農(nóng)林廢棄物花生殼中總黃酮乙醇浸提工藝優(yōu)化研究*

劉曉霞，趙業(yè)軍，楊 潔，余 渤，程時勁

（武漢東湖學(xué)院 生物醫(yī)用材料創(chuàng)新研究所 生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430212）

花生是產(chǎn)量豐富、食用廣泛的一種堅果，在世界范圍內(nèi)都廣泛種植，花生殼再利用用途廣，可以用到各行各業(yè)，比如燃料、醫(yī)藥、化工、食用等多個方向?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，花生殼的抗氧化效果很好，原因主要在于黃酮類物質(zhì)的存在[1]。研究證明黃酮類化合物（代表物質(zhì)木犀草素）不僅有抗菌消炎的作用，而且可以降低血壓、血糖、血脂等，還存在使自身免疫力加強等功能[2-5]。黃酮類化合物無毒無害，尤其適合應(yīng)用在醫(yī)藥和化妝品方面，其中在醫(yī)藥方面有治療腫瘤的用藥、消炎藥、止疼藥、降低血糖用藥、胃藥和護肝藥等[6-8]；在護膚品方面主要應(yīng)用這類化合物的延緩老化和預(yù)防氧化的功能而開發(fā)的高檔護膚品類。本文對農(nóng)林廢物花生殼粉末中總黃酮的提取工藝進行了優(yōu)化研究，通過改變提取溶劑的類別、濃度和料液比例、提取溫度和時長，分別測定在這些不同條件下總黃酮的提取效率，得出了最佳優(yōu)化工藝條件。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

農(nóng)林廢棄物花生殼、NaOH、甲醇、無水乙醇、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、NaNO2、Al（NO3）3、蘆丁標準品（UV≥98%），以上試劑均為分析純，均來自于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

日本島津AUY120型電子天平；101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱和FW135型中草藥粉碎機，均為泰斯特儀器設(shè)備天津有限公司生產(chǎn)；UV-4802H型紫外可見分光儀（由上海尤尼柯儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗方法

將準備好的花生殼用自來水洗滌和超純水浸泡漂洗各3次，洗滌干凈后將其放于40℃烘箱中烘至重量不再變化，干燥后的花生殼粉末樣品用清洗干凈的中草藥粉碎機粉碎并過20目篩，將制備得到的粉末封存于密封袋中備用。

從密封袋中取備用的花生殼粉末，平行稱取5份5.0g，分別轉(zhuǎn)移至已編號的5個250mL燒杯中，往各個燒杯中分別加入30mL超純水、丙酮、石油醚、70%甲醇、70%乙醇或乙酸乙酯。將所有燒杯浸入60℃恒溫水浴箱中浸提2h，過濾并收集濾液后用體積分數(shù)為70%的乙醇溶液定容得粗提液，將粗提液稀釋10倍得樣品液，按照制備蘆丁標準曲線的步驟配置待測溶液。另外需配制參比溶液，取一個250mL容量瓶，首先加入2mL 5%的NaNO2溶液，再依次10%Al（NO3）3溶液2mL和4%NaOH溶液20mL，用體積分數(shù)為70%的乙醇溶液將其定容，充分搖勻后放置15min待測試用。將待測樣和參比樣同置紫外可見分光光度計樣品室，調(diào)節(jié)儀器波長測量吸光度數(shù)值，按照計算公式計算相應(yīng)總黃酮的提取率。改變浸提溶劑濃度、原料溶劑配比、提取溫度和提取時長后按照同樣方式處理和測試。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘆丁標準曲線的繪制

在120℃烘箱中將蘆丁對照樣品烘干并冷卻。稱量50mg蘆丁對照品至燒杯中，用70%乙醇溶解，用70%乙醇溶液定容，即得稀釋后的標準蘆丁中間使用液，避光備用。準確吸取蘆丁中間使用液0.00、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00mL分別置于已編號的6個50mL的容量瓶中，在各容量瓶中首先加入4mL體積分數(shù)為70%的乙醇溶液，再依次加入0.5mL質(zhì)量分數(shù)為5%的NaNO2溶液，0.5mL質(zhì)量分數(shù)10%Al（NO3）3溶液和4mL質(zhì)量分數(shù)4%NaOH溶液，每加入一種試劑后均進行充分震蕩并靜置數(shù)分鐘，最后用體積分數(shù)為70%的乙醇定容，得到蘆丁系列標準溶液。設(shè)置紫外可見分光光度計儀器參數(shù)，將最大吸收波長調(diào)節(jié)至510nm，將系列標準溶液進行上機測試，記錄吸光度數(shù)值，進行線性擬合并繪制擬合曲線，見圖1。工作曲線回歸方程為Y=0.00157+0.03615X，R2=0.99864，可見系列標液的吸光度數(shù)值和濃度之間擬合良好。

圖1 蘆丁標準曲線圖Fig.1 Rutin standard curve

2.2 總黃酮提取率的計算

根據(jù)紫外可見光譜儀的測試結(jié)果和回歸方程，計算出各樣品溶液總黃酮的濃度，再由稀釋倍數(shù)可以得到提取的總黃酮質(zhì)量，與所取的花生殼粉末質(zhì)量相比即可得出提取率。

式中 Q：提取率，%；m：花生殼粉末質(zhì)量，g；C：總黃酮濃度，mg·mL-1；V：粗提液稀釋后的體積，mL[9]。

2.3 提取溶劑及其濃度優(yōu)化

在浸提溫度為60℃，浸提時間為2h的條件下，選用不同溶劑將花生殼粉末在水浴鍋中進行浸提，不同溶劑提取后根據(jù)測量結(jié)果和計算公式得到的提取率見圖2。

圖2 不同提取溶劑時提取率柱形圖Fig.2 Extraction rate histogram for each solution

由圖2可以看出，花生殼中總黃酮提取率高低依次為70%乙醇、70%甲醇、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、去離子水，但就安全性而言，乙醇相比甲醇更安全，所以選用70%乙醇溶液作為提取劑較為合適。

配置5份不同體積分數(shù)的乙醇，將花生殼粉末置于其中在60℃恒溫水浴箱中浸提2h，經(jīng)不同體積分數(shù)乙醇溶液提取后花生殼粉末中總黃酮的提取率見圖3。

圖3 乙醇體積分數(shù)對提取率的影響Fig.3 Effect of different ethanol concentration on extraction rate

由圖3可見，乙醇體積分數(shù)從40%至70%，提取率不斷增大，隨后提取率則明顯下降，表明總黃酮類化合物在溶劑中的溶解度一開始會隨體積百分數(shù)的增加而增加，當(dāng)乙醇溶液濃度超過70%時，高濃度的乙醇具有強烈的吸水作用影響了細胞的膨脹，使得提取效率隨乙醇溶液體積分數(shù)的進一步增大而降低，所以最佳的乙醇提取體積分數(shù)為70%。

2.4 料液比的優(yōu)化

選用幾種不同料液比的70%乙醇溶液與花生殼粉末放入60℃的恒溫水浴箱中浸提2h，花生殼粉末量與溶劑量的比例不同，提取效率也有明顯差異，提取效率與料液比例的關(guān)系曲線見圖4。

圖4 花生殼粉末中總黃酮提取率隨料液比的變化Fig.4 Influence of different ratio of material to liquid on extraction rate

由圖4可知，花生殼粉末中總黃酮的提取效率在料液比小于1∶40時上升幅度明顯，此后上升幅度趨于平緩。這是由于隨著體系中溶劑量的增多，增大了原料表面與提取液間濃度差，使得整個體系中總黃酮的擴散變得更容易，最終增加了總黃酮的溶解率。但當(dāng)提取劑超過一定量時，提取液中總黃酮的提取率不會受到原料表面與提取液間濃度差的影響。所以確定1∶40為最合適料液比。

2.5 提取溫度的優(yōu)化

設(shè)置不同的提取溫度，在70%乙醇溶液與花生殼粉末放入60℃的恒溫水浴箱中浸提2h將恒溫水浴設(shè)置為不同的溫度，在料液比1∶40，乙醇體積分數(shù)70%條件下，對花生殼粉末樣品進行2h浸提。花生殼粉末中總黃酮提取效率與溫度之間的關(guān)系見圖5。

圖5 花生殼粉末中總黃酮提取率隨溫度的變化Fig.5 Effect of different temperatures on the extraction rate

由圖5可知，當(dāng)溫度從40℃升至65℃時，總黃酮提取率呈明顯增加趨勢，這主要得益于溫度的上升導(dǎo)致了分子的運動速度不斷加快，使得物質(zhì)擴散和滲透的速度也加快，這有利于總黃酮類化合物更易于自由擴散到提取溶劑中。65～85℃，當(dāng)溫度過高時，總黃酮會被部分氧化破壞，使得提取率隨溫度的進一步增加而迅速下降，所以選擇65℃為乙醇浸提法提取花生殼中總黃酮最佳提取溫度。

2.6 提取時間的優(yōu)化

選用70%的乙醇溶液，料液比為1∶40，在溫度為65℃時浸提不同時長后花生殼樣品中總黃酮的提取率見圖6。

圖6 花生殼粉末中總黃酮提取率隨提取時長的變化Fig.6 Effect of different time on extraction rate

由圖6可知，花生殼粉末中總黃酮的提取率先上升后明顯下降，在提取時間超過3h后上升呈現(xiàn)拐點，可能原因有兩點：（1）提取時間過長，乙醇溶液大量揮發(fā)；（2）在此溫度下提取時間過長，黃酮類物質(zhì)的穩(wěn)定性變差?？紤]到提取時間從2h再繼續(xù)增大至3h會消耗更多時間成本，但提取效率增長甚微，故選擇2h為最佳提取時間。

3 結(jié)論

本試驗將農(nóng)林廢料花生殼低溫烘干后用粉碎機充分研磨，以過篩后的花生殼粉末為原料，研究探討了花生殼粉末中總黃酮提取的各種條件并進行了優(yōu)化。通過改變提取溶劑的種類、采用不同體積分數(shù)的提取溶劑，改變原料與溶劑量的配比，在不同的提取溫度和提取時長下分別測定和計算提取效率，最后總結(jié)了花生殼粉末中總黃酮提取的最佳工藝條件為：最合適提取溶劑為乙醇且乙醇體積分數(shù)為70%，料液比為1∶40，溫度控制在65℃時最佳，提取時間2h。本實驗方法簡單易操作，實驗反應(yīng)易控制，實驗中化學(xué)試劑不多，對環(huán)境幾乎無污染，是一條綠色的工藝途徑。