詹金鈺, 呼曉慶, 鄭玥熙, 張方元, 楊兆富,*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 陜西楊凌 712100; 2.山西琪爾康翅果生物制品有限公司, 山西臨汾042100)

翅果油樹Elaeagnusmollis為我國特有的木本植物和油料樹種，屬胡頹子科(Elaeagnaceae)胡頹子屬Elaeagnus，別名澤綠旦、車勾子等，僅在我國山西、陜西兩地有分布(張紅梅等, 2002; 李俊楠, 2018)。翅果油樹也是一種具有重要經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會(huì)價(jià)值的國家級保護(hù)樹種之一，不僅其種子具有極高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，且根系發(fā)達(dá)，固氮能力強(qiáng)，能夠有效地防風(fēng)固沙、涵養(yǎng)水源并改善土壤環(huán)境(楊青珍等, 2006; 李俊楠, 2018)。此外，翅果油樹開花早、花蜜足，是很好的蜜源植物，樹葉還可做成干鮮飼料用于飼養(yǎng)家禽家畜，其木材紋理細(xì)致，材質(zhì)堅(jiān)硬且耐腐蝕，可供建筑及制作農(nóng)具、家具用材等(趙印安和衛(wèi)世珍, 2001; 楊青珍等, 2006)。

山西省豐富的野生翅果油樹資源，對于推動(dòng)山西經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要作用。近年來，在山西省臨汾市鄉(xiāng)寧縣翅果油樹產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)3種鱗翅目昆蟲均對翅果油樹造成危害，導(dǎo)致翅果油樹產(chǎn)量和品質(zhì)下降，嚴(yán)重影響了翅果油樹的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本文通過對這3種害蟲的成蟲形態(tài)特征和生活史觀察，系統(tǒng)研究并描述了各種的外形和(雌、雄性)外生殖器鑒別特征，明確了3種害蟲的部分生物學(xué)特性，同時(shí)利用DNA條形碼開展了物種分子鑒定，以期為翅果油樹的害蟲種類鑒定和防治工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

本研究供試翅果油樹3種鱗翅目害蟲均利用黑光燈誘集和糖醋液誘捕的方法采集，樣本均采自山西省臨汾市鄉(xiāng)寧縣翅果油樹產(chǎn)區(qū)(表1)。所有樣品置于無水乙醇中，-20℃保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)昆蟲博物館。

表1 翅果油樹3種鱗翅目害蟲樣本信息

1.2 形態(tài)學(xué)鑒定

在Leica ZOOM 2000體視顯微鏡下對成蟲外部形態(tài)進(jìn)行觀察并拍照。雌、雄性外生殖器解剖方法參考Yang等(2012)，將腹部取下后浸泡于10% NaOH溶液中12～24 h至蟲體變軟或于10% NaOH溶液中在酒精燈上加熱5～10 min至蟲體變軟，取出腹部置于裝有少量50%乙醇溶液的培養(yǎng)皿中在解剖鏡下解剖出外生殖器，將外生殖器放入橙黃染色劑染色15～20 min，采用不同濃度酒精液進(jìn)行逐級脫水，滴膠封片，貼上標(biāo)簽。利用Nikon AZ100連續(xù)變焦顯微鏡對樣本的雌、雄性外生殖器進(jìn)行形態(tài)觀察，并拍照。

1.3 生活史觀察

調(diào)查樣地：樣地位于山西省臨汾市鄉(xiāng)寧縣翅果油樹產(chǎn)區(qū)，地理坐標(biāo)35°41′30″N-36°09′06″N, 110°30′20″E-111°17′13″E。產(chǎn)區(qū)面積3 000 hm2，試驗(yàn)地塊翅果油樹樹高10.0 m左右，徑粗約8.0 cm。

調(diào)查方法：在調(diào)查樣地內(nèi)標(biāo)記10株翅果油樹受害株，于2018-2019年每年4-7月，每周對被危害部位的幼蟲、蛹發(fā)育情況﹑成蟲羽化情況進(jìn)行調(diào)查記錄。8-11月，根據(jù)翅果油樹上新出現(xiàn)的被透翅蛾及小卷蛾危害的部位，重新標(biāo)記10株翅果油樹受害株，每周進(jìn)行調(diào)查記錄。

1.4 DNA條形碼分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析

1.4.1基因組DNA的提取：本研究依據(jù)TransGen Biotech(北京)試劑盒中提供的提取方法對10頭待測樣本的1只胸足進(jìn)行總DNA提取。提取的DNA樣品取4.0 μL通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳來檢測提取質(zhì)量，檢測合格后保存于-20℃，備用。

1.4.2COI基因片段的PCR擴(kuò)增及測序：以LCO1490/HCO2198為引物，擴(kuò)增樣品的COI基因DNA條形碼片段(Folmeretal., 1994)，反應(yīng)體系(25.0 μL)：DNA模板3.0 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min; 94℃變性1 min，53℃退火45 s，72℃延伸1 min，運(yùn)行35個(gè)循環(huán)。取3.0 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。將合格的擴(kuò)增產(chǎn)物委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.4.3序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析:使用ClustalX 2.0(Larkinetal., 2007)進(jìn)行多重序列比對。以家蠶Bombyxmori的COI基因(GenBank登錄號: JF700138.1)作為外群，采用MEGA 7.0(Kumaretal., 2016)基于K2P(Kimura 2-parameter)模型構(gòu)建COI基因DNA條形碼序列的鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹(neighbor-joining tree, NJ樹)進(jìn)行Bootstrap值(1 000次)檢驗(yàn)，并將測序基因片段同時(shí)在BOLD(Barcode of Life Database)系統(tǒng)、GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，根據(jù)序列相似性鑒定種類。基于K2P模型使用MEGA 7.0軟件計(jì)算種內(nèi)及種間遺傳距離。

2 結(jié)果

本研究結(jié)合形態(tài)特征和DNA條形碼分子數(shù)據(jù)的鑒定結(jié)果表明，在山西省臨汾市鄉(xiāng)寧縣翅果油樹產(chǎn)區(qū)翅果油樹上發(fā)生危害的3種鱗翅目害蟲分別為透翅蛾科(Sesiidae)透翅蛾亞科(Sesiinae)的榆興透翅蛾Synanthedonulmicola、興透翅蛾Synanthedonsp.和卷蛾科(Tortricidae)新小卷蛾亞科(Olethreutinae)的斜紋小卷蛾Apotomissp.。其中，興透翅蛾Synanthedonsp.和斜紋小卷蛾Apotomissp.經(jīng)分類鑒定并咨詢相關(guān)專家(楊集昆和王音, 1989; Jinetal., 2008; 徐振國等, 2019)，暫時(shí)未能確定種名，有待后續(xù)研究進(jìn)一步確定。

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定特征及生活史描述

2.1.1榆興透翅蛾SynanthedonulmicolaYangetWang, 1989：該種與下文中興透翅蛾Synanthedonsp.兩種均符合興透翅蛾屬SynanthedonHübner, 1819屬征：體較細(xì)長。觸角頂端具小毛束。前翅3個(gè)透明區(qū)(至少有2個(gè)顯現(xiàn))，后透翅區(qū)長，位于前透區(qū)下方，伸至中斑；R5脈伸至翅頂角，端區(qū)大而清晰；中斑除個(gè)別種外，或多或少沿CuA2脈伸達(dá)翅后緣(徐振國等, 2019)。

成蟲形態(tài)特征(圖1: A, B)：體長11.0～14.0 mm，翅展約24.0 mm，體黑色具藍(lán)紫色光澤。頭黑色，后緣雜有少量黃、白色鱗毛。腹部黑色，第Ⅱ, Ⅳ和Ⅵ節(jié)后緣具淺黃色帶。觸角線狀，內(nèi)側(cè)從基部到端部具一排短絨毛，端部彎鉤狀具毛束。復(fù)眼大，黑色。復(fù)眼前方有白色鱗片帶，復(fù)眼后方白色。中胸背板黑色，后胸近翅基處有1簇毛簇。腹部7節(jié)，第Ⅳ腹節(jié)背板后緣的黃色橫帶寬度為第Ⅱ和Ⅵ節(jié)橫帶寬度之和，腹端著生褐色大毛簇，雌蟲向上呈“V”字型斜豎，雄蟲平展。前翅黑紫色，前后緣雜有褐色鱗毛，中室透明，外端有1個(gè)藍(lán)色彎月型大斑，斑外翅透明，緣毛淺紫色。后翅透明，翅緣及緣毛黑色。中、后足股節(jié)外側(cè)黑色，內(nèi)側(cè)白色，脛節(jié)黑色；中足脛節(jié)中部外側(cè)及端部有黃色毛斑，具有1對長度不等的黃色端距，跗節(jié)內(nèi)側(cè)黃色，外側(cè)黑色，有短刺。

雌性外生殖器(圖1: C)：交配囊長卵形，具許多皺褶，無囊突；囊導(dǎo)管細(xì)長，膜質(zhì)；前表皮突與后表皮突約等長；肛乳突密被長短不一的剛毛，基部漸膨大。

圖1 榆興透翅蛾成蟲形態(tài)特征

雄性外生殖器(圖1: D)：抱器瓣大，似平行四邊形，內(nèi)面被緊密的黑色鱗毛排列成“L”形；陽莖細(xì)長，基部粗大，近1/2處明顯縊縮變細(xì)，末端平截。

生活史：榆興透翅蛾在山西省臨汾市鄉(xiāng)寧縣翅果油樹產(chǎn)區(qū)一年發(fā)生1～2代，幼蟲通常選擇翅果油樹徑粗3.0 cm以上的植株，在離地面20.0 cm以內(nèi)的主干韌皮層內(nèi)越冬5月初幼蟲蛀入翅果油樹基部后，被害處初見油漬狀濕斑黃褐色膠液。隨蟲齡增長濕斑漸小，粘液漸多，嚴(yán)重者可將根區(qū)部韌皮成圈蛀空，導(dǎo)致翅果油樹地上部分死亡。5月中旬初化蛹，蛹期5～7 d。5月底6月初成蟲羽化。羽化后的蛹?xì)?/5留在羽化孔內(nèi)。

2.1.2興透翅蛾Synanthedonsp.：成蟲形態(tài)特征(圖2: A, B)：外形等特征近似榆興透翅蛾。體長11.0～14.0 mm，翅展約24.0 mm，體金屬藍(lán)黑色。腹面黑褐色兼有白色斑紋。觸角線狀，端部具毛束。復(fù)眼內(nèi)側(cè)、后側(cè)各有一條白帶。中胸背板黑紫色，側(cè)板黃色。后翅近翅基處有1簇毛簇。腹板后緣有1個(gè)三角形突起。腹部7節(jié)，第Ⅳ腹節(jié)背板后緣的黃色橫帶寬度為第Ⅱ和Ⅵ節(jié)寬度之和。雌蟲腹端黑色大毛簇向背上方呈“V”字型斜豎，雄蟲的黑色大毛簇向兩側(cè)平展。前翅黑紫色，前后緣雜有黑色鱗毛，中室透明，外端有1個(gè)藍(lán)黑色彎月型大斑，斑外翅透明，緣毛淡紫。后翅透明，翅緣及緣毛黑色。前、中、后足均為黑色。中足脛節(jié)具2個(gè)長度不等的黃白色端距，跗節(jié)內(nèi)側(cè)黃色，外側(cè)黑色，有短刺。

圖2 興透翅蛾成蟲形態(tài)特征

雌性外生殖器(圖2: C)：交配囊圓卵形，具許多皺褶，無囊突；囊導(dǎo)管較長，膜質(zhì)；后表皮突比前表皮突長，前表皮突長約為第Ⅷ腹節(jié)長的1.5倍，后表皮突長約為第Ⅷ腹節(jié)長的2.0倍；肛乳突上被有一些稀疏短剛毛。

雄性外生殖器(圖2: D)：抱器瓣長尖，似矩形，內(nèi)面被緊密的褐黑色短毛；囊形突較長，棒狀；陽莖長筒狀，中部較細(xì)，端部膨大，內(nèi)部有1個(gè)叉狀和1個(gè)針狀的骨化角狀器。

生活史：興透翅蛾在山西省臨汾市鄉(xiāng)寧縣翅果油樹產(chǎn)區(qū)一年發(fā)生1～2代，幼蟲通常選擇翅果油樹徑粗3.0 cm以上的植株，在離地面20.0 cm以內(nèi)的主干韌皮層內(nèi)越冬。相較于榆興透翅蛾，興透翅蛾成蟲對糖醋液的趨性較強(qiáng)。該種與榆興透翅蛾對翅果油樹造成的為害狀相似，其幼蟲蛀入后被害處也可見油漬狀濕斑黃褐色膠液。隨蟲齡增長濕斑漸小，粘液漸多，嚴(yán)重者可將根區(qū)部韌皮成圈蛀空，致使翅果油樹地上部分發(fā)育不良而最終導(dǎo)致死亡。4月初化蛹，蛹期5～7 d。4月中旬初見成蟲羽化，羽化期相對于榆興透翅蛾早1個(gè)月。羽化后的蛹?xì)?/5留在羽化孔內(nèi)。

2.1.3斜紋小卷蛾Apotomissp.：該種符合斜紋小卷蛾屬ApotomisHübner, 1825屬征：前翅R1脈自中室上緣中部前方發(fā)出；R2自R1與R3脈之間2/3處發(fā)出；R4與R5脈靠近，近等距；M2, M3與CuA1脈基部分離；M3脈自中室下角上方發(fā)出；CuA2脈自中室下緣2/3處發(fā)出；索脈自R1與R2脈基部之間至R5脈基部；M脈主干止于M1與M2脈基部之間。后翅Rs脈抵達(dá)前緣末端，與M1脈基部靠近；M2脈自中室下角前發(fā)出，與M3脈基部靠近；M3與CuA1同出一點(diǎn)；CuA2脈自中室下緣中部后方發(fā)出(李后魂等, 2012)。

成蟲形態(tài)特征(圖3: A, B)：體長8.0～12.0 mm，翅展約25.0 mm，體深灰色無光澤。復(fù)眼半球狀，黑色。頭及額部光裸，多數(shù)具一簇橫向短毛；頭頂常密被有濃密鱗片。觸角絲狀，每亞節(jié)環(huán)被一排鱗片，具纖毛，雄蟲的纖毛較雌蟲長。下唇須上舉，有時(shí)前伸，被鱗片；第1節(jié)短，第2節(jié)略長，末端膨大，腹緣蓬松或緊密被有長鱗片；第3節(jié)短或極短，末端圓鈍。胸部光裸，棕褐色，前胸較小，領(lǐng)片寬；中胸發(fā)達(dá)，具翅基片；后胸脊突灰褐色。前、中、后足股節(jié)淺褐色，脛節(jié)內(nèi)側(cè)淺黃色，外側(cè)灰褐色，跗節(jié)內(nèi)側(cè)淺黃色，外側(cè)褐色。前翅略寬，近長方形，頂角圓鈍，外緣斜，翅面底色鉛色，斑紋褐色、棕色、白色。前翅外橫線與外緣線間有1個(gè)明顯的灰白色近長方形的斜向大斑。后翅近三角形，淺棕褐色，前緣近白色，緣毛淺褐色。

圖3 斜紋小卷蛾成蟲形態(tài)特征

雌性外生殖器(圖3: C)：交配囊長橢圓形，無囊突；囊導(dǎo)管較短，于1/2處回折；前表皮突與后表皮突約等長；肛乳突密被長短不一的剛毛，基部漸尖，呈橢圓形。

雄性外生殖器(圖3: D)：背兜近正方形；爪形突基部寬，末端平滑，被稀疏細(xì)長毛；尾突寬片狀，被有濃密長毛。抱器腹略寬，抱器端基部窄，末端漸膨大，腹緣被有多列短刺。陽莖略長，近中部微弓，末端寬度約為基部的一半，有2個(gè)末端分叉的短小刺狀角狀器。

生活史：斜紋小卷蛾在山西省臨汾市鄉(xiāng)寧縣翅果油樹產(chǎn)區(qū)一年發(fā)生2～3代，3月下旬末可見羽化的越冬成蟲，4月底5月初可在翅果油樹嫩葉發(fā)現(xiàn)吐絲綴葉為害的幼蟲。幼蟲遇到驚嚇時(shí)會(huì)扭動(dòng)身體逃脫。幼蟲達(dá)到8.0 mm左右時(shí)食量大增，并有在同一植株上轉(zhuǎn)葉危害的習(xí)性，嚴(yán)重時(shí)大部分頂尖葉片被綴連或翻卷，部分幼蟲危害翅果油樹幼果。第1代老熟幼蟲少數(shù)在綴葉內(nèi)化蛹，多數(shù)吐絲下垂入土2.0～3.0 cm或在落葉下化蛹。6月上中旬第1代成蟲羽化，7月下旬至8月上旬第2代成蟲羽化，幼蟲危害新梢嫩葉，有的將頂芽蛀成凹頂。9月中旬入土化蛹，越冬。有些年份少見第3代成蟲在11月初出現(xiàn)。

2.2 分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

本研究共測序獲得了翅果油樹3種鱗翅目害蟲10頭成蟲樣品的COI基因DNA條形碼序列。利用MEGA計(jì)算這3種鱗翅目昆蟲的遺傳距離，由表2分析結(jié)果可知，種間平均遺傳距離為13.9%～21.0%，種內(nèi)平均遺傳距離為0.5%～0.8%；榆興透翅蛾Synanthedonulmicola和興透翅蛾S.sp.種間遺傳距離最小(13.3%)，興透翅蛾S.sp.和斜紋小卷蛾Apotomissp.種間遺傳距離最大(21.6%)，榆興透翅蛾S.ulmicola種內(nèi)遺傳距離最小(0.1%)，興透翅蛾S.sp.種內(nèi)遺傳遺傳距離最大(1.0%)。核苷酸序列相似度比對結(jié)果顯示，其中4個(gè)樣品(C1803210053/1, C1803210053/2, C1803210053/3和C1803210053/4)與GenBank數(shù)據(jù)庫中Synanthedonsequoiae的COI基因序列(登錄號：MH592846.1)核苷酸序列一致性達(dá)90.7%，結(jié)合形態(tài)學(xué)研究鑒定為榆興透翅蛾Synanthedonulmicola；樣品XA18051500086(A1), XA18051500088(A2), XA18051500090(A3)和XA18051500092(A4)的DNA條形碼序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中Synanthedonspheciformis的COI基因序列(登錄號：KM572833.1)核苷酸序列一致性達(dá)90.0%，結(jié)合形態(tài)學(xué)研究鑒定為興透翅蛾屬Synanthedonsp.；樣品C1803210053/5和C1803210053/6的DNA條形碼序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中Apotomiscapreana的COI基因序列(登錄號：KX042041.1)核苷酸序列一致性達(dá)92.7%，結(jié)合形態(tài)學(xué)研究樣本鑒定為斜紋小卷蛾屬Apotomissp.。

表2 基于COI基因序列3種鱗翅目昆蟲種間與種內(nèi)的遺傳距離(%)

本研究所構(gòu)建的NJ樹如圖4所示，樣品XA18051500086(A1), XA18051500088(A2), XA18051500090(A3)和XA18051500092(A4)聚為一支，且與榆興透翅蛾聚為一大支，表明二者親緣關(guān)系較近；C1803210053/5和C1803210053/6單獨(dú)聚為一支。NJ樹的聚類分析結(jié)果與序列比對結(jié)果相吻合。

圖4 基于COI基因條形碼序列構(gòu)建的3種鱗翅目害蟲與其他物種的鄰接樹(1 000次重復(fù))

3 討論

翅果油樹由于具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是我國比較特有的種質(zhì)資源。近年來，隨著該樹種在山西省種植面積不斷增加和多款相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)，為進(jìn)一步促進(jìn)本地經(jīng)濟(jì)發(fā)展和脫貧致富奠定了良好的基礎(chǔ)。同時(shí)，翅果油樹作為“國家二級珍稀瀕危保護(hù)植物”和山西省瀕危保護(hù)樹種(郭偉略, 2014)，對其進(jìn)行行之有效的資源保護(hù)措施對合理開發(fā)和利用該樹種顯得尤為重要。

本研究通過對山西翅果油樹上3種鱗翅目害蟲成蟲的外部形態(tài)和外生殖器進(jìn)行觀察、拍照和描述，并結(jié)合DNA條形碼技術(shù)開展了分子鑒定，確定翅果油樹3種鱗翅目害蟲為榆興透翅蛾Synanthedonulmicola、興透翅蛾Synanthedonsp.和卷蛾科的斜紋小卷蛾Apotomissp.，進(jìn)一步證實(shí)基于形態(tài)和分子的整合分類方法能夠?qū)崿F(xiàn)對重要經(jīng)濟(jì)林木害蟲的快速準(zhǔn)確物種識別和鑒定(王玉生等, 2016)。同時(shí)，本研究根據(jù)多年觀察資料初步描述了3種害蟲的生活史等生物學(xué)特性，為科學(xué)防治翅果油樹鱗翅目害蟲提供了科學(xué)資料。但是，目前針對以上3種鱗翅目害蟲的發(fā)生規(guī)律及種群動(dòng)態(tài)等資料仍不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。另外，本研究中仍有2種未能定名，仍需通過核對模式標(biāo)本等進(jìn)一步確定。

對于山西翅果油樹3種鱗翅目害蟲的防治，應(yīng)根據(jù)其發(fā)生危害特點(diǎn)、生物學(xué)特性可采用以下措施進(jìn)行綜合防治。首先，防治透翅蛾可以在幼蟲蛀干期間，將20.0%吡蟲啉可溶性液劑1 500倍液等用針管注入蛀孔內(nèi)，再用黃泥密封孔口；在5-6月份，成蟲羽化產(chǎn)卵期和幼蟲孵化初期，對產(chǎn)卵場所(如樹皮、舊的羽化孔)進(jìn)行刮皮，并將刮下的老皮集中燒毀，消滅其中的蟲卵和初孵幼蟲，或通過釋放天敵昆蟲如赤腹繭蜂，減少害蟲發(fā)生量。在春、秋、冬三季，及時(shí)敲打幼蟲危害部位，以達(dá)到致死入侵害蟲和降低此時(shí)期蟲口數(shù)量的目的；在成蟲羽化盛期，則可考慮采用透翅蛾性信息素誘捕器誘捕成蟲(蕭剛?cè)? 1992; 王合等, 2011; 賈云霞, 2017)。防治斜紋小卷蛾可以在其越冬期間，徹底刮除老翹皮和粗皮，集中燒毀，并在樹干上涂刷3～5°Be石硫合劑或石灰膏，可大幅降低越冬幼蟲的蟲源基數(shù)。在翅果油樹園區(qū)，釋放捕食性天敵昆蟲如草蛉或釋放寄生性天敵赤眼蜂，發(fā)生期隔株或隔行放蜂，每代放蜂3～4次，間隔5 d，每株放有效蜂1 000～2 000頭，可在很大程度上減少蟲源數(shù)量。也可在成蟲產(chǎn)卵至幼蟲低齡期，噴施生物源制劑或仿生農(nóng)藥等安全藥劑，如25.0%滅幼脲1 500～2 000倍液或0.5%川楝素乳油500～1 000倍液等(樊改英和任照國, 2010; 竇興華和劉乃榕, 2012; 孟樹標(biāo)和溫素卿, 2019)，以達(dá)到防治斜紋小卷蛾的目的。

致謝本研究中斜紋小卷蛾Apotomissp.的鑒定得到西北大學(xué)于海麗副教授的幫助，在此謹(jǐn)致誠摯謝意！