石小鳳 張春愹

摘要：目的 ?評估實(shí)驗(yàn)室開展新冠病毒核酸檢測結(jié)果可靠性方法 對實(shí)驗(yàn)室新冠病毒核酸檢測各環(huán)節(jié)影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確度的因素進(jìn)行分析評估。結(jié)果 對實(shí)驗(yàn)室檢測各個(gè)環(huán)節(jié)關(guān)鍵影響因素做好質(zhì)量控制，實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備各項(xiàng)性能指標(biāo)達(dá)到要求。結(jié)論 對采樣、檢測、試劑等做好質(zhì)量控制，儀器性能優(yōu)越，實(shí)驗(yàn)室開展新冠病毒核酸檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

關(guān)鍵詞：新型冠狀病毒核酸檢測影響因素 采樣環(huán)節(jié) ?儀器精密度驗(yàn)證 ?方法最低檢測限驗(yàn)證

【中圖分類號】R563.1 ?【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A ?【文章編號】1673-9026（2021）06-042-02

冠狀病毒根據(jù)血清型和基因組特點(diǎn)分為α、β、γ、δ4個(gè)屬。它們可以感染人類、哺乳動(dòng)物、鳥類、蝙蝠等的呼吸系統(tǒng)、胃腸道、肝臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。目前，已知能夠感染人的冠狀病毒有7種，除去我國2003年暴發(fā)的（SARS-CoV）冠狀病毒和2012年中東暴發(fā)的中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERSr-CoV）以外，其余4種感染人的冠狀病毒（HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-OC43和HKU1）可誘發(fā)輕微的上呼吸道感染，新型冠狀病毒SARS-Cov-2是繼上述6種外的第7個(gè)感染人的β屬冠狀病毒。SARS-Cov-2可以通過結(jié)合各種粘膜細(xì)胞上的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶受體進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，與外界相通的氣道粘膜、口腔粘膜，以及眼瞼，眼結(jié)膜均容易暴露感染。

實(shí)時(shí)熒光RT-PCR核酸檢測技術(shù)可高效、快速的完成病毒標(biāo)本的檢測，兼具靈敏度高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，而成為《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》中首推的檢測方法。

為應(yīng)對新冠疫情，鉛山縣疾病預(yù)防控制中心于2020年8月組建了PCR基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室，截至2021年2月完成了包括重點(diǎn)人群，重點(diǎn)場所8000余份樣本的檢測。

以下，本人結(jié)合前期已開展的新型冠狀病毒核酸檢測工作，對可能影響新冠病毒核酸檢測結(jié)果的各環(huán)節(jié)影響因素做一分析評價(jià)。

一 采樣環(huán)節(jié)

影響檢測結(jié)果，造成假陰性的因素很多，其中之一為樣本環(huán)節(jié)，國家感染性疾病臨床醫(yī)學(xué)研究專家一份實(shí)驗(yàn)室研究數(shù)據(jù)表明，陽性病例發(fā)病后0-7天采集的痰液、鼻咽拭子、口咽拭子3種類型的標(biāo)本中，核酸檢測陽性率為60%，隨著病程的發(fā)展這3種類型標(biāo)本陽性率有所降低，根據(jù)“新型冠狀病毒肺炎防控方案（第七版）”中“新型冠狀病毒肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)指南”采集標(biāo)本的類型包括：鼻咽拭子、咽拭子、鼻咽抽取物或呼吸道抽取物、深咳痰液、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液、糞便標(biāo)本、肛拭子、血液標(biāo)本、血清標(biāo)本等。專家研究表明SARS-CoV主要感染下呼吸道和肺部，，病灶主要位于肺外帶近胸膜處，故在標(biāo)本類型方面肺泡灌洗液、支氣管灌洗液、是較好的標(biāo)本類型，但具創(chuàng)傷性和交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。痰液在各個(gè)不同檢測時(shí)間段陽性率為較高，在操作簡便性和安全性優(yōu)于肺泡灌洗液，但臨床患者癥狀多以干咳、無痰為主。此外，鼻咽拭子優(yōu)于口咽拭子。

采樣過程人為操作不當(dāng);樣本收集的時(shí)間過早或過晚;沒有正確的保存、運(yùn)輸和處理樣本;技術(shù)本身存在的原因，如病毒變異、PCR抑制等原因也是導(dǎo)致樣本檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性的因素。

病毒本身在體外很快就會(huì)裂解掉影響后續(xù)檢測，所以在保存及運(yùn)輸時(shí)，就需要加入病毒保存液，目前病毒保存液分為滅活型和非滅活型兩種。

對于不同的檢測目的，需要使用不同的病毒保存液，目前廣泛使用的這兩種保存液各有特點(diǎn)。為了滿足不同的檢測要求，以及不同的病毒檢測實(shí)驗(yàn)室條件，采用不同的保存液是非常有必要的。

滅活型保存液：主要是核酸提取裂解液改良的病毒裂解型保存液。采樣時(shí)內(nèi)含高濃度的胍鹽即可高效滅活病毒，能有效阻止操作員二次感染，但是又含有Rnase抑制劑，能保護(hù)病毒核酸不被降解，從而使后續(xù)能通過NT-PCR進(jìn)行檢測。而且能在常溫下保存相對較長的時(shí)間，節(jié)省了病毒樣品保存以及運(yùn)輸?shù)某杀尽?/p>

非滅活型保存液：主要是以運(yùn)送培養(yǎng)基為基礎(chǔ)改良的病毒維持液型保存液。它能夠保持病毒在體外的活性以及抗原和核酸的完整性，含有Hanks液基礎(chǔ)，慶大霉素，真菌抗生素，BSA （V） ，冷凍保護(hù)劑、生物緩沖劑及氨基酸等，保護(hù)病毒蛋白質(zhì)外殼不易分解，較大程度地保持了病毒樣本的原始性。這種保存液除了用于核酸提取檢測外，還能用于病毒的培養(yǎng)、分離以及抗原的檢測等，但是采樣后長時(shí)間保存需要保持嚴(yán)格低溫。

采樣環(huán)節(jié)所使用的病毒保存液是否符合要求也是保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素，目前，我中心新冠病毒核酸檢測主要使用的是山東天愛醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)的滅活型病毒采樣管，當(dāng)檢測出陽性標(biāo)本需再次采樣送上級培養(yǎng)分離時(shí)則采用非滅活型保存液。

二 檢測環(huán)節(jié)

（一）核酸提取

病毒核酸在裂解結(jié)合緩沖液存在的環(huán)境中釋放并與磁珠相結(jié)合，通過控制磁棒和磁套的運(yùn)動(dòng)實(shí)現(xiàn)磁珠的收集、釋放、轉(zhuǎn)移、進(jìn)而完成核酸的整個(gè)提取過程。核酸提取過程主要包括以下幾個(gè)步驟：

⑴ 吸附：在樣品結(jié)合緩沖液中加入磁珠，充分振蕩混合，釋放出來的核酸吸附到磁珠表面。

⑵ 洗滌：將上述磁珠收集并轉(zhuǎn)移到洗滌緩沖液中，反復(fù)洗滌以除去夾帶的雜質(zhì)。

⑶ 洗脫：把磁珠轉(zhuǎn)移到洗脫緩沖液中，充分振蕩混合后，目標(biāo)核酸即從磁珠表面脫落并溶解到洗脫緩沖液中。

中心使用提取儀為上海之江生物醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)的全自動(dòng)磁珠核酸提取儀，型號EX3600型。提取試劑為上海之江生物科技股份有限公司生產(chǎn)。

在此結(jié)合日常工作，將此環(huán)節(jié)應(yīng)注意的事項(xiàng)總結(jié)如下：

1 ?實(shí)驗(yàn)開始前先清潔并消毒工作臺面、移液器等;

2 ?實(shí)驗(yàn)操作時(shí)使用超凈工作臺，以防止對環(huán)境的污染;

3 ?操作時(shí)使用不含熒光物質(zhì)的一次性手套，為避免交叉污染，手套必要時(shí)及時(shí)更換，使用一次性專用離心管、自卸式移液器和帶濾嘴的吸頭以及提取后應(yīng)轉(zhuǎn)移至無DNA酶和RNA酶的EP管中等;

4 ?為避免因試劑成分不均引起的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定，在使用前將試劑充分混勻，另外，預(yù)裝板使用前應(yīng)短暫離心或輕甩，將E行液體全部至于孔底部。

（二）PCR擴(kuò)增檢測

采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，以新型冠狀病毒2019-nCoV的RFlab和 N基因設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，通過熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)對新型冠狀病毒2019-nCoV核酸的檢測。

該步驟中影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素為儀器和檢測試劑的性能以及人員操作因素，中心目前使用的PCR擴(kuò)增儀為美國伯樂CFX96Touch型PCR擴(kuò)增儀，所使用擴(kuò)增試劑為新型冠狀病毒 2019-nCoV 核酸檢測試劑盒（上海伯杰醫(yī)療科技有限公司）。

為了保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了系列實(shí)驗(yàn)，用以對所使用的儀器和檢測試劑性能進(jìn)行驗(yàn)證。

（1）精密度驗(yàn)證：兩個(gè)不同濃度的陽性參考品分兩組做實(shí)驗(yàn)分別為A組，B組，每組做20個(gè)平衡樣，同時(shí)做陰陽對照。分析陽性參考品檢出率。統(tǒng)計(jì)其2019-nCoVORF1ab基因、N基因、和內(nèi)參基因Cq值，計(jì)算精密度變異系數(shù)和陽性樣本符合率。

對兩組標(biāo)本的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析：兩組陽性參考品ORF1ab基因、N基因和內(nèi)參基因的檢出率為100%。統(tǒng)計(jì)其2019-nCoVORF1ab基因、N基因和內(nèi)參基因Cq值，計(jì)算其精密度變異系數(shù)如表二、表三，變異系數(shù)均低于3%。說明儀器和試劑精密度性能能夠達(dá)到檢測要求。

（2）最低檢測限驗(yàn)證：

檢測方法：取中國計(jì)量科學(xué)研究院的新型冠狀病毒核糖核酸基因組標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，參照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)說明書，對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行稀釋，分別稀釋至ORFlab： 500copies/mL>N： 500copies/mL;每個(gè)重復(fù)檢測20次。且陽性檢出率達(dá)到100%，即可作為預(yù)估的最低檢測限;

上海伯杰醫(yī)療科技有限公司“新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）”在ORFlab基因、N基因濃度為500copies/mL時(shí)，用Bio-Rad CFX96檢測，20個(gè)重復(fù)檢出率為100%，符合最低檢測限要求。

三 結(jié)論

綜上所述，在檢測過程中，對采樣、檢測、試劑等環(huán)節(jié)做好質(zhì)量控制，儀器性能優(yōu)越，能夠保證實(shí)驗(yàn)室開展新冠病毒核酸檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

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鉛山縣疾病預(yù)防控制中心 ?江西上饒 ?334505