劉猜，辛華

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東青島 266109)

植物細(xì)胞壁以多種方式發(fā)揮作用，例如，為細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支持、抵抗病原體并促進(jìn)細(xì)胞之間的通訊。細(xì)胞壁的主要成分是多糖，包括纖維素、半纖維素和果膠等。纖維素和半纖維素被認(rèn)為可以提供壁的拉伸強(qiáng)度，而果膠主要參與細(xì)胞與細(xì)胞的黏附并確定壁的孔隙度[1]。果膠存在于所有細(xì)胞中，不僅位于初生壁，而且構(gòu)成中間層。果膠在初生壁中的含量高達(dá)30%[2-3]，對(duì)維持細(xì)胞壁穩(wěn)定和抗壓能力有一定的作用，也是植物應(yīng)對(duì)病原體侵害的重要屏障。在細(xì)胞壁的多種組成成分中，果膠是細(xì)胞壁中最復(fù)雜的一種。對(duì)兩個(gè)品種的玉米(Zeamays)根細(xì)胞壁進(jìn)行傅立葉紅外光譜(Fourier Transform Infrared，F(xiàn)TIR)檢測，官能團(tuán)分析發(fā)現(xiàn)，吸附鉛(Pb)后細(xì)胞壁的部分官能團(tuán)的位置發(fā)生了明顯的變化[4]。高濃度鎘(Cd)會(huì)抑制旱柳(Salixmatsudana)莖和根的生長，根系是Cd積累的主要部位，Cd積累的量與根系細(xì)胞壁多糖的含量和結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，其中果膠含量顯著增加[5]。另有研究表明，氧化鑭納米顆粒(La2O3NPs)(>100 mg/L)暴露顯著抑制蘿卜(Raphanussativus)細(xì)胞壁的果膠合成[6]。

果膠由4個(gè)主要的多糖結(jié)構(gòu)域組成：同型半乳糖醛酸聚糖(HG)，鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I(RGI)，鼠李糖半乳糖醛酸聚糖II(RGII)和木糖半乳糖醛酸聚糖(XGA)。其中主要成分是HG，約占果膠總量的65%[7]。果膠在高爾基體中合成，高爾基體膜上的糖基轉(zhuǎn)移酶(GTs)將核糖上的糖基轉(zhuǎn)移到寡糖或多糖受體上，并以高度甲基酯化的形式轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞壁[8-11]。Zheng等[12]在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中過表達(dá)棉花(Gossypiumhirsutum)GhGATL2、GhGATL9、GhGATL12、GhGATL15基因和沉默GhGATL15(VIGS)基因，對(duì)果膠含量測試表明，果膠在轉(zhuǎn)基因品系中顯著增加，而在VIGS植物中則降低，表明GhGATL基因參與果膠合成。GAUT4沉默的番茄(Lycopersiconesculentum)植株顯示出果膠的成分發(fā)生了變化，果膠的含量降低[13]。擬南芥的3個(gè)AtGATL基因(atgatl3、atgatl6和atgatl9)中攜帶T-DNA插入的植物在其莖細(xì)胞壁中的半乳糖醛酸含量減少[14]。

氧化銅納米顆粒(CuO NPs)是一種新型的功能材料，已越來越廣泛地應(yīng)用于氣體傳感器[15]、木材防腐[16]、船舶防污、塑料和金屬涂料[17]，減少摩擦的抗磨添加劑[18]和抗菌劑[19]。隨著CuO NPs使用量的增加，其不可避免的會(huì)進(jìn)入到環(huán)境中，關(guān)于CuO NPs所具有的潛在生態(tài)毒性與環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)也正逐漸成為研究熱點(diǎn)。迄今為止，關(guān)于逆境中植物細(xì)胞壁的反應(yīng)主要集中在重金屬和鹽脅迫的研究方面，關(guān)于納米材料的報(bào)道很少。本研究以大豆(Glycinemax)種子為試驗(yàn)材料，水培生根，探討CuO NPs對(duì)大豆根細(xì)胞壁及果膠的影響，同時(shí)對(duì)果膠合成相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)分析，旨在為植物細(xì)胞壁及果膠的防御機(jī)制提供進(jìn)一步的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

CuO NPs購自Sigma-Aldrich公司，CuO NPs基本上呈橢圓形，粒徑約為40 nm[20]。分別稱取2、5和10 mg 的CuO NPs，加入1L蒸餾水，超聲震蕩(100 W，40 kHz)30 min，配制成懸浮液。

沖洗大豆種子，然后將其浸泡在蒸餾水中。種子膨脹后，將它們放入小框子中，并用紗布覆蓋，以保持種子濕潤發(fā)芽。種子發(fā)芽后，將它們放在帶孔的小籃子里(直徑約0.5 cm)，主根將通過孔伸入裝有蒸餾水的塑料盆中。當(dāng)根長約為2 cm時(shí)，分別用不同濃度(2、5、10 mg/L)的CuO NPs處理24 h和48 h。對(duì)照組用蒸餾水處理。每天每個(gè)處理攪拌3次，以防止顆粒聚集和沉淀。

1.2 超薄切片

分別取蒸餾水和5 mg/L CuO NPs處理48 h后的大豆根尖分生區(qū)，多聚甲醛-戊二醛固定液固定后，鋨酸二次固定，系列丙酮溶液脫水，不同比例丙酮-樹脂逐步滲透包埋。包埋塊用Leica超薄切片機(jī)切片(厚度80 nm)，切片用醋酸鈾-檸檬酸鉛染色后，用透射電子顯微鏡(日立HT7700)觀察，并拍照。

1.3 細(xì)胞壁的提取

取3 g不同CuO NPs處理濃度(0、5 mg/L)的新鮮根，加液氮研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，加入30 mL 75%乙醇浸沒混勻，冰浴20 min，8 000 r/min離心15 min，重復(fù)提取3次。棄上清，再加入30 mL甲醇∶三氯甲烷(V/V)=1∶1溶液提取1次，冰浴20 min后離心。棄上清后加入30 mL丙酮提取1次，冰浴20 min后離心，棄上清。得到的沉淀即為細(xì)胞壁，冷凍干燥后備用。

1.4 FTIR紅外光譜

將對(duì)照和5 mg/L CuO NPs處理48 h根的1 mg細(xì)胞壁干燥樣品與100 mg溴化鉀混合研磨壓片，在4 000～400 cm-1區(qū)間進(jìn)行傅立葉紅外光譜儀(FTIR Spectrometer)掃描，觀察譜峰情況。

1.5 果膠的提取

稱取干燥的細(xì)胞壁25 mg，加入5 mL 0.5%草酸銨緩沖液(含0.1%的NaHB4)，沸水浴1 h，6 000 r/min離心10 min，收集上清，重復(fù)3次，上清即為果膠。將所得上清用MSC050超濾杯、5 000 D超濾膜進(jìn)行超濾濃縮[21]。

1.6 高效液相色譜

D- (+) -半乳糖醛酸(D-Galacturonic acid)、L- (+) -鼠李糖(L-rhamnose monohydrate)、甘露糖(D-Mannose)和半乳糖(Galactose)購自索萊寶公司；甲醇、乙腈、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉均為色譜純，其他試劑均為分析純。

分別取4種單糖各5 mg、多糖樣品1～2 mg于旋口玻璃管中，加入2 mol/L的三氟乙酸(TFA) 0.5 mL，120 ℃水解2 h，空氣泵吹干。水解吹干后，加入0.3 mol/L NaOH 溶液及 0.5 mol/L PMP/甲醇溶液各0.5 mL，充分混勻后70 ℃避光反應(yīng)30 min。冷卻至室溫，加入與 NaOH 等物質(zhì)的量的HCl中和，氯仿萃取去除多余的衍生試劑，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾至棕色樣品瓶中，待HPLC(安捷倫公司)檢測。高效液相色譜檢測條件：ODS2 HypersilTM C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(Thermo Hypersil)，流動(dòng)相為0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH6.7)∶乙腈(V /V)= 82∶18溶液，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長245 nm。

1.7 CuO NPs處理后大豆根中果膠合成相關(guān)基因的系統(tǒng)分析

取對(duì)照和5 mg/L Cuo NPs處理48 h的大豆根進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選其有顯著性差異的基因。

在https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/的Clustal Omega進(jìn)行同源性比對(duì)，再用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，建樹參數(shù)bootstrap=1 000次重復(fù)。

1.8 果膠合成相關(guān)基因的qRT-PCR

分別取0、2、5和10 mg/L CuO NPs處理24 h和48 h的大豆根，液氮速凍，-80 ℃保存。RNA的提取按照TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(TaKaRa，大連)說明書進(jìn)行。

采用Primer primier 5.0、DNAMAN和NCBI進(jìn)行qRT-PCR的引物設(shè)計(jì)，引物序列見表1，并將大豆組成型表達(dá)cyclophilin(CYP2)基因作為內(nèi)參基因。

表1 qRT-PCR所需引物Table 1 Primers required for qRT-PCR

1.9 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2010和DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并使用LSD方法進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CuO NPs對(duì)大豆根分生區(qū)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

透射電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組大豆根尖分生區(qū)細(xì)胞的細(xì)胞核大，且位于細(xì)胞中央，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)明顯，細(xì)胞壁平滑(圖1a、1b)；而CuO NPs處理后，液泡化現(xiàn)象嚴(yán)重，較難觀察到正常的細(xì)胞核，細(xì)胞器減少，細(xì)胞壁也受到明顯的損傷，厚度變得不均一(圖1c、1d)。

2.2 CuO NPs對(duì)細(xì)胞壁官能團(tuán)的影響

FTIR 譜圖可以表征能夠離子化的基團(tuán)，如羧基、羥基、氨基等在重金屬吸附過程中的作用。當(dāng)官能團(tuán)參與金屬結(jié)合時(shí)，其吸收峰會(huì)發(fā)生偏移，因此可以通過峰位的位移來判斷參與金屬結(jié)合的官能團(tuán)[22-23]。果膠和多糖鏈C—C或C—O屬于果膠質(zhì)中的特征峰，均明顯向低頻移動(dòng)(表2)，說明在CuO NPs處理后果膠質(zhì)在一定程度上參與了銅的化學(xué)吸附，從而削弱了細(xì)胞壁表面氫鍵的作用。1 257 cm-1處硫酸酯特征峰出現(xiàn)下降，說明吸收銅后細(xì)胞壁硫酸酯化程度降低。

表2 大豆根細(xì)胞壁FTIR譜圖官能團(tuán)分析Table 2 Functional group analysis of FTIR spectrumdry of cell walls in soybean roots 單位：cm-1

2.3 CuO NPs處理后大豆根中果膠成分變化

我們通過HPLC對(duì)5 mg/L CuO NPs處理24 h大豆根細(xì)胞壁中的果膠成分進(jìn)行了含量分析。果膠類多糖中含量較多的為HG和RG-I，我們選取其中4種單糖(半乳糖醛酸、半乳糖、鼠李糖和甘露糖)進(jìn)行比較分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品衍生產(chǎn)物的 HPLC 色譜圖的峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算所測定的4種糖在提取的干燥細(xì)胞壁樣品中的含量。在CuO NPs處理后，這4種糖含量都出現(xiàn)了一定的增多，其中甘露糖變化最明顯，為對(duì)照的5.94倍。但是半乳糖醛酸和半乳糖在大豆根中含量較多，且在CuO NPs處理的大豆根中，半乳糖醛酸含量增加較明顯，為對(duì)照的2.09倍。

表3 不同處理的大豆根細(xì)胞壁樣品中4種糖含量Table 3 Contents of 4 kinds of sugar in cell wall samples with different CuO NPs treatments 單位：μg/g

2.4 CuO NPs處理后大豆根中的果膠合成相關(guān)差異基因

通過轉(zhuǎn)錄組測序，在大豆根中共發(fā)現(xiàn)了58個(gè)果膠合成酶相關(guān)的候選基因。其中的差異顯著基因有15個(gè)，包括11個(gè)半乳糖醛糖基轉(zhuǎn)移酶/GAUT基因(HG合成相關(guān))，1個(gè)α-1,5-阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶/ARAD1基因(鼠李聚半乳糖醛酸合成相關(guān))，3個(gè)木糖基轉(zhuǎn)移酶基因/XGD1(木糖聚半乳糖醛酸合成相關(guān))。其中只有2個(gè)基因在CuO NPs處理48 h后上調(diào)。

a, b：蒸餾水培養(yǎng)；c, d：5 mg/L CuO NPs處理a,b: Distilled water culture; c,d: 5 mg/L CuO NPs treatment圖1 CuO NPs處理對(duì)大豆根分生區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)影響Fig. 1 Effects of CuO NPs on the cell structure of soybean root meristem

圖2 CuO NPs處理后大豆根中的果膠合成相關(guān)的差異基因及進(jìn)化樹Fig. 2 Differential genes and evolutionary tree related to pectin synthesis in soybean roots with CuO NPs treatment

A. GmGATL1; B. GmGATL3; C. GmGATL7; D. GmGAUT4; E. GmGAUT12; F. GmGAUT15圖3 大豆根中果膠合成相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量Fig. 3 Relative expression levels of pectin synthesis related genes in soybean roots

2.5 CuO NPs處理對(duì)大豆根果膠合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

由于HG在果膠成分中含量最為豐富，且在 CuO NPs處理后變化最大。為了進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組中與果膠合成相關(guān)酶基因的表達(dá)變化，我們篩選了轉(zhuǎn)錄組測序中豐度較高的基因進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn)，GmGATL1和GmGAUT4在2 mg/L和5 mg/L CuO NPs處理24 h時(shí)，相對(duì)表達(dá)量隨濃度升高而出現(xiàn)上調(diào)，而在10 mg/L CuO NPs處理24 h時(shí)又出現(xiàn)下調(diào)，處理至48 h時(shí)，基因的表達(dá)量出現(xiàn)濃度依賴性的下調(diào)。GmGATL3在2 mg/L CuO NPs處理24 h時(shí)其相對(duì)表達(dá)量未發(fā)生明顯變化，在48 h處理時(shí)上調(diào)；在5 mg/L處理24 h出現(xiàn)上調(diào)，而在10 mg/L CuO NPs處理24 h時(shí)又出現(xiàn)下調(diào)，在5 mg/L和10 mg/L CuO NPs處理48 h時(shí)則一直呈下調(diào)狀態(tài)。GmGATL7基因在2 mg/L CuO NPs處理24 h時(shí)上調(diào)，在處理48 h時(shí)下調(diào)，5和10 mg/L CuO NPs處理時(shí)則一直呈下調(diào)狀態(tài)。GmGAUT12隨處理濃度的增加出現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的狀態(tài)，因此我們認(rèn)為GmGAUT12可能是一個(gè)負(fù)調(diào)控基因。GmGAUT15在CuO NPs處理后則隨濃度的升高而下調(diào)。

3 討論

植物細(xì)胞是植物生命活動(dòng)的結(jié)構(gòu)與功能的基本單位。當(dāng)用氧化鋅納米顆粒(ZnO NPs)處理黑麥草(Loliumperenne)幼苗時(shí)，其根尖收縮，在分生區(qū)細(xì)胞中發(fā)生液泡化[24]。本研究透射電鏡結(jié)果中顯示出嚴(yán)重的細(xì)胞液泡化現(xiàn)象，并在CuO NPs處理的大豆中發(fā)現(xiàn)了被破壞的細(xì)胞壁。高等植物的細(xì)胞壁主要成分包括多糖、蛋白質(zhì)、木質(zhì)素和酯類化合物等，在植物的生長發(fā)育和響應(yīng)各種逆境脅迫中起著重要的作用，更是阻止重金屬離子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的第一道屏障。植物細(xì)胞通常通過增加細(xì)胞壁中果膠多糖的含量，來提高結(jié)合重金屬離子的能力，使金屬離子在細(xì)胞壁中積累，避免其過多的進(jìn)入原生質(zhì)體，危害細(xì)胞的生長發(fā)育。La2O3NPs下調(diào)了細(xì)胞壁果膠和IAA生物合成中涉及的核心基因而改變了根細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)[25]。在本研究中，F(xiàn)TIR譜圖顯示果膠和多糖鏈相關(guān)的官能團(tuán)出現(xiàn)偏移，說明果膠可能參與了CuO NPs的防御。在Pb處理的擬南芥、雜交白楊(PopulustremulaL. x tremuloides Michx.)和浮萍(Lemnatrisulca)中，生長的細(xì)胞中均形成低甲酯化的HG來增厚細(xì)胞壁，用于Pb在細(xì)胞壁中的積累[26]。蕨類植物海金沙(Lygodiumjaponicum)中的大多數(shù)Cu都與細(xì)胞壁果膠的HG緊密結(jié)合[27]。我們用CuO NPs處理大豆根后，發(fā)現(xiàn)其果膠中的HG含量出現(xiàn)明顯的增多，說明果膠在對(duì)納米顆粒的防御中起著積極的作用。轉(zhuǎn)錄組測序分析表明，部分與果膠合成相關(guān)的基因在CuO NPs處理后發(fā)生顯著變化，通過定量進(jìn)一步分析6種果膠合成酶基因的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，GmGAUT和GmGATL基因在應(yīng)對(duì)CuO NPs脅迫時(shí)表現(xiàn)出不同的表達(dá)趨勢，但它們主要在低濃度(2 mg/L或5 mg/L)處理24 h時(shí)表現(xiàn)出積極的響應(yīng)，濃度過高或處理時(shí)間較長則不能再響應(yīng)外界脅迫。在CuO NPs處理48 h時(shí)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞核出現(xiàn)損傷，細(xì)胞不能正常進(jìn)行染色體復(fù)制和細(xì)胞分裂，導(dǎo)致基因表達(dá)隨處理濃度升高一直處于下調(diào)狀態(tài)。目前僅是對(duì)大豆細(xì)胞壁果膠含量變化的鑒定和果膠相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的分析，但細(xì)胞壁是如何防御CuO NPs的相關(guān)的基因功能驗(yàn)證有待進(jìn)一步研究。