田間二化螟雄蛾對不同配比性信息素的嗅覺反應(yīng)及性信息素識別相關(guān)基因表達(dá)水平差異

劉天偉, 陳運(yùn)康, 許春梅, 郭 榮, 馮 波, 杜永均,*

(1.浙江大學(xué)農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所, 杭州 310058; 2.湖南攸縣植保植檢站, 湖南攸縣 412300;3.犍為縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局, 四川犍為 614400; 4.全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心, 北京 100125; 5.溫州醫(yī)科大學(xué)健康與環(huán)境生態(tài)研究所, 浙江溫州 325035)

昆蟲在性成熟時(shí)釋放的性信息素氣味分子，通過氣流擴(kuò)散傳播，被其同種異性昆蟲的嗅覺感器感受產(chǎn)生神經(jīng)生理反應(yīng)，并整合其他感覺通道，最后使雄性昆蟲產(chǎn)生朝向氣味源的定向飛行行為反應(yīng)，找到配偶而實(shí)現(xiàn)交配。在嗅覺感器內(nèi)部，已經(jīng)鑒定出許多基因家族在昆蟲的性信息素嗅覺識別過程中發(fā)揮重要作用，包括性信息素結(jié)合蛋白(pheromone binding proteins, PBPs)(Zhuetal., 2016)、性信息素受體(pheromone receptors, PRs)(Linetal., 2015; Zhangetal., 2017)、細(xì)胞色素P450(cytochrome P450)(Fengetal., 2017)、普通氣味結(jié)合蛋白(general odorant binding proteins, GOBPs)(Khuhroetal., 2017)、離子受體(ionotropic receptors, IRs)(Heetal., 2019)、感覺神經(jīng)元膜蛋白(sensory neurone membrane proteins, SNMPs)(Sunetal., 2019)、化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)(Zengetal., 2018)和氣味降解酶(odour degrading enzymes, ODEs)(Chertempsetal., 2012)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)性信息素結(jié)合蛋白PBP1-4(Changetal., 2015; Dongetal., 2019)、普通氣味結(jié)合蛋白GOBP1-2(Gongetal., 2009; Khuhroetal., 2017)和性信息素受體PR1-6(Changetal., 2015)參與了二化螟Chilosuppressalis性信息素的嗅覺識別。因此，這些基因的表達(dá)水平直接影響了神經(jīng)輸入信號，從而最終影響雄蛾的行為反應(yīng)。

首先，性信息素的生物合成原料來自寄主植物，寄主植物是影響昆蟲性信息素組成變異的一個(gè)重要因子(Landolt and Phillips, 1997)。草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda玉米品系雌蛾幾乎不與水稻品系雄蛾交配，而水稻品系雌蛾與兩類品系的雄蛾均可交配，這是由于雌蛾性腺分泌的性信息素不同而造成的行為隔離(Caas-Hoyosetal., 2017)。玉米螟性信息素也受寄主植物的影響(徐翔等, 2018)。其次，昆蟲性信息素的生物合成受一系列酶控制，環(huán)境中的多種生物和非生物因子影響其相應(yīng)基因的表達(dá)水平，這些基因的表達(dá)水平的變異最后影響了雌成蟲釋放的性信息素組成和配比差異，尤其是微量組分的差異(Araietal., 1984; Linetal., 2018)，從而形成性信息素的多型現(xiàn)象(Svenssonetal., 2002; Grootetal., 2014)。而與此相應(yīng)的，其同種異性的雄蛾嗅覺系統(tǒng)也需要適應(yīng)其變異并協(xié)同進(jìn)化，由此形成了嗅覺的個(gè)體差異(Linetal., 2015; Zhangetal., 2017)。最早是在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中開展了自然種群的嗅覺行為的個(gè)體差異及其分子遺傳機(jī)理研究(Rollmannetal., 2010; Wangetal., 2010)。在斜紋夜蛾Spodopteralitura的性信息素行為調(diào)控的雌性性信息釋放的變異與雄蛾的嗅覺適應(yīng)性的協(xié)同進(jìn)化中，同樣形成了嗅覺的個(gè)體差異，并由此形成了性信息素行為調(diào)控的地理種群差異(Linetal., 2015; Zhangetal., 2017; Linetal., 2018)。

二化螟C.suppressalis屬鱗翅目螟蛾科，是亞洲、非洲北部和歐洲南部等熱帶及亞熱帶地區(qū)一種重要農(nóng)業(yè)害蟲(Yuetal., 2010)。長期以來，二化螟主要依靠化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治，導(dǎo)致其抗藥性水平快速上升，新農(nóng)藥的研發(fā)跟不上農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的速度，一些地區(qū)出現(xiàn)了無藥可用的地步，對水稻生產(chǎn)造成了巨大的損失(谷云勇等, 2018)。為了減少施用化學(xué)農(nóng)藥，基于性信息素的群集誘殺技術(shù)(蘇建偉等, 2003; 左文等, 2008; Vacasetal., 2009; 杜永均等, 2013)和交配干擾技術(shù)(Ueno and Hayasaka, 1997; Alfaroetal., 2009; Chenetal., 2014)在二化螟的綠色防控中發(fā)揮了重要作用。二化螟雌蛾釋放順11-十六碳烯醛(Z11-16∶Ald)、順9-十六碳烯醛(Z9-16∶Ald)、順13-十八碳烯醛(Z13-18∶Ald)等組成的混合物(Tatsukietal., 1977; Mochidaetal., 1984; Chenetal., 2018)。最新研究發(fā)現(xiàn)，性信息素引誘的二化螟雄蛾具有更強(qiáng)的性信息素反應(yīng)能力，同時(shí)性信息素引誘的大部分雄蛾為未交配狀態(tài)(馮波等, 2017; 郭前爽等, 2019)，這些研究結(jié)果從理論上解釋了性信息素群集誘殺二化螟的防控有效性。由于二化螟是寡寄主習(xí)性，寄主植物包括水稻、茭白、玉米、小麥、油菜等植物(Houetal., 2010)，這些作物在不同地區(qū)有不同的耕作方式和品種，二化螟的性信息素受寄主植物差異的影響顯著(Cuong and Cohen, 2003; Uenoetal., 2006)。但是到目前為止還不清楚同種群二化螟的不同地理種群雄蛾是否對性信息素識別存在差異。

為了系統(tǒng)研究二化螟雄蛾嗅覺的地理種群差異及其機(jī)理，本研究利用田間試驗(yàn)分析不同配比性信息素對不同地理種群二化螟的誘蟲量差異，利用風(fēng)洞試驗(yàn)測定不同配比性信息素從同一種群引誘獲得的雄蛾在室內(nèi)對不同配比性信息素的嗅覺行為反應(yīng)差異，利用RT-qPCR測定不同配比性信息素引誘同一種群二化螟雄蛾觸角中與性信息素識別相關(guān)基因的表達(dá)差異。本研究結(jié)果首次證實(shí)了不同田間種群二化螟雄蛾對不同配比性信息素的反應(yīng)差異，有助于闡述二化螟的嗅覺識別機(jī)理和制定有效的性信息素防控策略。

1 材料與方法

1.1 田間誘捕試驗(yàn)

2019年4-8月在浙江省杭州市蕭山區(qū)水稻種植區(qū)(表1)選擇長勢基本均勻、管理基本一致的6個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，進(jìn)行二化螟的田間誘捕試驗(yàn)，分別誘捕水稻田中越冬代和第2代二化螟雄蛾，每日7∶00-8∶00時(shí)將田間誘捕器內(nèi)的雄蟲取出，記錄每個(gè)誘捕器的誘蛾量，帶回浙江大學(xué)應(yīng)用化學(xué)生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，以備風(fēng)洞試驗(yàn)以及RT-qPCR的試驗(yàn)。我們還在湖南省株洲市攸縣、安徽省宣城市涇縣、四川省眉山市東坡區(qū)、遼寧省遼陽市太子河區(qū)、吉林省長春市德惠市的水稻種植區(qū)進(jìn)行了田間誘捕試驗(yàn)(表1)，每日7∶00-8∶00時(shí)記錄每個(gè)誘捕器的誘蛾量，并將田間誘捕器內(nèi)的雄蛾清除。試驗(yàn)用二化螟性信息素PVC毛細(xì)管誘芯和新型飛蛾誘捕器都由寧波紐康生物技術(shù)有限公司提供。每枚誘芯中的信息素總含量為1.2 mg，Z11-16∶Ald和Z9-16∶Ald 的比例分別為540 μg∶540 μg, 864 μg∶216 μg, 945 μg∶135 μg, 980 μg∶98 μg, 1 003 μg∶77 μg, 1 016 μg∶64 μg和1 045 μg∶35 μg，Z13-18∶Ald的含量維持不變。每個(gè)誘捕器安裝一枚誘芯，誘捕器高度約1 m，試驗(yàn)點(diǎn)按梯形放置，一行放置3個(gè)處理，另一行放置4個(gè)處理。處理之間間隔為30 m，兩行間隔為30 m，兩個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)間隔為200 m。各試驗(yàn)點(diǎn)不同誘芯按不同排列順序，以減少位置和風(fēng)向的影響。

表1 本研究的田間誘捕試驗(yàn)地點(diǎn)

1.2 風(fēng)洞試驗(yàn)

1.2.1風(fēng)洞裝置：長方體型風(fēng)洞外壁由透明的有機(jī)玻璃和鋁合金框架制成，長2 m,寬和高各1 m。風(fēng)源為標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺，風(fēng)速為0.3 m/s。風(fēng)源對側(cè)裝有排氣扇可將帶有化合物的氣流排出室外。試驗(yàn)在紅色光源中進(jìn)行，光強(qiáng)度為1.0～1.5 lx。風(fēng)洞溫度為23～25℃、相對濕度為60%～70%。

1.2.2雄蛾行為測試：將田間取回的雄蟲用10%的蜂蜜水喂養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為25±2℃，相對濕度為75%±10%，光照條件為自然光照(光周期14L∶10D)，于當(dāng)晚22∶00時(shí)至次日凌晨進(jìn)行風(fēng)洞試驗(yàn)，每頭雄蛾只使用一次。將誘芯固定于距風(fēng)源50 cm、距頂部玻璃50 cm的鱷魚鉗上。在距下風(fēng)端50 cm處置一高50 cm的釋放支架，受試雄蛾置于其上。如雄蛾 5 min內(nèi)無行為反應(yīng)則換下，引入另一頭雄蛾繼續(xù)試驗(yàn)。試驗(yàn)中每個(gè)代次每種誘芯測試50～60頭雄蛾，記錄每頭雄蛾的行為反應(yīng)類型，包括靜止、起飛、直飛、著陸于誘芯管上等。各種行為的比例=具有該行為的蟲量/試驗(yàn)總蟲量×100%。

1.3 RNA提取、cDNA合成及RT-qPCR分析

誘捕到雄蛾當(dāng)晚21∶00時(shí)對田間樣品取樣，用于基因表達(dá)水平的測定。按照說明書用RNAiso Plus提取總RNA。提取的RNA溶于RNase-Free水中，經(jīng)分光光度計(jì)測定濃度和OD值，然后按照說明書使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa)合成cDNA。cDNA的合成為兩步法，第一步為10 μL體系，包括1 μL總RNA, 2 μL 5×gDNA Eraser Buffer, 1 μL gDNA Eraser和6 μL RNase-free水。第二步為20 μL體系，包括第一步的反應(yīng)液10 μL, 1 μL PrimeScript RT Enzyme Mix I, 1 μL RT Primer Mix, 4 μL 5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)和4 μL RNase-free dH2O。所用的條件為42℃ 2 min, 37℃ 15 min和85℃ 5 s。所有樣品均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

參考轉(zhuǎn)錄組測序(Caoetal, 2014)的分析結(jié)果，設(shè)計(jì)引物的序列(表2)，并選擇Actin和TUB為內(nèi)參基因，以不同誘芯誘捕雄蟲觸角的cDNA為模板，用RT-qPCR對不同配比誘捕到的二化螟雄蛾觸角檢測性信息素識別相關(guān)基因PR1-PR6,PBP1-PBP4和GOBP1-GOBP2的表達(dá)水平。RT-qPCR反應(yīng)體系(20 μL): TB Green Premix Taq II 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, ROX Reference Dye 0.4 μL, DNA模板2 μL, 滅菌水5.6 μL。其中DNA模板為cDNA稀釋4倍的溶液。RT-qPCR在實(shí)時(shí)定量PCR儀(Bio-Rad)上完成，每個(gè)樣品重復(fù)6次。采用兩步法qPCR擴(kuò)增程序：預(yù)變性95 ℃ 3 min；95℃ 10 s, 55℃ 30 s, 39輪循環(huán)。所有的定量PCR數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析。

表2 本研究所用引物

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用軟件SPSS 20.0。多組平均數(shù)間比較采用One-way ANOVA法，差異顯著性分析采用LSD(least significant difference)法和Tamhane’s T2法；風(fēng)洞試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用交叉表法，差異顯著性分析采用卡方檢驗(yàn)(Chi-square test)法。差異顯著性分析時(shí)P>0.05表示差異不顯著，P<0.05則表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同配比性信息素對水稻二化螟的雄蛾誘蛾量占比比較

Z11-16∶Ald和Z9-16∶Ald不同配比性誘芯在全國6省進(jìn)行誘捕試驗(yàn)，結(jié)果顯示7種不同配比性誘芯在田間對水稻二化螟雄蛾均有引誘作用(圖1)。在吉林省，1 045 μg∶35 μg和1 016 μg∶64 μg配比誘芯引誘的雄蛾數(shù)量顯著多于540 μg∶540 μg, 980 μg∶98 μg和1 003 μg∶77 μg配比誘芯引誘的，再顯著多于配比為864 μg∶216 μg和945 μg∶135 μg誘芯引誘的。在遼寧省，1 045 μg∶35 μg, 1 016 μg∶64 μg, 980 μg∶98 μg和945 μg∶135 μg配比誘芯引誘的雄蛾數(shù)量顯著多于540 μg∶540 μg和864 μg∶216 μg配比誘芯引誘的。在安徽省，1 016 μg∶64 μg和980 μg∶98 μg配比誘芯引誘的雄蛾數(shù)量顯著多于1 003 μg∶77 μg和864 μg∶216 μg配比誘芯引誘的，再顯著多于540 μg∶540 μg配比誘芯引誘的。在四川省，1 003 μg∶77 μg, 980 μg∶98 μg和945 μg∶135 μg配比誘芯引誘的雄蛾數(shù)量顯著多于1 045 μg∶35 μg配比誘芯引誘的，再顯著多于540 μg∶540 μg配比誘芯引誘的。在湖南省，1 045 μg∶35 μg配比誘芯引誘的雄蛾數(shù)量顯著多于其余配比誘芯引誘的，1 016 μg∶64 μg和980 μg∶98 μg配比誘芯引誘的雄蛾數(shù)量顯著多于945 μg∶135 μg和864 μg∶216 μg配比誘芯引誘的，再顯著多于540 μg∶540 μg配比誘芯引誘的。在浙江省，1 045 μg∶35 μg配比誘芯引誘的雄蛾數(shù)量顯著多于其余配比誘芯引誘的，540 μg∶540 μg 配比誘芯引誘的雄蛾數(shù)量顯著低于864 μg∶216 μg配比誘芯引誘的，再顯著低于其他配比誘芯引誘的，980 μg∶98 μg配比誘芯引誘的雄蛾數(shù)量顯著低于1 003 μg∶77 μg，1 016 μg∶64 μg和1 045 μg∶35 μg配比誘芯引誘的。上述6省二化螟性信息素誘芯Z11-16∶Ald和Z9-16∶Ald的最佳配比如下：吉林省為1 045 μg∶35 μg和1 016 μg∶64 μg，遼寧省為1 045 μg∶35 μg, 980 μg∶98 μg和945 μg∶135 μg，安徽省為1 016 μg∶64 μg和980 μg∶98 μg，四川省為1 003 μg∶77 μg, 980 μg∶98 μg和945μg∶135 μg，湖南省和浙江省為1 045 μg∶35 μg。同一配比誘芯在上述6省引誘蛾量明顯不同，導(dǎo)致7種不同配比誘芯的誘蛾比例在吉林省、遼寧省、安徽省、四川省、湖南省和浙江省存在差異。結(jié)果表明，不僅誘蛾量最大的誘芯性信息素最佳配比在不同地區(qū)間存在差異，而且不同配比性信息素的誘蛾比例在不同地區(qū)間也存在差異(圖1)。

圖1 中國6省水稻田間不同配比性信息素誘芯誘捕的二化螟雄蛾的誘蛾量占比

2.2 越冬代和二代水稻二化螟的風(fēng)洞行為分析

利用田間性誘的越冬代水稻二化螟進(jìn)行風(fēng)洞行為測定時(shí)，發(fā)現(xiàn)二化螟雄蛾對各種誘芯的起飛率為99.3%～100%。Z11-16∶Ald和Z9-16∶Ald配比為980 μg∶98 μg誘芯誘捕的田間雄蛾在室內(nèi)風(fēng)洞試驗(yàn)中對980 μg∶98 μg, 864 μg∶216 μg和1 016 μg∶64 μg配比誘芯定向飛行的比例分別是15.00%, 15.38%和10.53%，但是這些雄蛾均未著陸到誘芯上(圖2: B)。864 μg∶216 μg配比誘芯誘捕的田間雄蛾在風(fēng)洞中對980 μg∶98 μg, 864 μg∶216 μg和1 016 μg∶64 μg配比誘芯定向飛行的比例分別是6.67%, 28.89%和4.65%，僅有4.4%的雄蛾到達(dá)864 μg∶216 μg配比誘芯，差異顯著性分析表明864 μg∶216 μg配比誘芯誘捕雄蛾對864 μg∶216 μg配比誘芯的行為反應(yīng)顯著強(qiáng)于對980 μg∶98 μg和1 016 μg∶64 μg配比誘芯(圖2: A)。1 016 μg∶64 μg配比誘芯誘捕的田間雄蛾對980 μg∶98 μg, 864 μg∶216 μg和1 016 μg∶64 μg配比誘芯定向飛行的比例分別是6.67%, 8.89%和35.56%，有8.89%的雄蛾到達(dá)1 016 μg∶64 μg配比誘芯，差異顯著性分析表明1 016 μg∶64 μg配比誘芯誘捕的雄蛾對1 016 μg∶64 μg配比誘芯的行為反應(yīng)顯著強(qiáng)于對980 μg∶98 μg和864 μg∶216 μg配比誘芯(圖2：C)。

圖2 田間性誘越冬代二化螟雄蛾對不同配比性信息素誘芯的風(fēng)洞行為反應(yīng)

第2代水稻二化螟進(jìn)行風(fēng)洞行為測定時(shí)，二化螟雄蛾對各種誘芯的起飛率為92.7%～97.0%。如圖3，980 μg∶98 μg配比誘芯誘捕的田間雄蛾對誘芯980 μg∶98 μg, 864 μg∶216 μg和1 016 μg∶64 μg配比誘芯定向飛行的比例分別是7.14%, 2.13%和12.82%，著陸到誘芯的比例分別為4.76%, 2.13%和10.26%，不同配比誘芯間差異不顯著(P>0.05)(圖3：B)；864 μg∶216 μg配比誘芯誘捕的田間雄蛾對980 μg∶98 μg, 864 μg∶216 μg和1 016 μg∶64 μg配比誘芯定向飛行的比例分別是2.04%, 17.54%和0，著陸到誘芯的比例分別為2.04%, 8.77%和0，864 μg∶216 μg配比誘芯誘捕雄蛾對864 μg∶216 μg配比誘芯的行為反應(yīng)顯著強(qiáng)于對980 μg∶98 μg和1 016 μg∶64 μg配比誘芯(圖3: A)；配比為1 016 μg∶64 μg誘芯誘捕的田間雄蛾對980 μg∶98 μg, 864 μg∶216 μg和1 016 μg∶64 μg配比誘芯定向飛行的比例分別是1.54%, 4.48%和18.92%，著陸到誘芯的比例分別為1.54%, 0和9.46%，1 016 μg∶64 μg配比誘芯誘捕雄蛾對1 016 μg∶64 μg配比誘芯的行為反應(yīng)顯著強(qiáng)于864 μg∶216 μg和980 μg∶98 μg配比誘芯(圖3: C)。

圖3 田間性誘第2代二化螟雄蛾對不同配比性信息素誘芯的風(fēng)洞行為反應(yīng)

2.3 二化螟信息素受體和信息素氣味結(jié)合蛋白的定量表達(dá)結(jié)果

采用RT-qPCR的方法分別比較了水稻種植區(qū)Z11-16∶Ald和Z9-16∶Ald不同配比誘芯誘捕的二化螟雄蛾觸角中性信息素識別相關(guān)基因PBP1-PBP3,PR1-PR6和GOBP1-GOBP2的相對表達(dá)水平差異(圖4)。發(fā)現(xiàn)GOBP1基因在各配比誘芯引誘雄蛾觸角中的表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)(圖4: K)。GOBP2基因在864 μg∶216 μg配比誘芯引誘雄蛾觸角中的表達(dá)水平最高，顯著高于除配比1 016 μg∶64 μg外的其余配比誘芯(P<0.05)(圖4: L)。PBP3,PBP4,PR5和PR6基因在864 μg∶216 μg, 945 μg∶135 μg和980 μg∶98 μg配比誘芯引誘雄蛾觸角中的表達(dá)水平顯著高于1 003 μg∶77 μg,1 016 μg∶64 μg和1 045 μg∶35 μg配比誘芯(P<0.05)(圖4: C, D, I, J)。PR1基因在864 μg∶216 μg, 945 μg∶135 μg和980 μg∶98 μg配比誘芯引誘雄蛾觸角中的表達(dá)水平顯著高于1 003 μg∶77 μg和1 045 μg∶35 μg配比誘芯引誘的雄蛾觸角中的(P<0.05)(圖4: E)。PR4基因在864 μg∶216 μg, 945 μg∶135 μg和980 μg∶98 μg配比誘芯引誘雄蛾觸角中的表達(dá)水平顯著高于1 045 μg∶35 μg配比誘芯引誘的雄蛾觸角中的(P<0.05)(圖4: H)。PBP2基因在945 μg∶135 μg配比誘芯引誘雄蛾觸角中的表達(dá)水平最高，顯著高于除配比980 μg∶98 μg外的其余配比誘芯引誘的雄蛾觸角中的(P<0.05)，在980 μg∶98 μg配比誘芯引誘雄蛾觸角中的表達(dá)水平顯著高于1 016 μg∶64 μg配比誘芯引誘的雄蛾觸角中的(P<0.05)(圖4: B)。PR2基因在864 μg∶216 μg和980 μg∶98 μg配比誘芯引誘的雄蛾觸角中的表達(dá)水平顯著高于1 003 μg∶77 μg, 1 016 μg∶64 μg和1 045 μg∶35 μg配比誘芯引誘的雄蛾觸角中的(P<0.05)，在1 016 μg∶64 μg配比誘芯引誘的雄蛾觸角中的表達(dá)水平顯著低于其余配比誘芯引誘的雄蛾觸角中的(P<0.05)(圖4: F)。PR3基因在980 μg∶98 μg配比誘芯引誘的雄蛾觸角中的表達(dá)水平顯著高于其余配比誘芯引誘的雄蛾觸角中的(P<0.05)，在864 μg∶216 μg和945 μg∶135 μg配比誘芯引誘的雄蛾觸角中的表達(dá)水平顯著高于1 003 μg∶77 μg, 1 016 μg∶64 μg和1 045 μg∶35 μg配比誘芯引誘的雄蛾觸角中的(P<0.05)(圖4: G)。PBP1基因在980 μg∶98 μg配比誘芯引誘的雄蛾觸角中的表達(dá)水平最高，顯著高于除配比864 μg∶216 μg外的其余配比誘芯引誘的雄蛾觸角中的(P<0.05)；在1 016 μg∶64 μg配比誘芯引誘雄蛾觸角中的表達(dá)水平最低，顯著低于除配比945 μg∶135 μg外的其余配比誘芯引誘的雄蛾觸角中的(P<0.05)；在864 μg∶216 μg配比誘芯引誘的雄蛾觸角中的表達(dá)水平顯著高于1 003 μg∶77 μg配比誘芯引誘的雄蛾觸角中的(P<0.05)(圖：A)。

圖4 性信息素識別相關(guān)基因在不同配比誘芯田間誘捕二化螟雄蛾觸角中的相對表達(dá)量

相關(guān)性分析表明，GOBP1,GOBP2,PBP1,PBP2和PR3基因的表達(dá)水平與不同性信息素配比之間無顯著的線性相關(guān)性(P≥0.064)，其余性信息素識別基因的表達(dá)水平與不同性信息素配比之間均存在顯著的線性相關(guān)性(r≤-0.847,P≤0.033)，其中PR2和PR6的表達(dá)水平與不同性信息素配比之間存在極顯著的線性相關(guān)性(r≤-0.935,P≤0.006)。

3 討論

利用Z11-16∶Ald和Z9-16∶Ald不同配比的性信息素誘芯在同一田塊對二化螟雄蛾進(jìn)行誘捕比較試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)二化螟主要性信息素成分Z11-16∶Ald和Z9-16∶Ald的比例從540 μg∶540 μg至1 045 μg∶35 μg的各混合物均能引誘到雄蛾(圖1)，表明同一二化螟種群不同個(gè)體雄蛾對不同配比性信息素誘芯的嗅覺行為反應(yīng)存在差異。進(jìn)一步的風(fēng)洞行為測定更證實(shí)了這種嗅覺差異。將不同配比性信息素誘芯引誘的田間二化螟雄蛾帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行風(fēng)洞試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)田間864 μg∶216 μg配比性信息素誘芯引誘到的雄蛾對室內(nèi)864 μg∶216 μg配比誘芯的反應(yīng)顯著高于對980 μg∶98 μg和1 016 μg∶64 μg配比誘芯的反應(yīng)，田間1 016 μg∶64 μg配比性信息素誘芯引誘的雄蛾對室內(nèi)1 016 μg∶64 μg配比誘芯的嗅覺反應(yīng)顯著高于對864 μg∶216 μg和980 μg∶98 μg配比誘芯(圖2和3)，再次證實(shí)864 μg∶216 μg和1 016 μg∶64 μg配比性信息素誘芯引誘到的雄蛾性信息素嗅覺反應(yīng)存在差異，也證實(shí)同一二化螟種群中確實(shí)存在不同性信息素嗅覺反應(yīng)的雄蛾。據(jù)此，我們可以將嗅覺反應(yīng)相近的個(gè)體理解為一個(gè)嗅覺組，同一害蟲種群由多個(gè)嗅覺組組成。在風(fēng)洞試驗(yàn)中，部分864 μg∶216 μg配比性信息素引誘的雄蛾也向980 μg∶98 μg和1 016 μg∶64 μg配比性信息素誘芯飛行，部分1 016 μg∶64 μg配比性信息素引誘雄蛾也向980 μg∶98 μg和864 μg∶216 μg配比性信息素誘芯飛行，980 μg∶98 μg配比性信息素誘芯引誘的雄蛾向864 μg∶216 μg, 980 μg∶98 μg和1 016 μg∶64 μg配比性信息素誘芯飛行的比例無差異，表明這些個(gè)體的嗅覺譜可能比較廣，它們可能可以識別較大范圍的性信息素配比。

蛾類昆蟲對性信息素的識別過程非常復(fù)雜，雌蟲釋放的性信息素首先通過雄性觸角感器上的小孔進(jìn)入感器中，脂溶性的性信息素通過與性信息素結(jié)合蛋白(PBP)形成聚合物的方式進(jìn)入蛾類昆蟲感器內(nèi)的血淋巴中，進(jìn)而到達(dá)神經(jīng)細(xì)胞樹突膜，和性信息素受體結(jié)合，刺激嗅覺神經(jīng)，產(chǎn)生動作電位，將攜帶的化學(xué)信息轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枺箅娦盘柾ㄟ^神經(jīng)突觸傳入蛾類昆蟲腦部觸角葉中進(jìn)行整合，經(jīng)過整合的電信號被傳入蛾類昆蟲大腦并產(chǎn)生相應(yīng)的行為。該過程中，性信息素識別基因的表達(dá)水平會影響最終的昆蟲行為。本研究的結(jié)果也證實(shí)了相關(guān)嗅覺基因在不同配比性信息素誘捕到的雄蛾觸角中的表達(dá)量存在顯著差異。斜紋夜蛾不同配比合成性信息素誘捕的雄蛾嗅覺受體基因表達(dá)水平也存在差異(Linetal., 2015; Zhangetal., 2017)。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，在目前研究的性信息素結(jié)合蛋白基因中，GOBP1,GOBP2,PBP1和PBP2的表達(dá)水平與性信息素配比之間無顯著的線性相關(guān)性(P>0.321)，而PBP3和PBP4的表達(dá)水平與性信息素配比之間均存在顯著線性相關(guān)(P=0.033)。已有研究表明，PBP2不與二化螟性信息素組分結(jié)合，PBP1, GOBP1和GOBP2雖然結(jié)合二化螟性信息素組分，但是PBP1還結(jié)合其他昆蟲性信息素組分(Changetal., 2015; Dongetal., 2019)，GOBP1和GOBP2還結(jié)合植物氣味(Gongetal., 2009; Khuhroetal., 2017)，相反PBP3和PBP4與二化螟性信息素組分的結(jié)合能力明顯強(qiáng)于其他昆蟲性信息素組分(Changetal., 2015)。PBP3和PBP4可能才是二化螟觸角中結(jié)合性信息素的關(guān)鍵蛋白。在目前研究的性信息素受體基因中，PR3基因的表達(dá)水平與不同性信息素配比之間無顯著線性相關(guān)(P=0.064)，其余性信息素受體基因的表達(dá)水平與不同性信息素配比之間均存在顯著線性相關(guān)(P<0.023)(圖4)。目前已經(jīng)證實(shí)PR3對二化螟性信息素組分無反應(yīng)，PR1, PR2, PR4和PR6均對二化螟性信息素組分有反應(yīng)(Changetal., 2015)。有趣的是，有研究證實(shí)PR5對二化螟性信息素組分無反應(yīng)(Changetal., 2015)，但是本研究中PR5基因的表達(dá)水平與不同性信息素配比之間存在顯著線性相關(guān)(P=0.023)(圖4)，這可能是由于二化螟性信息素中還有微量組分未被鑒定或者被測定。

本研究中，每個(gè)省份使用的Z11-16∶Ald 和Z9-16∶Ald系列配比中，均有一個(gè)配比的誘蛾量高于其余配比，表明利用單一配比性信息素進(jìn)行群集誘殺時(shí)，必須選擇誘蛾量最高的配比作為當(dāng)?shù)氐淖罴雅浔取＠缭谡憬。? 045 μg∶35 μg配比性信息素誘芯的誘蛾量顯著高于其余配比，表明浙江省的二化螟種群以識別1 045 μg∶35 μg配比誘芯的雄蛾數(shù)量最多。在利用單一配比性信息素對浙江二化螟進(jìn)行群集誘殺時(shí)，我們需要選擇配比為1 045 μg∶35 μg的性信息素誘芯，如果選擇540 μg∶540 μg～1 045 μg∶35 μg間的任何一個(gè)配比，誘蛾量就明顯降低(圖1)。但是不同省份二化螟性信息素的最佳配比存在差異，在推廣應(yīng)用單一配比性誘劑進(jìn)行群集誘殺前，需要對施用地害蟲種群的性信息素配比進(jìn)行篩選，找出針對該種群主要嗅覺組的性信息素配方，才能取得較好的防效。如果只是簡單地將其他地方使用的配方搬來使用，可能會出現(xiàn)誘蟲量低、防效差等情況。

從本研究結(jié)果，以及我們多年大量的、不同種植結(jié)構(gòu)的田間試驗(yàn)示范結(jié)果來看，即使選擇誘蛾量最高的最佳配比用于性誘防控，也只能誘捕田間雄蛾的一部分。田間剩下的雄蛾由于對最佳配比誘芯反應(yīng)并不強(qiáng)烈，并不能及時(shí)被該誘芯所引誘。因此在田間群集誘殺時(shí)，單一最佳配比是不夠的。此外，同一種群二化螟個(gè)體的性信息素嗅覺反應(yīng)差異可能給性信息素群集誘殺防治二化螟帶來挑戰(zhàn)。當(dāng)利用單一配比性信息素進(jìn)行害蟲群集誘殺時(shí)，雖然大量誘殺了對該配比反應(yīng)強(qiáng)列的二化螟雄蛾，但是隨著使用時(shí)間的增加，種群中對該配比反應(yīng)強(qiáng)列雄蛾的數(shù)量急劇減少，而對該配比反應(yīng)弱的雄蛾數(shù)量急劇增加，導(dǎo)致該配比性信息素誘蟲量急劇減少、防效急劇降低，害蟲種群對該配比性信息素快速表現(xiàn)出“抗性”。

為了避免害蟲種群對單一配比性信息素快速表現(xiàn)出“抗性”，提高性信息素群集誘殺的防控效果，我們認(rèn)為可以采用多配比誘芯組合的害蟲誘殺新技術(shù)，即同時(shí)利用多種配比的誘芯組合對二化螟進(jìn)行組合誘殺。多配比誘芯組合誘殺技術(shù)能夠?qū)ν缓οx種群中不同性信息素嗅覺反應(yīng)個(gè)體進(jìn)行整體誘殺，不僅拓寬了二化螟性誘劑的引誘譜，增加了性誘防控效果，而且同時(shí)壓低了害蟲種群中不同嗅覺反應(yīng)組的雄蛾數(shù)量，避免了單一配比誘殺導(dǎo)致對該配比無反應(yīng)雄蛾數(shù)量急劇大量增加問題，避免和減緩了害蟲種群對性信息素的嗅覺適應(yīng)性。從2018年在浙江溫嶺所做的對第3代和第4代二化螟初步田間防治效果的比較試驗(yàn)中，3種不同配比誘芯組合的誘殺方法的防治效果比單一最佳配比誘芯要高出約20%(杜永均, 未發(fā)表資料)。另外，多配比組合誘殺技術(shù)由于同時(shí)使用了多種性信息素配比，可以有效解決性信息素地理種群差異這一應(yīng)用難題，實(shí)現(xiàn)不同地區(qū)使用同一套性誘技術(shù)進(jìn)行高效防控。

綜上所述，二化螟雄蛾對性信息素的嗅覺行為反應(yīng)存在地理種群差異，而這種差異不僅表現(xiàn)在誘蛾量最大的最佳配比上，也表現(xiàn)在種群嗅覺組的分布上。這方面的知識有助于性信息素田間應(yīng)用技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用效果提升。

致謝安徽省涇縣植保站、吉林省德惠縣植保站和遼寧太子河農(nóng)技中心給予部分田間試驗(yàn)的支持，特此致謝！