基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討黃芪抗肝癌的作用機(jī)制研究

姚 紅，任晉宏，侯宇芯，王禹璇，薛慧清，李青山

山西中醫(yī)藥大學(xué) 基于炎性反應(yīng)的重大疾病創(chuàng)新藥物山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030619

黃芪為豆科植物蒙古黃芪和膜莢黃芪的干燥根，產(chǎn)于中國(guó)東北、華北及西北，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)，益衛(wèi)固表，利水消腫，消毒排膿之功效[1]。研究表明通過(guò)各種癌癥模型和細(xì)胞系，已發(fā)現(xiàn)黃芪能對(duì)腫瘤細(xì)胞直接抗增殖或促凋亡作用來(lái)縮小或穩(wěn)定腫瘤[2]。黃芪注射液對(duì)不同時(shí)期的肝癌均具有一定程度的抑制細(xì)胞增殖活性作用，具體機(jī)制為,黃芪注射液通過(guò)G1/S期阻滯和caspase-9/3途徑激活抑制細(xì)胞增殖活性并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制肝癌的發(fā)展[3]。黃芪注射液中分離得到黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)、蒽醌類(lèi)和芳香烴等其它化合物[4]?？偨Y(jié)了近年黃酮類(lèi)化合物在抗腫瘤作用機(jī)制及藥效學(xué)方面的進(jìn)展[5]，其抗肝癌作用靶點(diǎn)及機(jī)制尚不完全明確，本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法搜集出黃芪中潛在的有效物質(zhì)，并對(duì)抗肝癌作用靶點(diǎn)及藥效進(jìn)行研究，為后期黃芪抗肝癌分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)。

肝癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)居第二位。在肝癌的早期階段，手術(shù)切除，肝移植，局部消融和其他治療方法可以提高患者的生存率[6]。肝癌是一種多基因疾病，具有復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，單一的治療方式很難取得成功的治療效果。因此，利用靶向藥物調(diào)控多種信號(hào)通路已成為肝癌治療的新范式[7]。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株

人源肝癌細(xì)胞株HepG2為山西中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞室保存。

1.2 藥品與試劑

藥品：槲皮素(貨號(hào)MB2127：大連美侖生物技術(shù)有限公司研制)；山奈酚(貨號(hào)MB6888：大連美侖生物技術(shù)有限公司研制)；毛蕊異黃酮(貨號(hào)MB6778：大連美侖生物技術(shù)有限公司研制)；華良姜素(貨號(hào)B30148：上海源葉生物科技有限公司)；芒柄花素(貨號(hào)485723：大連美侖生物技術(shù)有限公司研制)；異鼠李素(貨號(hào)S9111：selleckchem)

試劑：胎牛血清與DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco)；青-鏈霉素與胰蛋白酶(博士德生物工程有限公司)；MTT與DMSO(北京索萊寶科技有限公司)；Trizol、擴(kuò)增與逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)。

1.3 儀器

生物安全柜、CO2培養(yǎng)箱(新加坡ESCO公司)；離心機(jī)(中國(guó)中科中佳公司)；熒光定量PCR儀(美國(guó)Thermo公司)；Multiskan FC酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)；

2 方法

2.1 數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件

本研究使用的數(shù)據(jù)庫(kù)有，PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ ),String (https://string-db.org/cgi/input.pl)，TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，Genecards (https://www.genecards.org)，Uniprot(https://www.uniprot.org)，OMIM(http://www.omim.org)，微生信(www.bioinformatics.com.cn)，PBD(http://www.rcsb.org)，VENNY2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)，Swiss Target prediction(http://www.swisstargetprediction.ch)，和DAVID 6.7(https://david.ncifcrf.gov)；軟件有GraphPad 5.0；Cytoscape 3.7.2及SYBYL-X 2.0。

2.2 黃芪化學(xué)成分篩選及作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP)進(jìn)行黃芪活性成分的查詢(xún)及篩選。以生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類(lèi)藥性(drug-like，DL)≥0.18的化合物作為候選成分，查找每個(gè)活性成分以Drug Bank為參考范圍的相關(guān)靶點(diǎn)。通過(guò)Unitprot數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)范蛋白靶點(diǎn)名稱(chēng)。在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中根據(jù)成分名稱(chēng)查詢(xún)相應(yīng)的SMILES號(hào)且在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)根據(jù)SMILE號(hào)預(yù)測(cè)活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。所有主要活性成分經(jīng)過(guò)預(yù)測(cè)、檢索和校對(duì)去重后，確認(rèn)與主要活性成分相關(guān)的靶蛋白信息。把TCMSP平臺(tái)中的靶點(diǎn)與Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)中的靶點(diǎn)合并刪除重復(fù)值。

2.3 肝癌疾病靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

利用Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)及OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站檢索以“l(fā)iver cancer”為關(guān)鍵詞，其中Genecards以Relevance score≥20為參考值，獲取疾病肝癌相關(guān)的基因。

2.4 黃芪活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)相映射構(gòu)建核心靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)

獲得黃芪活性成分的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)以及肝癌的靶點(diǎn)蛋白之后，取兩者的交集靶點(diǎn)蛋白，在String數(shù)據(jù)庫(kù)繪制蛋白-蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)，用Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可視化處理。使用插件CytoNCA來(lái)評(píng)估交叉點(diǎn)。CytoNCA提供了三種中心度度量來(lái)過(guò)濾數(shù)據(jù)，包括度中心度(degree centrality，DC)、接近度中心度(closeness centrality，CC)及中間中心度(betweenness centrality，BC)。首先，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行“DC≥2×DC中位數(shù)”的篩選標(biāo)準(zhǔn)，然后通過(guò)“DC，BC和CC大于或等于其中位數(shù)”的篩選標(biāo)準(zhǔn)將其篩選為核心目標(biāo)[8]。

2.5 核心靶點(diǎn)基因功能富集和通路富集分析

采用DAVID 6.7數(shù)據(jù)庫(kù)[9]對(duì)黃芪抗癌靶點(diǎn)進(jìn)行基因生物過(guò)程(GO)富集分析與信號(hào)通路(KEGG)富集分析，限定物種為Homo sapiens，獲得GO功能富集分析結(jié)果(P<0.05)及KEGG 信號(hào)通路富集分析結(jié)果(P<0.05)，利用微生信平臺(tái)對(duì)KEGG通路和GO富集分析進(jìn)行可視化分析。利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“黃芪成分-靶點(diǎn)-KEGG通路-肝癌” 網(wǎng)絡(luò)。

2.6 藥物成分-核心靶點(diǎn)分子對(duì)接

篩選出的主要活性成分通過(guò)PubChem下載其“SDF”格式，導(dǎo)入SYBYL-X 2.0軟件進(jìn)行優(yōu)化修飾；將“1.4”項(xiàng)下篩選的主要蛋白靶點(diǎn)通過(guò)PDB數(shù)據(jù)庫(kù)。篩選條件設(shè)定如下：1)通過(guò)X-晶體衍射獲得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；2)蛋白質(zhì)的晶體分辨率均方根偏差(RMSD)值越小越好；3)分子對(duì)接文獻(xiàn)中報(bào)道的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的優(yōu)先選擇；4)該生物來(lái)自Homo sapiens。選擇其最佳蛋白晶體結(jié)構(gòu)，并下載其“pdb”格式文件。導(dǎo)入Surflex-Dock軟件[10]去除小分子配體、所有氨基酸及水分子，尋找蛋白靶點(diǎn)與活性成分靶點(diǎn)的最相接的小分子，對(duì)其加氫進(jìn)行分子對(duì)接，通過(guò)對(duì)接分值來(lái)判斷其結(jié)合活性。

2.7 MTT法驗(yàn)證

從山西醫(yī)科大學(xué)成鐘老師獲得的人肝癌細(xì)胞株HepG2復(fù)蘇，加入含10%胎牛血清與1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，放置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

將HepG2接種到96孔板中，每孔細(xì)胞密度為0.8×104個(gè)。細(xì)胞貼壁后，分別加入100 μmol/L的槲皮素、毛蕊異黃酮、山奈酚、芒柄花素、異鼠李素及華良姜素，培養(yǎng)48 h。前期每孔加入濃度為0.1 mg/mL MTT在37 ℃黑暗中進(jìn)行4 h的培養(yǎng)，在后期培養(yǎng)中，去除培養(yǎng)基，添加100 μL的DMSO。Multiskan FC酶標(biāo)儀(檢測(cè)吸光度OD值，波長(zhǎng)490 nm)。

2.8 RT-qPCR分析

篩選出抑制效果較好的一個(gè)化合物進(jìn)行定量RT-qPCR分析，將HepG2細(xì)胞加入3、15、75 μmol/L的華良姜素處理48 h。按照制造商的說(shuō)明，使用Trizol試劑從HepG2細(xì)胞中提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。RT-qPCR的步驟如下：在95 ℃預(yù)變性15 min，在95 ℃變性10 s，在60 ℃退火20 s，在72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。

2.9 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad 5.0進(jìn)行處理，在方差齊性條件下采用單因素方差分析One-way ANOVA，P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 黃芪化學(xué)成分篩選及作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP)檢索黃芪化學(xué)成分，以生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30 %、類(lèi)藥性(drug-like，DL)≥0.18為篩選條件，得到20個(gè)黃芪化學(xué)成分，如表1，在TCMSP平臺(tái)與Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)中的靶點(diǎn)，去重后得到202個(gè)靶點(diǎn)。

表1 黃芪活性成分信息

續(xù)表1(Continued Tab.1)

3.2 肝癌疾病靶點(diǎn)的篩選

以Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)及OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，分別獲取肝癌相關(guān)的疾病靶點(diǎn)1063個(gè)和441個(gè)，將上述肝癌相關(guān)靶基因與202個(gè)預(yù)測(cè)靶基因輸入Venny 2.1.0數(shù)據(jù)庫(kù)取交集和構(gòu)建韋恩圖(見(jiàn)圖 1)，獲得共同靶基因88個(gè)，即黃芪潛在抗肝癌作用靶點(diǎn)。

圖1 黃芪潛在抗肝癌作用靶點(diǎn)篩選Fig.1 Screening of potential anti-liver cancer targets of Astragalus Radix

3.3 蛋白-蛋白互作PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述88個(gè)靶基因上傳至String平臺(tái)，物種設(shè)定為“Homo sapiens”，其余參數(shù)默認(rèn)，獲得蛋白相互作用數(shù)據(jù)信息；然后導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中繪制PPI網(wǎng)絡(luò)。PPI網(wǎng)絡(luò)中共有88個(gè)節(jié)點(diǎn)(靶基因)通過(guò)473條邊發(fā)生相互作用(見(jiàn)圖2)。根據(jù)degree值來(lái)設(shè)定節(jié)點(diǎn)的大小和顏色深淺，靶基因的degree值越大相對(duì)應(yīng)的節(jié)點(diǎn)越大和顏色越深，而2個(gè)靶基因之間關(guān)系值的評(píng)分(combine score)高低則由邊的粗細(xì)表示，即combine score越高則邊的線(xiàn)條越粗。使用CytoNCA通過(guò)拓?fù)浞治鰧?duì)PPI網(wǎng)絡(luò)的交叉點(diǎn)進(jìn)行了中央網(wǎng)絡(luò)評(píng)估，根據(jù)DC≥31、BC≥0.056和CC≥0.595 5總共篩選了6個(gè)潛在的核心目標(biāo)(見(jiàn)表2)。通過(guò)拓?fù)渑cPPI分析結(jié)果表明TP53、MAKP1、AKT1、IL6、MAPK8及VEGFA可以被認(rèn)為是黃芪抗肝癌的關(guān)鍵靶基因。且六個(gè)靶點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的黃芪活性成分有槲皮素、山奈酚、毛蕊異黃酮、芒柄花素、異鼠李素與華良姜素(如表3)。

表2 6個(gè)潛在核心目標(biāo)的拓?fù)鋮?shù)

圖2 黃芪潛在抗肝癌靶點(diǎn) PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Astragalus Radix potential anti-liver cancer target PPI network

表3 關(guān)鍵靶點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的化合物

續(xù)表3(Continued Tab.3)

3.4 核心靶點(diǎn)GO功能富集和KEGG通路富集分析

將黃芪治療肝癌88個(gè)靶點(diǎn)上傳至DAVID生物信息在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO富集分析，以P<0.05作為蛋白質(zhì)生物學(xué)功能具有顯著性的反應(yīng)，確定GO分析總數(shù)為487條，其中生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)372條，主要涉及序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的正向調(diào)控、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、RNA聚合酶II啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)等；細(xì)胞成分(cell component，CC)48條，涉及細(xì)胞核、細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外空間、核染色質(zhì)、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等；分子功能(molecular function，MF)67條，與蛋白磷酸酶結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控DNA結(jié)合、細(xì)胞因子活性、MAP激酶活性等相關(guān)。均取排名靠前的10個(gè)條目作圖(見(jiàn)圖3)。

圖3 黃芪活性成分潛在抗肝癌靶點(diǎn)的生物過(guò)程分析柱狀圖Fig.3 A histogram of the biological process analysis of the potential anti-liver cancer targets of the active ingredients of Astragalus Radix

黃芪抗癌靶點(diǎn)獲得KEGG通路富集分析，得到100條通路(P<0.05)，按富集基因數(shù)目排序后取前20條信號(hào)通路作圖(見(jiàn)圖4)。黃芪抗肝癌的主要靶點(diǎn)主要涉及PI3K-Akt 信號(hào)通路(20個(gè)靶點(diǎn)占23%)、Hepatitis B信號(hào)通路(15個(gè)靶點(diǎn)占18%)、HIF-1信號(hào)通路(13個(gè)靶點(diǎn)占16%)及腫瘤壞死因子TNF信號(hào)通路(13個(gè)靶點(diǎn)占16%)等。研究報(bào)道山奈酚通過(guò)下調(diào)AKT和FAK通路抑制腎癌細(xì)胞的侵襲和遷移[11]。黃芪提取物[12]通過(guò)PI3K/AKT/mTOR途徑抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，證實(shí)了黃芪提取物的抗腫瘤作用。

圖4 黃芪抗肝癌關(guān)鍵靶點(diǎn)參與的通路富集信息柱狀圖Fig.4 A histogram of information enrichment of pathways involved in key targets of Astragalus Radix anti-liver cancer

為了系統(tǒng)和全面地解釋黃芪抗肝癌的作用機(jī)制，使用Cytoscape軟件構(gòu)建了藥物化合物-核心靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖5)。結(jié)果如圖5所示，6個(gè)黃芪主要活性成分節(jié)點(diǎn)、6個(gè)靶基因，20個(gè)KEGG信號(hào)通路節(jié)點(diǎn)。節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)的邊代表發(fā)生相互作用的活性成分、肝癌靶基因和通路之間的聯(lián)系，這些途徑與6中心靶標(biāo)緊密相互作用。

圖5 “黃芪-成分-靶點(diǎn)-KEGG通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)Fig.5 "Astragalus Radix-components-targets-KEGG pathway-disease" network

3.5 活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接

基于PPI網(wǎng)絡(luò)的分析，選取黃芪中6個(gè)活性成分與6個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)得蛋白ID編號(hào)為3q05(TP53)、1unq(AKT1)、4nif(MAPK1)、4nci(IL6)、4yr8(MAPK8)及4zff(VEGFA)。一般認(rèn)為，Dock系統(tǒng)對(duì)接分?jǐn)?shù)>4.25時(shí)，表明分子與靶點(diǎn)之間存在結(jié)合活性，對(duì)接分?jǐn)?shù)>5.0證明結(jié)合活性較高，對(duì)接分?jǐn)?shù)>7.0說(shuō)明兩者存在強(qiáng)烈的結(jié)合活性[13]，對(duì)接分?jǐn)?shù)≥7.0的活性成分利用Surflex-Dock軟件繪制氫鍵圖和飄帶圖(見(jiàn)圖6)，由圖可見(jiàn)，槲皮素與TP53在SER-241、ARG-248、ARG-273、VAL-274、ALA-276、CYS-277和ARG-280處形成氫鍵；與MAPK1在THR-110、MET-108、LYS-114、ASP-111、GLN-105、ILE-103和LYS-54處形成氫鍵；異鼠李素與TP53在SER-240/SER-241、ARG-273、VAL-274、THR-284、ALA-276和ARG-280處形成氫鍵；與MAPK1在A(yíng)SP-111、LYS-151、ASP-167，AR-67和ALA-35處形成氫鍵；與MAPK8在A(yíng)RG-192、HIS-230、ASN-284和SER-249處形成氫鍵；山奈酚與MAPK1在THR-110、LYS-114、ASP-111、AEG-67、GLY-37、LYS-151和ASP-167處形成氫鍵；芒柄花素與MAPK1在LYS-54和SER-153處形成氫鍵；毛蕊異黃酮與MAPK1在A(yíng)SP-167、ARG-67和LYS-114處形成氫鍵。華良姜素與MAPK1在LYS-54、LYS-151、LYS-153、ASP-111和LYS-114處形成氫鍵。

圖6 黃芪活性成分-核心蛋白對(duì)接模式Fig.6 Astragalus Radix active ingredient-core protein docking mode注：a：槲皮素與TP53對(duì)接圖(7.432 0)；b：槲皮素與MAPK1對(duì)接圖(7.034 0)；c：山奈酚與MAPK1對(duì)接圖(8.090 7)；d：異鼠李素與TP53對(duì)接圖(8.513 4)；e：異鼠李素與MAPK1對(duì)接圖(8.806 8)；f：異鼠李素與MAPK8對(duì)接圖(7.095 5)；g：芒柄花素與MAPK1對(duì)接圖(7.684 2)；h：毛蕊異黃酮與MAPK1對(duì)接圖(8.468 0)；i：華良姜素與MAPK1對(duì)接圖(7.794 4)。Note: a: Docking diagram of quercetin and TP53 (7.432 0);b: Docking diagram of quercetin and MAPK1 (7.034 0);c: Docking diagram of kaempferol and MAPK1(8.090 7);d: Docking diagram of isorhamnetin and TP53 (8.513 4);e: Docking diagram of isorhamnetin and MAPK1(8.806 8);f: Docking diagram of isorhamnetin and MAPK8(7.095 5);g: Docking diagram of formononetin and MAPK1 (7.684 2);h: Docking diagram of calycosin and MAPK1 (8.468 0);i: Docking diagram of jaranol and MAPK1(7.794 4).

3.6 MTT法

分子對(duì)接結(jié)果探究這6種黃芪活性成分對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的影響，采用MTT法初步篩選。在同一濃度下，與對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)華良姜素對(duì)HepG2細(xì)胞抑制作用較強(qiáng)于其他五種活性成分(見(jiàn)圖7)，且P<0.001，表明華良姜素對(duì)HepG2細(xì)胞抑制作用有顯著性差異，選出華良姜素進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

圖7 黃芪6個(gè)活性成分對(duì)HepG2細(xì)胞的影響Fig.7 The effect of active components from Astragalus Radix on HepG2 cells注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。O：對(duì)照組；A：山奈酚；B：毛蕊異黃酮；C：槲皮素；D：芒柄花素；E:：異鼠李素；F：華良姜素。Note: Compared with control,*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001.O: Control group;A: Kaempferol;B: Calycosin;C: Quercetin;D: Formononetin;E:Isorhmnetin;F: Jaranol.

3.7 RT-qPCR分析

通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)TP53、MAPK1、AKT1、IL6、MAPK8與VEGFA基因的mRNA在加不同濃度的華良姜素后表達(dá)水平變化(見(jiàn)圖8)，6個(gè)基因均出現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，隨著給藥劑量的增加，mRNA的表達(dá)量增多。且給藥組中高劑量基因變化有極顯著(P<0.01)性差異。由此說(shuō)明華良姜素對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞有抑制作用

圖8 不同濃度的華良姜素對(duì)6個(gè)基因mRNA表達(dá)含量Fig.8 Different concentrations of Jaranol on the mRNA expression of 6 genes注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。a：APK1蛋白；b：MAPK8蛋白；c：IL6蛋白； d：TP53蛋白；e：VEGFA 蛋白；f：AKT1蛋白。Note: Compared with control,*P < 0.05;**P < 0.01;***P < 0.001.a: MAPK1 protein;b: MAPK8 protein;c: IL6 protein;d: TP53 protein;e: VEGFA protein;f:AKT1 protein.

4 討論

黃芪是一種常用的補(bǔ)氣藥，研究表明黃芪提取物可能是一種潛在的抗腫瘤藥物。道地藥材恒山黃芪的多糖成分具有抑制人宮頸癌細(xì)胞Si Ha的增殖、粘附、鋪展以及遷移運(yùn)動(dòng)的活性[14]。槲皮素是一種天然植物類(lèi)黃酮，其生物活性已得到廣泛研究，對(duì)白血病，乳腺癌，肝癌，卵巢癌，結(jié)直腸癌，胃癌和子宮內(nèi)膜癌的惡性細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用[15]。經(jīng)研究報(bào)道槲皮素通p53/Bcl-xl增強(qiáng)阿霉素介導(dǎo)的抗肝癌作用[16]。山萘酚通過(guò)下調(diào)miR-21和上調(diào)PTEN以及滅活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路來(lái)抑制HepG2細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲[17]。毛蕊異黃酮與異阿魏酸配伍組合是通過(guò)細(xì)胞周期調(diào)控因子cyclin D1、CDK6和p21介導(dǎo)的細(xì)胞周期調(diào)控來(lái)抑制HepG2細(xì)胞增殖[18]。

本研究通過(guò)TCMSP 篩選出黃芪20個(gè)有效成分，成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)交集出88個(gè)共同靶點(diǎn)。經(jīng)PPI網(wǎng)絡(luò)與拓?fù)浞治龊Y選出6個(gè)關(guān)鍵蛋白及相對(duì)應(yīng)的6個(gè)單體化合物，經(jīng)上述分子對(duì)接分?jǐn)?shù)可知。成分與靶點(diǎn)具有一定的結(jié)合性，MAPK8/Fox O信號(hào)通路對(duì)于癌癥和脂肪肝的發(fā)展非常重要。研究證實(shí)他莫西芬通過(guò)MAPK8/Fox O信號(hào)通路在乳腺癌細(xì)胞(MCF-7、T47D、ZR-75和MDA-MB-231)和肝細(xì)胞(LO2)中起作用。通過(guò)干擾MAPK8/Fox O信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)脂肪肝[19]。He等[20]研究表明，用脂多糖誘導(dǎo)乳腺炎小鼠，檢測(cè)到MAPK信號(hào)通路中p38MAPK、ERK和JNK的磷酸化水平升高，參與炎癥反應(yīng)。黃芪蛋白通過(guò)影響p53信號(hào)通路導(dǎo)致HepG2細(xì)胞發(fā)生程序性壞死,從而導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制[21]。

靶點(diǎn)富集分析表明：黃芪可能通過(guò)凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、ATP結(jié)合、蛋白質(zhì)復(fù)合物等生物功能及PI3K-Akt 信號(hào)通路、Hepatitis B信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路及腫瘤壞死因子信號(hào)通路起抗肝癌作用。MTT結(jié)果顯示6個(gè)化合物均對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞有一定地抑制作用，RT-qPCR結(jié)果顯示不同濃度的華良姜素均能使6個(gè)基因呈上調(diào)趨勢(shì)，且與PI3K-Akt 信號(hào)通路、Hepatitis B信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路及腫瘤壞死因子信號(hào)通路所涉及的基因一致。已確定PI3K-Akt信號(hào)通路在許多人類(lèi)癌癥中差異表達(dá)。例如，PIK3R1在肝細(xì)胞癌和腎癌中起抑癌作用[22]。Wu等[23]發(fā)現(xiàn) TNF-α單體干預(yù)肝癌細(xì)胞中NF-κB活化，可使細(xì)胞凋亡增加，siRNA可通過(guò)特異性抑制NF-κB/p65編碼的mRNA，下調(diào)P-gp水平，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。Chen 等[24]研究發(fā)現(xiàn)HBp / FOXO3 / miRNA-30b-5p / MINPP1軸通過(guò)糖酵解旁路促進(jìn)HBV陽(yáng)性HCC細(xì)胞的發(fā)育。還提出了miRNA-30b-5p / MINPP1作為HBV陽(yáng)性HCC早期診斷的新型生物標(biāo)志物和抗腫瘤治療的潛在藥物靶標(biāo)。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接，本研究闡述了中藥黃芪治療肝癌的有效活性成分、潛在作用靶點(diǎn)及發(fā)揮藥效的生物學(xué)通路。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為后續(xù)研究其藥理作用機(jī)制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。