的基因有4個(gè),分別是ushA、yrfG、yjjG和surE。為了驗(yàn)證這4個(gè)基因所編碼的4種5′-核苷酸酶對(duì)UMP和CMP的親和力,本研究首先將CYT2-5中ushA、yrfG、yjjG和surE4個(gè)基因進(jìn)行了組合敲除,構(gòu)建了只含1種5′-核苷酸酶的菌株CYT3-1、CYT3-2、CYT3-3和CYT3-4。搖瓶結(jié)果如圖4所示,由于3個(gè)5′-核苷酸酶基因的敲除會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)5′-核苷酸酶活力大幅降低,所以相對(duì)CYT2-5,4株菌的胞苷和尿苷產(chǎn)量都顯著降低,而且4株菌的胞苷產(chǎn)量在總的嘧啶核苷產(chǎn)量的占比也都呈現(xiàn)了明顯的降低趨勢(shì),說(shuō)明菌株自身的4種5′-核苷酸酶都對(duì)UMP表現(xiàn)出了更高的親和力。

      圖4 不同5′-核苷酸酶對(duì)嘧啶核苷發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of different 5′-nucleotidases on pyrimidine nucleoside fermentation

      XU等[18]的研究報(bào)道指出,來(lái)源于酵母菌的5′-核苷酸酶(phm8基因編碼)對(duì)CMP的親和力更強(qiáng),于是本研究在CYT2-5的假基因mbhA位點(diǎn)上整合了酵母菌的phm8基因,構(gòu)建了菌株CYT3-5,發(fā)酵結(jié)果顯示,CYT3-5的尿苷產(chǎn)量為11.5 g/L,較CYT2-5提高了23.7%,但是胞苷產(chǎn)量變化不大。和XU等[18]的研究報(bào)道不同,5′-核苷酸酶PHM8在大腸桿菌中的表達(dá)顯著提高了尿苷的產(chǎn)量,可能的原因是CYT3-5胞內(nèi)UMP的濃度遠(yuǎn)高于CMP的濃度,UMP會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性地與PHM8結(jié)合,從而有利于尿苷的生成。

      2.4 融合蛋白的表達(dá)對(duì)嘧啶核苷發(fā)酵的影響

      由于本研究所用出發(fā)菌株含有2個(gè)PyrF編碼基因,來(lái)源于枯草芽孢桿菌的pyrFbsu基因以及本源的pyrFecj基因,所以分別敲除CYT3-5中的pyrFbsu基因和pyrFecj基因,構(gòu)建了菌株CYT4-1和CYT4-2,以驗(yàn)證這2個(gè)基因?qū)︵奏ず塑蘸铣伤鸬淖饔?。搖瓶結(jié)果如圖5所示,3株菌的生長(zhǎng)情況基本相同;相比于CYT3-5,CYT4-1的胞苷和尿苷產(chǎn)量變化不大,而CYT4-2的胞苷產(chǎn)量和尿苷產(chǎn)量都有了顯著下降,表明CYT3-5自身的PyrF對(duì)嘧啶核苷合成起主要的作用。于是本研究選擇將PyrFecj同尿苷酸激酶突變體PyrHecj(D93A)進(jìn)行了融合表達(dá)??紤]到融合蛋白中2個(gè)功能蛋白在表達(dá)過(guò)程中的先后順序?qū)φw催化效率的影響,本研究構(gòu)建了2個(gè)融合蛋白:PyrFecj-(Gly4Ser)3-PyrHecj(D93A)和PyrHecj(D93A)-(Gly4Ser)3-PyrFecj。對(duì)應(yīng)的編碼基因分別為pyrFecj-[(GGT)4(TCA)]3-pyrH*和pyrH*-[(GGT))4(TCA)]3-pyrFecj(前一個(gè)蛋白編碼基因的終止密碼子已去除)。將這2個(gè)基因分別整合在CYT4-2的假基因yjiT位點(diǎn),并由啟動(dòng)子Ptrc啟動(dòng),構(gòu)建了菌株CYT4-3和CYT4-4。另外在CYT3-5中的相同位點(diǎn)整合了pyrH*基因,構(gòu)建菌株CYT4-5。將CYT3-5、CYT4-3、CYT4-4和CYT4-5進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,結(jié)果如圖5所示,這幾株菌的生長(zhǎng)情況基本無(wú)差別;CYT4-3的胞苷和尿苷產(chǎn)量分別為5.9和11.9 g/L,和CYT3-5相比,胞苷產(chǎn)量提高了7.2%,尿苷產(chǎn)量降低了6.1%;CYT4-4的胞苷和尿苷產(chǎn)量分別為7.2和8.2 g/L,和CYT3-5相比,胞苷產(chǎn)量提高了30.9%,尿苷產(chǎn)量降低了28.7%;CYT4-5的胞苷和尿苷產(chǎn)量分別為6.2和8.8 g/L,較CYT3-5相比,胞苷產(chǎn)量提高了14.8%,尿苷產(chǎn)量降低了23.5%。

      圖5 PyrF和PyrH融合表達(dá)對(duì)嘧啶核苷發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of fusion expression of PyrF and PyrH on pyrimidine nucleoside fermentation

      結(jié)果表明,pyrH*基因表達(dá)的強(qiáng)化和融合蛋白的表達(dá),都有利于UMP流向胞苷的合成,從而促進(jìn)胞苷的積累,降低尿苷的合成。比較而言,融合蛋白的表達(dá)對(duì)胞苷的合成更有利,且PyrHecj(D93A)-(Gly4Ser)3-PyrFecj的表達(dá)效果更好。融合蛋白的表達(dá)之所以比pyrH*基因的單獨(dú)過(guò)表達(dá)效果更為顯著,原因可能在于pyrH*基因的單獨(dú)過(guò)表達(dá)只是通過(guò)提高胞內(nèi)PyrHecj(D93A)的酶量,促進(jìn)UMP流向胞苷的合成,而融合蛋白的表達(dá)不僅增加了胞內(nèi)PyrHecj(D93A)的酶量,還通過(guò)融合蛋白所具有的“鄰近效應(yīng)”使PyrHecj(D93A)與其相融合的PyrFecj所催化的產(chǎn)物UMP有更高的碰撞幾率,從而更有效地促進(jìn)了胞苷合成前體物UTP的合成,顯著促進(jìn)了胞苷的積累,相應(yīng)地,UMP流向尿苷的合成通量顯著降低。

      3 討論與結(jié)論

      UR6是1株經(jīng)過(guò)系統(tǒng)代謝工程改造所得的尿苷高產(chǎn)菌株,其UMP合成途徑較強(qiáng),適合作為構(gòu)建胞苷高產(chǎn)菌株的出發(fā)菌株。為將UR6由只產(chǎn)尿苷的菌株改造為胞苷高產(chǎn)菌,本研究從4個(gè)方面入手,對(duì)UR6的胞苷合成途徑進(jìn)行了系統(tǒng)改造。

      (1)阻斷胞苷及其前體物的降解途徑。cdd基因的敲除切斷了胞苷的主要降解途徑,使菌株開(kāi)始積累胞苷。cmk基因和ygdH基因的敲除切斷了胞苷合成途徑中的主要支路途徑,減少了胞苷合成前體物的額外消耗,也促進(jìn)了胞苷的積累。(2)組合強(qiáng)化胞苷合成關(guān)鍵酶的表達(dá)。本研究引入了調(diào)控作用減弱的UMP激酶和CTP合酶突變體,并對(duì)本源的CTP二磷酸酶的編碼基因進(jìn)行了雙拷貝,通過(guò)關(guān)鍵酶的組合表達(dá)有效地加強(qiáng)了胞苷的合成途徑,使得胞苷的產(chǎn)量大幅提升。(3)比較不同5′-核苷酸酶對(duì)嘧啶核苷發(fā)酵的影響。尿苷和胞苷合成途徑的競(jìng)爭(zhēng)主要在于5′-核苷酸酶所催化的反應(yīng)。本研究構(gòu)建了只含其中1種5′-核苷酸酶的菌株,考察了大腸桿菌自身的4種核苷酸酶分別在嘧啶核苷發(fā)酵中所起的作用。結(jié)果證實(shí)這4種核苷酸酶的專(zhuān)一性較差,并且相對(duì)于CMP,4種核苷酸酶都更傾向于和UMP結(jié)合,從而催化其合成尿苷。PHM8是來(lái)源于酵母菌的5′-核苷酸酶,先前有報(bào)道稱(chēng)其對(duì)CMP有更高的親和力。但是和報(bào)道的結(jié)果不同,該酶在大腸桿菌的表達(dá),顯著促進(jìn)了尿苷的積累,而對(duì)胞苷積累的影響不大。說(shuō)明在UMP相對(duì)過(guò)量的條件下,PHM8還是優(yōu)先結(jié)合UMP,催化其生成尿苷。(4)通過(guò)蛋白的融合表達(dá)增強(qiáng)胞苷合成。本研究將乳清酸核苷-5-磷酸脫羧酶同尿苷酸激酶進(jìn)行融合表達(dá),利用融合蛋白的“鄰近效應(yīng)”,促進(jìn)前體物UMP流向胞苷的合成,使胞苷的產(chǎn)量得到了顯著提升。

      最終所得菌株CYT4-4搖瓶發(fā)酵24 h可積累7.2 g/L胞苷和8.2 g/L尿苷,說(shuō)明本研究通過(guò)對(duì)胞苷合成途徑的一系列改造,成功改變了UMP向胞苷和尿苷合成的流量分配,使約46.7%的UMP流向了胞苷的合成。多種可分離產(chǎn)物的聯(lián)產(chǎn)是提高原料利用率、降低發(fā)酵生產(chǎn)成本的有效方法[24]。胞苷和尿苷可以通過(guò)色譜分離等技術(shù)進(jìn)行分離純化,因此該菌可用來(lái)聯(lián)產(chǎn)尿苷和胞苷,具有一定的工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。為進(jìn)一步提升胞苷產(chǎn)量,最終獲得只高產(chǎn)胞苷的工程菌,需要繼續(xù)強(qiáng)化菌株的胞苷合成途徑,如篩選對(duì)CMP有更高親和力甚至專(zhuān)一親和CMP的5′-核苷酸酶和完全解調(diào)控的UMP激酶和CTP合酶等。

      猜你喜歡
      胞苷核苷嘧啶
      Gilteritinib聯(lián)合阿扎胞苷 vs. 單用阿扎胞苷治療新診斷的FLT3mut+AML
      阿扎胞苷對(duì)中高危骨髓增生異常綜合征的臨床有效性及安全性探討
      紫紅獐牙菜對(duì)四氧嘧啶性糖尿病小鼠的降糖作用
      三七青黛膏預(yù)防阿扎胞苷皮下注射治療所致不良反應(yīng)的效果觀察
      磺胺嘧啶銀混懸液在二度燒傷創(chuàng)面治療中的應(yīng)用
      阿扎胞苷治療MDS的研究進(jìn)展
      RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定猴頭菌片中5種核苷
      中成藥(2017年5期)2017-06-13 13:01:12
      HPLC法同時(shí)測(cè)定新疆貝母中3種核苷類(lèi)成分
      中成藥(2017年5期)2017-06-13 13:01:12
      N-甲基嘧啶酮類(lèi)化合物的綠色合成研究
      蛹蟲(chóng)草中4種核苷的含量分析
      德阳市| 忻州市| 临洮县| 铅山县| 温州市| 崇阳县| 大洼县| 阿鲁科尔沁旗| 崇仁县| 新邵县| 湖州市| 隆子县| 白山市| 吴旗县| 洛扎县| 贡觉县| 时尚| 安徽省| 门头沟区| 深水埗区| 台北县| 万全县| 宜川县| 滨海县| 会同县| 景宁| 师宗县| 凭祥市| 白银市| 武汉市| 塔河县| 鄱阳县| 定陶县| 双鸭山市| 应城市| 伊通| 凉城县| 连州市| 和顺县| 庆云县| 乐山市|