張俊杰,彭姍姍,余輝,李碩,楊超,尚益民

(1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.正陽(yáng)縣花生研究所，河南 正陽(yáng) 463600)

隨著生態(tài)農(nóng)業(yè)的深入發(fā)展，傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式向著節(jié)能、減排的環(huán)境友好型農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式轉(zhuǎn)變[1-2]。施用有機(jī)肥可以維持農(nóng)作物的產(chǎn)量和土壤肥力，同時(shí)改善長(zhǎng)期施用化肥造成的土壤板結(jié)及環(huán)境惡化等問(wèn)題[3]。土壤中氮元素主要通過(guò)生物固氮方式獲得。生物固氮對(duì)改善土壤營(yíng)養(yǎng)狀況、解決農(nóng)業(yè)和能源的可持續(xù)發(fā)展問(wèn)題起著十分重要的作用[4]?；ㄉ?ArachishypogaeaL.)是全世界主要的糧食作物之一，也是蛋白質(zhì)和油脂的重要來(lái)源，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[5]。與其他豆科植物一樣，花生能與土壤中的根瘤菌建立互利共生的關(guān)系。豆科植物可以從空氣中吸收大部分氮，而花生以共生固氮方式能獲得其總氮需求量的55%[6-8]。因此，篩選高效的花生根瘤菌是促進(jìn)根瘤菌作為土壤菌劑以及減少化學(xué)肥料使用的關(guān)鍵[9]。此外，花生的基因型、根瘤菌株和環(huán)境條件對(duì)于氮固定效率的影響很大[10-13]，這種可變性與共生菌和宿主植物的識(shí)別能力相關(guān)[14-16]，反映出宿主復(fù)雜的進(jìn)化歷史以及共生體為適應(yīng)特定的宿主和地理區(qū)域發(fā)生的共生基因水平轉(zhuǎn)移[17-18]。

目前，有關(guān)花生根瘤菌多樣性的研究較多，并報(bào)道了一些共生根瘤菌種群[19-21]。然而，河南省花生根瘤菌多樣性尚未得到系統(tǒng)調(diào)查，僅在其他省份研究的同時(shí)涉及到少數(shù)菌株，并被鑒定為慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)[22-23]。河南省花生種植面積居中國(guó)首位，而河南省正陽(yáng)縣又多次被評(píng)為“全國(guó)花生種植第一大縣”[24]。目前，正陽(yáng)縣與中國(guó)工程院院士張新友團(tuán)隊(duì)合作，引入優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)抗病品種遠(yuǎn)雜9102，大面積種植，產(chǎn)量顯著提高[25]。因此，對(duì)當(dāng)?shù)毓采鼍N群的分布以及能與當(dāng)?shù)鼗ㄉ贩N建立高效共生關(guān)系的花生根瘤菌進(jìn)行研究就十分重要。本研究選取從河南省正陽(yáng)縣土壤分離出的花生根瘤菌作為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)該地區(qū)共生根瘤菌的捕捉和鑒定，調(diào)查遺傳多樣性，對(duì)于該地區(qū)高效優(yōu)良花生根瘤菌菌種的選育以及提高花生產(chǎn)量意義重大。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試花生種子為遠(yuǎn)雜9102，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花油料作物研究所提供。供試土壤取自河南省正陽(yáng)縣陡溝鎮(zhèn)周灣村的潮土(ZA)和水稻土(ZB)，其中潮土取自小麥和花生輪作模式的農(nóng)田，水稻土取自小麥和水稻輪作模式的農(nóng)田。試劑均購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純。

1.2 采樣點(diǎn)土壤理化性質(zhì)的測(cè)定

采樣點(diǎn)的土壤經(jīng)過(guò)粉碎過(guò)2 mm篩，收集約100 g土壤樣品。理化性質(zhì)的測(cè)定委托河南省百恩信技術(shù)檢測(cè)公司完成。利用SPASS v16.0數(shù)據(jù)分析軟件分析測(cè)定結(jié)果。

1.3 花生根瘤菌的捕捉與分離

花生種子在無(wú)菌條件下用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇處理30 s，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的升汞消毒5 min，無(wú)菌水清洗7～8次，保持暗培養(yǎng)環(huán)境，28 ℃培育至種子萌發(fā)后加入植物低氮營(yíng)養(yǎng)液，蛭石拌勻，間歇滅菌。采用雙層缽裝置種植花生，上層缽體中裝入無(wú)菌蛭石并移種發(fā)芽種子，下層缽體中儲(chǔ)水，中間靠紗布條連接，為植株生長(zhǎng)提供水分。栽種完成后將其置于人工氣候培養(yǎng)箱(杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司，RIH-1000B)，生長(zhǎng)45 d，將花生根部取出，剪下根瘤進(jìn)行消毒處理。逐個(gè)搗碎根瘤，在YMA固體培養(yǎng)基(配方見(jiàn)文獻(xiàn)[26])上“Z”字形畫(huà)線，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出單菌落。

1.4 花生根瘤菌DNA的提取

參照TEREFEWORK[27]的標(biāo)準(zhǔn)方法，在TY液體培養(yǎng)基(配方見(jiàn)文獻(xiàn)[27])上接種菌株單菌落，28 ℃培養(yǎng)7 d，使用臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，TGL-16G)12 000 r·min-1離心1 min收集菌體，經(jīng)異硫氰酸胍(GUTC，北京索萊寶有限公司，分析純)裂解，硅藻土吸附，最后用雙蒸水溶解，獲得供試菌株的基因組，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)通過(guò)的樣品于-20 ℃保存。

1.5 16S-23S rRNA基因間隔區(qū)段的PCR-RFLP

IGS PCR擴(kuò)增使用引物IGS 1490/132′[28]，由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，于-20 ℃保存。

IGS PCR產(chǎn)物選用3 種限制性?xún)?nèi)切酶(MspⅠ、AluⅠ和HaeⅢ，上海生工生物工程股份有限公司)進(jìn)行酶切[28]。所有酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠檢測(cè)，用DNI 凝膠成像系統(tǒng)(DNI bio-imaging system，MiniBIS Pro)記錄酶切結(jié)果，對(duì)大于100 bp的酶切條帶標(biāo)注后進(jìn)行分析，根據(jù)酶切條帶的數(shù)量及大小分別進(jìn)行分型。

1.6 代表菌株16S rRNA 的序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析

參照張俊杰[28]的方法，根據(jù)捕捉分離的花生根瘤菌IGS分型結(jié)果，結(jié)合2個(gè)采樣地點(diǎn)的分布情況挑選代表菌株，以采樣點(diǎn)代號(hào)和數(shù)字命名，然后使用引物P1/P6進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增[28]。所有代表菌株的PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠檢測(cè)，由上海生工生物工程股份有限公司完成測(cè)序。將經(jīng)DNAMAN軟件拼接后完整的16S rRNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中同源序列進(jìn)行比對(duì)，選擇相似性較高的同源序列，保存FASTA格式在文本文檔中。選用MEGA 7.0軟件的Clustal W功能進(jìn)行序列比對(duì)，構(gòu)建Maximum Like hood(ML)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.7 代表菌株持家基因和共生基因PCR擴(kuò)增測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析

所有供試代表菌株進(jìn)行持家基因(recA、atpD、glnII)和共生基因(nodA、nifH)的 PCR擴(kuò)增[28]，recAPCR使用引物recA41F/640R；atpD PCR使用引物atpD225F/782R；glnIIPCR使用引物glnII12F/689R；nodAPCR使用引物nodA-1/-2[29]；nifHPCR使用引物nifHF/R。所有代表菌株的PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠檢測(cè)，然后由上海生工生物工程股份有限公司完成測(cè)序。按照方法1.5，用MEGA 7.0對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。在物種進(jìn)化過(guò)程中，幾乎所有的基因都在一定程度上發(fā)生了水平轉(zhuǎn)移，單個(gè)基因的系統(tǒng)發(fā)育不能反映物種的系統(tǒng)發(fā)育，因此對(duì)持家基因進(jìn)行多位點(diǎn)序列分析(multi locus sequence analysis，MLSA)，并在相似性97%水平上進(jìn)行分類(lèi)鑒定[30-31]。

1.8 代表菌株回接驗(yàn)證及共生效率檢測(cè)

將發(fā)芽2～3 cm的種子，在無(wú)菌條件下移植到滅菌蛭石中，接種代表菌株菌液1 mL(OD600=0.8)，共計(jì)11株代表菌株。每種菌液接種3盆植株，不接種菌液的3盆植株為對(duì)照組，共計(jì)種植36盆，最后用封口膜封口，在光照氣候箱中生長(zhǎng)45 d(初花期)。在收獲期對(duì)植物的結(jié)瘤數(shù)目、葉片葉綠素含量、地上部干質(zhì)量和地下部干質(zhì)量、株高度、根長(zhǎng)度等相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行收集[32]，用于評(píng)估代表菌株共生效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)分析

2種不同土壤類(lèi)型樣品的理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果如表1所示。2種土壤除了在總鹽含量上沒(méi)有構(gòu)成顯著性差異外，其余各個(gè)理化因子均構(gòu)成顯著性差異，并且ZA中的有機(jī)質(zhì)、總氮、速效鉀含量和pH值均低于ZB，而ZA的有效磷含量明顯高于ZB，這表明2種類(lèi)型土壤理化因子差異明顯。

表1 采樣點(diǎn)的土壤基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physiochemical properties of soils from different sampling sites

2.2 根瘤菌的分離、純化及保藏

隨機(jī)選取表面完整且呈粉紅色的根瘤進(jìn)行根瘤菌的分離，共計(jì)分離得到67株能與花生共生的根瘤菌菌株，分離菌株在YMA固體培養(yǎng)基上以28 ℃培養(yǎng)7～10 d后，形成2～4 mm的單菌落，并采用3次畫(huà)線的方式對(duì)其進(jìn)行純化。將所得菌株暫時(shí)保存在YMA斜面上，同時(shí)取對(duì)數(shù)期菌液與體積分?jǐn)?shù)50%甘油混合長(zhǎng)期保存于-80 ℃冰箱中。

2.3 供試菌株IGS PCR-RFLP結(jié)果與分析

根據(jù)1.5方法，對(duì)所有供試菌株酶切圖譜的分析，67株花生供試菌株被分為9種IGS類(lèi)型，選取其中11株作為代表菌株，結(jié)果見(jiàn)表2。IGS 1和2類(lèi)型為主導(dǎo)類(lèi)群，共計(jì)包含40株供試菌株，占所有供試菌株的59.70%；IGS 3和4類(lèi)型共計(jì)包含12株供試菌株，在ZA和ZB均有分布；IGS 5、6、7和9類(lèi)型共計(jì)13株供試菌株，僅在ZA中發(fā)現(xiàn)；IGS 8類(lèi)型中僅包含2株供試菌株，且僅在ZB中發(fā)現(xiàn)。

表2 花生根瘤菌的具體分型及地理分布結(jié)果Table 2 Grouping results and geographic distribution of the Bradyrhizobium isolates associated with Arachis hypogaea L.

2.4 16S rRNA的測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)方法1.6對(duì)代表菌株進(jìn)行16S rRNA 測(cè)序，并利用Mega 7.0 軟件，選用T92+G+I模型對(duì)代表菌株進(jìn)行ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建與分析，結(jié)果如圖1所示。9株代表菌株分布在1個(gè)大的進(jìn)化枝中，其序列相似性范圍為99.5%～100%，與慢生根瘤菌屬已知種模式菌株廣東慢生根瘤菌(B.guangdongense) CCBAU 51649T、廣州慢生根瘤菌(B.guangzhouense) CCBAU 51670T、贛州慢生根瘤菌(B.ganzhouense) RITF806T、硝基還原慢生根瘤菌(B.nitroreducens) TSA1T和B.cytisiCTAW11T的序列相似性在99.5%～100%之間，與該屬其他已知種群模式菌株的序列相似性均≥96.2%，與根瘤菌屬模式菌株葡萄根瘤菌(R.lusitanum) P1-7T的相似性 ≤ 88.1 %，所以供試菌株被鑒定屬于慢生根瘤菌屬。

圖1 基于代表菌株16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 The phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequences of the representatives

2.5 持家基因recA、atpD和glnII的多位點(diǎn)序列分析

根據(jù)方法1.7對(duì)代表菌株的持家基因recA、atpD和glnII進(jìn)行多位點(diǎn)序列分析，并利用Mega 7.0 軟件，選用GTR+G+I模型進(jìn)行ML聚樹(shù)及系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果如圖2所示。11個(gè)代表菌株在recA(350 bp)、atpD(428 bp)和glnII(441 bp)串聯(lián)序列的系統(tǒng)發(fā)育分析中，序列相似性在97%的水平上可以劃分為7個(gè)簇(Cluster)，如表3所示，其序列相似性在為92.3%～98.7%。Cluster 1中ZA2、ZB7、ZB16和ZB30與已知模式菌株廣東慢生根瘤菌CCBAU 51649T聚為1個(gè)分支，其序列相似性為98.6%～100%，因此該分支的代表菌株可以被鑒定為廣東慢生根瘤菌。Cluster 2中代表菌株ZA22和ZB15單獨(dú)聚為1個(gè)分支，與已知模式菌株的序列相似性 ≤ 94.9%。Cluster 3包含1株代表菌株，與已知模式菌株廣州慢生根瘤菌 CCBAU 51670T的序列相似性為96.7 %。Cluster 4、5、6和7中都僅包含1株代表菌株，與已知模式菌株的序列相似性均 ≤ 97.0%。由此，Cluster 2、3、4、5、6和7為5個(gè)疑似新種群：Bradyrhizobiumgensp.Ⅰ、Bradyrhizobiumgensp.Ⅱ、Bradyrhizobiumgensp.Ⅲ、Bradyrhizobiumgensp.Ⅳ、Bradyrhizobiumgensp.Ⅴ和Bradyrhizobiumgensp.Ⅵ。

圖2 代表菌株的持家基因合并序列(recA-atpD-glnII)MLSA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 The phylogenetic tree of MLSA based on concatenated sequences of recA-atpD-glnII

表3 花生根瘤菌的分類(lèi)學(xué)地位Table 3 The taxonomic status of the Bradyrhizobium isolates associated with Arachis hypogaea L.

2.6 共生基因nifH和nodA的系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)方法1.7，對(duì)代表菌株的共生基因nifH和nodA進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，利用Mega 7.0 軟件，分別選用模型T92+G和T92+I進(jìn)行ML聚類(lèi)分析，結(jié)果如圖3和圖4所示。在nifH系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，除ZA7外的所有代表菌株與廣東慢生根瘤菌CCBAU 51649T和廣州慢生根瘤菌 CCBAU 51670T聚為1個(gè)分支，其序列相似性為100 %。代表菌株ZA7單獨(dú)與硝基還原慢生根瘤菌 TSA1T聚為1個(gè)小的分支，其序列相似性為95.3%，遺傳距離較遠(yuǎn)。但是代表菌株在nodA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，所有代表菌株與廣州慢生根瘤菌 CCBAU 51670T、廣西慢生根瘤菌(B.guangxiense) CCBAU 53363T和廣東慢生根瘤菌 CCBAU 51649T聚為1個(gè)獨(dú)立的分支，序列相似性為100%，其宿主均為花生，并且在回接驗(yàn)證試驗(yàn)中所有的代表菌株均能與花生共生結(jié)瘤。

圖3 代表菌株共生基因nifH的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of symbiotic gene nifH of the representatives

圖4 代表菌株共生基因nodA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of symbiotic gene nodA of the representatives

2.7 代表菌株回接結(jié)瘤效果驗(yàn)證及共生效果檢驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)IGS-RFLP的結(jié)果，挑選11株代表菌株進(jìn)行回接驗(yàn)證及共生效果的數(shù)據(jù)采集，回接驗(yàn)證所用花生品種為遠(yuǎn)雜9102。未接種的對(duì)照組(CK)不結(jié)瘤，所有代表菌株均能與花生共生結(jié)瘤(圖5-A)。與對(duì)照組相比，花生在接種分離菌株后，植株葉片葉綠素含量、地上部干質(zhì)量和地下部干質(zhì)量、株高度、根長(zhǎng)度均有所提高，并與對(duì)照組構(gòu)成顯著差異。接種ZB30的處理組葉綠素含量最高，為47.37(圖5-B)，地上部干質(zhì)量也表現(xiàn)出相同的情況(圖5-C)，有4株代表菌株接種的花生植株的地上部干質(zhì)量與對(duì)照組相比增加1倍以上，其中接種ZB30的處理組地上部干質(zhì)量是CK組的2.7倍。接種菌株后的花生植株的地下部干質(zhì)量差異較大，其中接種ZB30的花生植株地下部干質(zhì)量為2.30 g，顯著高于其他各處理組(圖5-D)。所有代表菌株接種的花生植株在株高度和根長(zhǎng)度方面也表現(xiàn)出不同程度的差異(圖5-E，圖5-F)。

注：不同字母表示P<0.05時(shí)顯著差異。Note: Different letters are indicated significantly different at P<0.05.

3 結(jié)論與討論

本研究首次對(duì)河南省正陽(yáng)縣陡溝鎮(zhèn)周灣村花生根瘤菌的多樣性進(jìn)行了研究，為當(dāng)?shù)鼗ㄉ姆N植選育匹配高效的根瘤菌種提供指導(dǎo)。本研究共分離獲得67株花生根瘤菌菌株，通過(guò)IGS PCR-RFLP、16S rRNA，持家基因(recA、atpD、glnII)以及共生基因(nodA和nifH)基因的系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)所有供試菌株進(jìn)行遺傳多樣性研究。首先，通過(guò)IGS PCR-RFLP 把所有供試菌株分為11種IGS類(lèi)型，表明了該地區(qū)的花生根瘤菌菌株具有較高的遺傳多樣性，其次通過(guò)對(duì)供試菌株的16S rRNA測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析表明了所有供試菌株為慢生根瘤菌屬，進(jìn)而通過(guò)MLSA(recA-atpD-glnII)分析表明，所有供試菌株可以被鑒定為廣東慢生根瘤菌和6個(gè)同屬的疑似新種群。在回接試驗(yàn)中，所有代表菌株均能與花生植株共生結(jié)瘤，各項(xiàng)指標(biāo)均有顯著提升。師尚禮等[33]通過(guò)采集農(nóng)田中的花生根瘤進(jìn)行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)僅有慢生根瘤菌屬和根瘤菌屬能與花生有效結(jié)瘤，表明慢生根瘤菌屬是花生主要的共生體[18,34]。陳靜瑜等[35]通過(guò)對(duì)廣東省花生根瘤菌的遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)216株分離菌株分別屬于高效固氮慢生根瘤菌(B.diazoefficiens)、圓明慢生根瘤菌(B.yuanmingense)、花生慢生根瘤菌(B.arachidis)、廣東慢生根瘤菌、廣西慢生根瘤菌、B.iriomotense和遼寧慢生根瘤菌(B.liaoningense)以及14株疑似慢生根瘤菌的新種群。

根瘤菌是革蘭氏陰性菌，在土壤中廣泛存在。吳忠梅等[25]研究表明，根瘤菌可能會(huì)受到宿主植物和環(huán)境的影響，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的演變和進(jìn)化，形成表型和基因型的高度多樣性。李智燕等[36]的研究表明，一般苜蓿根瘤菌在中性或中堿性的土壤中結(jié)瘤固氮效果最好，而在酸性土壤中效果較差。劉鵬等[37]研究表明，根瘤菌在偏酸性的土壤中，能正常結(jié)瘤固氮并促進(jìn)花生植株生長(zhǎng)，說(shuō)明花生根瘤菌具有較好的適應(yīng)酸性土壤的能力。本研究中采集的土壤經(jīng)過(guò)檢測(cè)是酸性和中性偏酸，捕獲的根瘤菌經(jīng)過(guò)分析具有多種IGS類(lèi)型，表明花生根瘤菌能較好地適應(yīng)酸性土壤，這與東北地區(qū)中性偏酸土壤環(huán)境中主要存在慢生根瘤菌屬的種群的研究結(jié)果相一致[35]。本研究中ZA潮土和ZB水稻土均發(fā)現(xiàn)了獨(dú)有的IGS類(lèi)型，推測(cè)是土壤采樣點(diǎn)為小麥/水稻和花生的輪作種植模式導(dǎo)致的，即物種豐富度與采樣點(diǎn)的作物種植歷史和土壤類(lèi)型有關(guān)，這與NKOT等[38]和YANG等研究結(jié)果一致[39]。