王飛飛，王夏雯，金倩，張智慧，王信海

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院宿遷農(nóng)科所，江蘇宿遷 223800)

克氏原螯蝦 (Procambarusclarkii) ，俗稱小龍蝦，廣泛分布于湖北、江蘇、安徽、浙江、湖南、山東等省市。近年來，隨著稻蝦種養(yǎng)模式的推廣，產(chǎn)業(yè)規(guī)模迅速增長，已成為中國重要出口創(chuàng)匯水產(chǎn)品之一[1]，2017年小龍蝦出口超過100萬噸，銷售額達(dá)到370億美元，出口量占全球80%。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，病害問題也日益突出，如白斑綜合征病毒病(White Spot Syndrome Virus，WSSV)、腸炎、甲殼潰爛病等[2-3]，嚴(yán)重制約了克氏原螯蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

微生物菌群在水產(chǎn)養(yǎng)殖中發(fā)揮重要作用，研究表明菌群與寄主健康有著密切的聯(lián)系，如凡納濱對(duì)蝦感染W(wǎng)SSV后，腸道菌群組成和功能與健康蝦相比差異明顯[4]，中華絨螯蟹感染肝胰腺病變綜合征后，鰓、肝胰腺、腸道菌群變化幅度較大，且組織間菌群相關(guān)性明顯[5]。另有研究表明水產(chǎn)品腸道等組織菌群結(jié)構(gòu)與養(yǎng)殖環(huán)境密切相關(guān)[6-8]。稻蝦共作模式是一種高效的種植與養(yǎng)殖相結(jié)合的生態(tài)系統(tǒng)，研究該模式下小龍蝦腸道等組織及其養(yǎng)殖環(huán)境微生物多樣性，有助于改善小龍蝦養(yǎng)殖環(huán)境生態(tài)功能，提高養(yǎng)殖水平。目前相關(guān)研究未見報(bào)道。

高通量測序技術(shù)因其能完整反映測試樣品的菌群結(jié)構(gòu)特征，逐漸成為研究微生物菌群結(jié)構(gòu)的重要工具[9]，本試驗(yàn)基于Illumina Miseq測序平臺(tái)對(duì)樣品中的克氏原螯蝦、肝胰腺、鰓、養(yǎng)殖水體以及池塘底泥等細(xì)菌微生物16S rRNA基因序列進(jìn)行測定，分析稻蝦共作模式下小龍蝦腸道等組織及其養(yǎng)殖環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)，全面客觀反應(yīng)稻蝦模式下小龍蝦腸道、肝胰腺、鰓、水體、底泥微生物菌群多樣性及其相互關(guān)系，為高效開展稻蝦養(yǎng)殖及小龍蝦疾病防控提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)與樣品采集

試驗(yàn)地點(diǎn)位于江蘇省宿遷市宿豫區(qū)(33°97′32″N，118°32′30″E)，屬于亞熱帶氣風(fēng)氣候，年均降雨量1 400 mm，采樣地點(diǎn)稻蝦共作已有5年，面積2.5 hm2，圍溝寬5 m，深1.2 m，土壤為壤土。2019年7月2日放養(yǎng)平均質(zhì)量為5 g的克氏原螯蝦蝦苗75 000尾/hm2，其間投喂專用配合飼料，每天上午、下午各1次。

采樣時(shí)間為2019年8月20日上午 8:00—9:00，從池塘隨機(jī)采集5尾大小相近的健康克氏原螯蝦，平均體質(zhì)量為(23.5±1.8)g，平均體長(9.5±0.2)cm。設(shè)置一個(gè)固定采樣點(diǎn)，距離岸邊2 m，分別用滅菌過的有機(jī)玻璃采水器和采泥器采集水樣(水面下0.5 m)和底泥(水底表層5 cm)，裝入無菌采水瓶和采樣袋。采集樣品均置于冰盒中運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。

稻蝦共作水體 pH值的測量使用PHBJ-260便攜式pH測定儀型(上海精密儀器廠生產(chǎn))；水溫測定使用WNY-01直形棒式普通玻璃溫度計(jì)，在水深0.5 m和1.5 m處分別測量取平均值；溶解氧采用YSI DO 200型便攜式溶解氧測定儀(北京康高特科技有限公司生產(chǎn))；其余各項(xiàng)水化指標(biāo)的測定均按照《水和廢水監(jiān)測分析方法》在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成[10]。水化分析采用《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB3838—2002)和《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(GB11607—89)的方法完成。

1.2 樣品處理

樣品運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后，立即在超凈工作臺(tái)無菌環(huán)境下，對(duì)5尾小龍蝦體表進(jìn)行消毒、解剖，分別收集腸道內(nèi)容物、肝胰腺、鰓，充分混合置于無菌離心管；取水樣50 mL，用孔徑為0.22 μm無菌纖維素濾膜過濾，過濾后，濾膜置于無菌離心管，底泥充分混合后置于無菌袋中。5份樣品處理完成后立即放入干冰盒中，送至南京鑫普華生物科技有限公司進(jìn)行樣品處理及測序，具體測序方法、步驟按照文獻(xiàn)[11-12]中的方法進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測序后，根據(jù)序列首尾兩端的Barcode和引物區(qū)分樣品，并調(diào)整序列方向，Barcode允許的錯(cuò)配數(shù)為0，最大引物錯(cuò)配數(shù)為2；用Pandaseq軟件，根據(jù)PE reads之間的Overlap關(guān)系，將成對(duì)Reads拼接(merge)成一條序列，最小Overlap長度為10 bp；拼接序列的Overlap區(qū)允許的最大錯(cuò)配比率為0.2，篩選不符合序列；用PRINSEQ軟件，過濾reads平均質(zhì)量值20以下的堿基，過濾掉N堿基數(shù)量大于5的序列；用Usearch軟件，采用Denovo和Uchime結(jié)合的方式去除嵌合體，使用Gold數(shù)據(jù)庫。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析方法

1.4.1 OTU聚類與物種注釋

將序列完全一樣的Clean reads歸為一種Tag，并統(tǒng)計(jì)每條Tag對(duì)應(yīng)的豐度(即reads數(shù)目)，將其中的Singletons(對(duì)應(yīng)reads只有一條的序列)過濾掉，利用Usearch在0.97%相似度下進(jìn)行聚類，對(duì)聚類后的序列進(jìn)行嵌合體過濾后，得到用于物種分類的OTU(Operational Taxonomic Units)。從各個(gè)OTU中挑選出豐度最高的一條序列，作為該OTU的代表序列。使用Uclust方法，將該代表序列與已知物種的16S數(shù)據(jù)庫(Silva數(shù)據(jù)庫)進(jìn)行比對(duì)，從而對(duì)每個(gè)OTU進(jìn)行物種歸類。

1.4.2 Alpha 指數(shù)分析

Alpha多樣性(Alpha Diversity)是對(duì)某個(gè)樣品中物種多樣性的分析，包含樣品中的物種組成的豐富度(Richness)和均勻度(Evenness)兩個(gè)因素，通常用Observed species指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)以及PD_whole_tree指數(shù)等來評(píng)估某個(gè)樣本的物種多樣性。Observed species指數(shù)和Chao1指數(shù)反映樣品中群落的豐富度(Species richness)。Shannon指數(shù)以及Simpson指數(shù)反映群落的多樣性(Species diversity)，PD_whole_tree指數(shù)反應(yīng)了樣品中物種對(duì)進(jìn)化歷史保存的差異，PD_whole_tree指數(shù)越大說明物種對(duì)進(jìn)化歷史保存的差異越大。Goods_coverage指數(shù)反應(yīng)了測序的深度，指數(shù)越接近于1，說明測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種。

1.4.3 熱圖(Heatmap)分析

Heatmap是以顏色梯度來代表數(shù)據(jù)矩陣中數(shù)值的大小并能根據(jù)物種或樣品豐度相似性進(jìn)行聚類的一種圖形展示方式。利用 R語言 Vegan包，Vegdist和Hclust進(jìn)行距離計(jì)算和聚類分析；用chao算法計(jì)算距離，complete方法聚類，聚類結(jié)果加上樣品的處理或取樣環(huán)境分組信息，可以直觀觀察到相同處理或相似環(huán)境樣品的聚類情況。

1.4.4 主坐標(biāo)分析(Principal coordinates analysis，PCoA)

為了進(jìn)一步展示樣品間物種多樣性差異，使用PCoA的方法展示各個(gè)樣品間的差異大小?；贐ray curtis距離、Weighted Unifrac距離和Unweighted Unifrac距離來進(jìn)行PCoA分析。

為了便于作圖處理，稻蝦共作模式下所取試驗(yàn)樣品水體、底泥、腸道、鰓、肝胰腺分別用英文縮寫CW、CS、CI、CG、CH代替。

2 結(jié)果與分析

2.1 水質(zhì)主要理化指標(biāo)

采集的稻蝦共作水質(zhì)指標(biāo)如下：水溫(27.6±0.1)℃，pH(8.11±0.05)，化學(xué)需氧量(COD)為(23.31±1.8)mg/L，硝酸鹽(NO3-N)(0.021±0.002)mg/L，亞硝酸鹽(NO2-N )(0.005±0.001)mg/L，磷酸鹽(PO4-P)(0.031±0.003)mg/L，TP(1.103±0.031)mg/L，TN(3.198±0.101)mg/L，各水質(zhì)指標(biāo)都在正常范圍內(nèi)。

2.2 測序結(jié)果

對(duì)稻蝦共作各樣品中高通量測序的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(表1)，在過濾掉低質(zhì)量堿基序列和嵌合體后，5個(gè)樣品共計(jì)獲得有效序列393 519個(gè)，平均78 703.8，水體最多為94 687，腸道最少為48 659。為了保證后期分析結(jié)果合理，對(duì)每個(gè)樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行隨機(jī)抽平處理，抽平數(shù)量按照最低樣本數(shù)量進(jìn)行抽平，抽平數(shù)量為48 659，將一致性在97%以上的序列聚類成一個(gè)OTU分類操作單位，5個(gè)樣品抽平后共計(jì)聚類 7 223個(gè)OTU，平均1 444.3，底泥樣本最多為2 064，鰓最少為831，測序深度99.25%～99.78%，說明試驗(yàn)樣本中序列沒有被檢測出的概率較低。Alpha多樣性發(fā)現(xiàn)Chao1指數(shù)、Observed-sopecies指數(shù)由高到低順序依次為底泥>肝胰腺>腸道>鰓>水體，Simpson、Shannon指數(shù)由高到低順序依次為底泥>肝胰腺>腸道>水體>鰓。說明底泥細(xì)菌豐度和多樣性最高，水體細(xì)菌豐富度最低，鰓菌群多樣性最低。

表1 樣品測序數(shù)列及Alpha多樣性分析

2.3 稻蝦共作模式下各樣品菌群組成分析

在門分類水平上，選取最大豐度前20個(gè)物種進(jìn)行分析(圖2)，發(fā)現(xiàn)各樣品菌群主要為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteria)。變形菌門是底泥和鰓的優(yōu)勢菌門，是水體次優(yōu)勢菌門，占比均較大，其中鰓占比超過90%；厚壁菌門是腸道和肝胰腺優(yōu)勢菌門，占比均超過40%；放線菌門是水體優(yōu)勢種群，但在其他樣品中占比較少。

圖2 基于門分類水平的菌群相對(duì)豐度分析

在屬分類水平上(表2)，水體、底泥、腸道、鰓、肝胰腺5個(gè)樣品優(yōu)勢種群分別為放線菌門的hgcIclade(32.1%)、厚壁菌門的芽孢桿菌屬(Bacillus2.1%)、柔膜菌門的CandidatusBacilloplasma(11.8%)、變形菌門的紅育菌屬(Rhodoferax87.2%)和厚壁菌門的芽孢桿菌屬(Bacillus12.9%)，各優(yōu)勢種群在樣品中占比范圍2.1%～87.2%，差異較大。底泥和肝胰腺含有共同的優(yōu)勢菌群芽孢桿菌屬，芽孢桿菌屬也是腸道、鰓的次優(yōu)勢菌群。厚壁菌門的Ruminiclostridium1在肝胰腺(6.5%)、腸道(3.7%)、底泥(1.0%)、鰓(0.3%)中作為主要菌群大量存在。

表2 測試樣品基于屬水平上的優(yōu)勢種群

根據(jù) 5個(gè)樣品的微生物組成和相對(duì)豐度進(jìn)行物種熱圖分析(圖3)，更加直觀顯示不同樣品優(yōu)勢菌群之間差異，鰓和水體優(yōu)勢菌群優(yōu)勢明顯。水體中的主要菌群變形菌門的Polynucleobacter、Limnohabitans(6.77%、6.51%)，放線菌門的CandidatusLimnoluna(5.59%)，變形菌門的OM43clade(3.41%)在其他樣品中含量較少。

圖3 屬水平不同樣品微生物豐度聚類熱度

2.4 稻蝦共作模式下不同樣品間菌群相似性分析

根據(jù)OTU聚類分析結(jié)果，為了直觀表現(xiàn)不同樣品之間OTU數(shù)目組成的相似性及重疊情況，構(gòu)建韋恩圖(圖4)，5個(gè)樣品共有248個(gè)OTU，占總數(shù)8.5%。腸道與肝胰腺、底泥、鰓、水體共有OTU個(gè)數(shù)分別為1 085、1 065、607、447，說明腸道與肝胰腺菌群關(guān)系最大，腸道菌群受到外界環(huán)境中底泥影響最大，底泥、肝胰腺、水體、腸道、鰓獨(dú)有的OTU分別為637、247、116、108、27。說明底泥菌群更復(fù)雜，腸道次之。

圖4 各樣品OTU 數(shù)量Venn分析

為了進(jìn)一步展示樣品間物種多樣性差異，使用主坐標(biāo)分析的方法展示各個(gè)樣品間的差異大小(圖5)。在稻蝦共作模式下，底泥、肝胰腺、腸道相似度較高，其中肝胰腺和腸道菌群結(jié)構(gòu)相似度最高，水體、鰓與其他樣品微生物群落結(jié)構(gòu)相似度較低。

圖5 PCoA分析圖

3 討論

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，水產(chǎn)品體內(nèi)定植菌群多樣性與其功能息息相關(guān)，其中的優(yōu)勢菌群更是發(fā)揮著決定性的作用，是維護(hù)菌群平衡、保持宿主健康的重要因素[12]，菌群結(jié)構(gòu)及其多樣性是養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)平衡與否的重要指標(biāo)。稻蝦共作模式因其具有良好的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益，近年來得到廣泛的推廣與應(yīng)用，本研究通過16S rRNA基因進(jìn)行高通量測序，研究稻蝦共作模式下克氏原螯蝦腸道等組織及其養(yǎng)殖環(huán)境菌群多樣性。結(jié)果顯示：稻蝦共作模式下稻蝦田水體、底泥和克氏原螯蝦腸道、鰓、肝胰腺5個(gè)樣品共檢測到有效序列393 519，抽平后共計(jì)聚類于 7 223分類操作單元OTU，測序深度均達(dá)到99%以上，水質(zhì)指標(biāo)檢測結(jié)果都在正常范圍內(nèi)，說明本研究結(jié)果在一定程度上反映稻蝦共作正常養(yǎng)殖情況下克氏原螯蝦腸道、鰓、肝胰腺及養(yǎng)殖環(huán)境的菌群結(jié)構(gòu)特征。

3.1 稻蝦共作模式下菌群多樣性分析

通過分析樣品Alpha多樣性指數(shù)可知，稻蝦共作模式下，底泥的豐富度和多樣性最高，這與擬穴青蟹[13]、凡納濱對(duì)蝦[4]、刺參[8]等水生動(dòng)物的相關(guān)研究結(jié)果一致。葉建勇等[14]對(duì)精養(yǎng)塘克氏原螯蝦腸道及其養(yǎng)殖環(huán)境研究顯示底泥、水體菌群多樣性高于腸道菌群，本研究中水體菌群多樣性卻遠(yuǎn)低于腸道等組織，這可能是因?yàn)榈疚r共作模式下水稻大量吸收水體里的營養(yǎng)元素，水體清瘦，導(dǎo)致微生物數(shù)量較少。

3.2 稻蝦共作模式下菌群組成分析

稻蝦模式下5個(gè)樣品菌群主要門類為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、柔膜菌門(Tenericutes)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)等，這與甲殼類水產(chǎn)品研究結(jié)果一致[4-5]。其中厚壁菌門是腸道、肝胰腺優(yōu)勢種群，是底泥、鰓第三優(yōu)勢種群。變形菌門是底泥和鰓優(yōu)勢菌群，是腸道、肝胰腺、水體次優(yōu)勢菌群。研究表明：厚壁菌門和變形菌門深度參與甲殼類腸道的生理和生化功能[15]，厚壁菌門參與動(dòng)物腸內(nèi)多糖代謝，因此大多數(shù)食肉動(dòng)物的糞便中厚壁菌門最為豐富[16]。與精養(yǎng)池單一飼料投喂相比，稻蝦模式可為小龍蝦提供豐富的昆蟲和種子，因此本研究克氏原螯蝦腸道厚壁菌門和變形菌門最豐富，與食肉動(dòng)物腸道菌群成分類似。在屬水平上進(jìn)一步分析，CandidatusBacilloplasma是腸道優(yōu)勢菌屬，研究表明：該菌屬屬于柔膜菌綱一個(gè)新家系[17-18]，在甲殼類腸道菌群中大量存在并具有重要作用，目前對(duì)該菌屬功能研究較少。在對(duì)中華絨螯蟹肝胰腺“白化”癥體組織微生物多樣性分析發(fā)現(xiàn)[5]，患病的肝胰腺和腸道柔膜菌綱菌群大量繁殖且優(yōu)勢明顯，但是水體底泥、鰓變化不明顯，屬于內(nèi)發(fā)增值，柔膜菌綱的CandidatusBacilloplasm菌群如何變化尚不明確。陳一銘等[19]對(duì)感染白斑綜合征(WSSV)克氏原螯蝦腸道菌群分析發(fā)現(xiàn)，CandidatusBacilloplasm顯著降低，可見CandidatusBacilloplasm菌群是克氏原螯蝦體健康與否重要指標(biāo)。底泥、腸道、肝胰腺含有共同優(yōu)勢種屬Bacillus、Ruminiclostridium1,進(jìn)一步說明底泥菌群對(duì)克氏原螯蝦腸道、肝胰腺菌群影響較大。

3.3 稻蝦共作模式下菌群相關(guān)性分析

韋恩圖和PCoA結(jié)果顯示底泥、腸道和肝胰腺菌群相關(guān)性較強(qiáng)，說明養(yǎng)殖環(huán)境中的底泥對(duì)克氏原螯蝦腸道等組織菌群多樣性影響較大。相關(guān)研究結(jié)果也顯示養(yǎng)殖環(huán)境對(duì)水生動(dòng)物腸道等菌群結(jié)構(gòu)關(guān)系較密切，如王賢豐等[20]研究發(fā)現(xiàn)擬穴青蟹腸道、底泥和水體含有共同優(yōu)勢菌群，李存玉等[21]研究發(fā)現(xiàn)池塘和工廠化兩種模式養(yǎng)殖的牙鲆腸道菌群均受水環(huán)境菌群影響。本研究結(jié)果也說明，養(yǎng)殖環(huán)境尤其是底泥對(duì)稻蝦模式下克氏原螯蝦腸道等菌群結(jié)構(gòu)影響較大。本研究發(fā)現(xiàn)腸道和肝胰腺菌群結(jié)構(gòu)相似性最大，說明二者菌群關(guān)系密切。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[5]，蟹腸道菌群的改變顯著影響肝胰腺和鰓的菌群結(jié)構(gòu)；感染W(wǎng)SSV的克氏原螯蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[2]，進(jìn)而影響腸道和肝胰腺功能發(fā)生變化；患有細(xì)菌性疾病克氏原螯蝦腸道、肝胰腺均含有大量致病細(xì)菌[22]。這些研究結(jié)果也印證了腸道與肝胰腺菌群關(guān)聯(lián)較強(qiáng)，但是二者相互影響的機(jī)理尚不清楚。