謝堯卿,劉玲玲,李冰寧,歐陽杰,武彥文,*
(1.北京市科學(xué)技術(shù)研究院北京市理化分析測試中心,北京市食品安全測試工程技術(shù)研究中心,北京 100094;2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083)
礦物油主要來源于石油,包括石油經(jīng)過物理分離(如萃取、蒸餾)和/或化學(xué)轉(zhuǎn)化(如裂解、氫化、烷基化)等煉制的各類石化產(chǎn)品,以及煤、天然氣、生物質(zhì)合成的工業(yè)油。礦物油的化學(xué)類型復(fù)雜,主要包含由直鏈、支鏈和環(huán)狀烷烴組成的飽和烴礦物油(mineral oil saturated hydrocarbons,MOSH)以及高度烷基化(通常含1~5 個苯環(huán))的芳香烴礦物油(mineral oil aromatic hydrocarbons,MOAH)[1-4]。食品中的礦物油污染相當(dāng)普遍,原因是礦物油可以從原料種植、生產(chǎn)加工、包裝運(yùn)輸和環(huán)境污染多個途徑遷移至食品[1,5-8]。歐洲安全局(European Food Safety Authority,EFSA)規(guī)定食品中的礦物油為工業(yè)來源的C10~C50碳?xì)浠衔颷1]。研究發(fā)現(xiàn)MOSH是人體內(nèi)含量最高的污染物,其中C16~C35部分容易蓄積在脂肪組織、淋巴結(jié)、脾臟和肝臟中形成微型肉芽腫,含3 個以上苯環(huán)的MOAH有致癌和遺傳毒性等[1,9-10]。由于礦物油涉及領(lǐng)域廣泛,各國目前尚未出臺限量標(biāo)準(zhǔn)。不過,礦物油對人體健康有風(fēng)險,值得關(guān)注。
礦物油與油脂互溶,油脂及其含油食品尤其容易受到污染,其中食用油的污染最為嚴(yán)重,因此國際上首先推薦了食用油中礦物油的分析方法[11-12]。研究表明,巧克力中也普遍含有礦物油,Grob等[13]發(fā)現(xiàn)巧克力含有高達(dá)270 mg/kg的礦物油,其主要來源于包裝可可豆的麻袋,原因是麻袋制作需要用軟麻油調(diào)理纖維,軟麻油的主要成分就是礦物油。近年來,部分市場調(diào)查中也發(fā)現(xiàn)巧克力中普遍含有礦物油[14]。不過,巧克力樣品的基質(zhì)復(fù)雜,凈化困難;同時現(xiàn)有方法的靈敏度過低,定量限(limit of quantification,LOQ)為5 mg/kg[14]。因此,有必要從提高凈化與靈敏度兩方面進(jìn)行改進(jìn)。課題組以銀離子固相萃取柱(Ag+-SPE)凈化結(jié)合大體積進(jìn)樣-氣相色譜建立了巧克力中MOSH的測定方法[15-16];后續(xù)發(fā)現(xiàn),Ag+-SPE難以有效分離MOSH和MOAH兩部分,無法獲得低含量的MOAH部分[17-20]。
本實(shí)驗(yàn)基于液相色譜-氣相色譜(on-line liquid chromatography-gas chromatography,LC-GC)聯(lián)用系統(tǒng)建立巧克力中MOSH和MOAH的測定方法。LC-GC的優(yōu)勢是將LC的凈化與氣相色譜-氫火焰離子化檢測器(gas chromatography-hydrogen flame ionization detector,GC-FID)的測定在線聯(lián)用,LC的硅膠柱可以吸附油脂,同時分離MOSH和MOAH,然后通過閥切換、保留間隙與溶劑排空閥組成的接口,將LC洗脫流出的MOSH和MOAH全部轉(zhuǎn)入GC分析,真正實(shí)現(xiàn)了全樣品分析,最大程度地提升了分析方法的靈敏度[21]。不過,LC無法分離MOAH與烯烴,一些巧克力中含有過量天然烯烴會干擾MOAH測定。已有文獻(xiàn)報道采用環(huán)氧化反應(yīng)去除食用油中的烯烴[22-23]。本研究嘗試采用該方法凈化巧克力樣品中的烯烴,通過優(yōu)化環(huán)氧化反應(yīng)條件,最終建立巧克力中MOSH和MOAH的準(zhǔn)確測定方法后完成樣品分析。
巧克力購于北京當(dāng)?shù)氐膶?shí)體超市與京東網(wǎng)上超市。
正己烷、二氯甲烷、無水乙醇(均為色譜純)美國Fisher Scientific公司;間氯過氧苯甲酸(3-chloroperbenzoic acid,m-CPBA) 梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;硫代硫酸鈉 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
標(biāo)準(zhǔn)品:液體石蠟、正十一烷(C11)、正十三烷(C13)、環(huán)己基環(huán)己烷(cyclohexylcyclohexane,Cycy)、5α-膽甾烷(5α-cholestane,Cho)、戊基苯(pentylbenzene,5B)、1,3,5-三叔丁基苯(1,3,5-tri-tertbutylbenzene,TBB)、1-甲基萘(1-methylnaphthalene,1-MN)、2-甲基萘(2-methylnaphthalene,2-MN)、苝(perylene,Per)以及C7~C40正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品均購自美國Sigma-Aldrich公司。其中C11和5B分別用于MOSH和MOAH部分的揮發(fā)損失考察;Cycy和2-MN分別為MOSH和MOAH的定量內(nèi)標(biāo);C13和1-MN用于考察內(nèi)標(biāo)物Cycy和2-MN的響應(yīng)信號的準(zhǔn)確性;此外,Cho、TBB和Per用于監(jiān)控LC分離情況,它們分別為MOSH流分的末端,MOAH的開端與末端標(biāo)記物。
分別配制10、25、50、100、150、200、300 mg/mL的系列m-CPBA乙醇溶液;配制100 mg/mL硫代硫酸鈉溶液;配制9 種MOSH/MOAH混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(溶劑是正己烷和/或甲苯),其中C13的質(zhì)量濃度150 mg/L,C11、Cycy、5B、TBB、1-MN和2-MN的質(zhì)量濃度為300 mg/L,Cho和Per的質(zhì)量濃度為600 mg/L;配制100 mg/L的C7~C40正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)溶液;配制2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、100.0 mg/L的潤滑油(MOSH∶MOAH 85.5∶14.5)系列溶液。
LC-GC聯(lián)用儀(包括配備二元泵和UV檢測器的LC 20A液相色譜儀,帶有FID的GC 2010 plus氣相色譜儀) 日本Shimadzu公司;LC-GC接口 德國Axel Semrau公司;PAL自動進(jìn)樣器 瑞士CTC公司。
SQP分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司;KQ-800KDE高功率速控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;Milli-Q超純水設(shè)備 美國Millipore公司;ZFD-A5040電熱鼓風(fēng)干燥烘箱 上海智城分析儀器制造有限公司;HY-5A回旋式振蕩器 江蘇榮華儀器制造有限公司;R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士步琪有限公司;Biofuge Primo R, Megafuge離心機(jī) 美國Thermo公司;F-7000熒光分光光度計 日本Shimadzu公司。
1.3.1 儀器條件
LC條件:進(jìn)樣量100 μL,Allure Si色譜柱(250 mm×2.1 mm,5 μm,60 ?,美國Restek公司);流動相為正己烷與二氯甲烷混合溶劑,以0.3 mL/min梯度洗脫;洗脫程序:0~1.5 min為正己烷,1.6~6.2 min為70%正己烷+30%二氯甲烷;待試液中的MOSH(2.0~3.5 min)和MOAH(4.5~6.0 min)全部流出后,LC運(yùn)行反沖程序以再生色譜柱,設(shè)定二氯甲烷以0.5 mL/min流速在6.3~15.2 min反沖。LC運(yùn)行過程的流動相變換與MOSH/MOAH流出通過紫外檢測器(230 nm)監(jiān)測。
LC-GC接口:經(jīng)LC凈化、分離后分別得到450 μL的MOSH和MOAH。兩段流分通過閥切換(瑞士Vigiag公司),以氫氣為載氣被導(dǎo)入GC分析。GC儀器配備了由預(yù)柱(Restek MXT無涂層毛細(xì)管預(yù)柱,10 m×0.53 mm)和分析柱(Restek MXT毛細(xì)管柱,15 m×0.25 mm,0.25 μm)組成的2 個平行通道。MOSH和MOAH各自進(jìn)入一個通道,預(yù)柱與分析柱之間通過三通與溶劑排空閥連接。溶劑排空閥在LC流分閥切換前0.5 min開啟,轉(zhuǎn)移結(jié)束后0.3 min關(guān)閉。轉(zhuǎn)移到GC系統(tǒng)的MOSH和MOAH中大部分溶劑通過溶劑排空閥去除,剩余少量溶劑與濃縮的溶質(zhì)聚集在分析柱入口,進(jìn)行后續(xù)GC分離和測定。
GC條件:程序升溫的初始溫度60 ℃(保持6 min),以15 ℃/min升溫至120 ℃,再以25 ℃/min升溫至370 ℃(保持6 min)。FID溫度為380 ℃;輔助氣、燃燒氣和助燃?xì)夥謩e為氮?dú)?、氫氣和空氣,流速分別為30、40、400 mL/min。
1.3.2 樣品提取與富集
同一巧克力產(chǎn)品2~3 份,全部取出并研磨均勻;稱取5 g置于離心管中,分別加入30 μL的9 種MOSH/MOAH混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入10 mL正己烷于60 ℃超聲提取20 min,離心至固液分離;吸取上清液2 mL過硅膠柱(將6 g活化硅膠裝入玻璃注射器中),以25 mL混合溶劑(80%正己烷+20%二氯甲烷)洗脫;收集洗脫液至梨形瓶中,旋轉(zhuǎn)蒸干濃縮至1 mL左右。
1.3.3 環(huán)氧化反應(yīng)
取1.3.2節(jié)濃縮液1 mL,加入0.25~1 mL的m-CPBA溶液(200 mg/mL),振搖反應(yīng)15 min,然后加入2 mL硫代硫酸鈉溶液(100 mg/mL)和0.5 mL無水乙醇終止反應(yīng),振蕩均勻后靜置,吸取0.5 mL正己烷層至樣品瓶(瓶中預(yù)先加入少量無水硫酸鈉除去水分)用于后續(xù)測定。
1.3.4 LC-GC測定
按照1.3.1節(jié)條件測定樣品試液中的MOSH和MOAH含量。通過觀察LC部分UV檢測器的響應(yīng)信號考察LC流動相與MOSH/MOAH分離情況;考察C13和Cycy的峰面積比例是否接近1∶2,1-MN和2-MN的面積是否接近1∶1;積分計算MOSH和MOAH鼓包峰的面積,包括畫基線、勾勒鼓包峰輪廓、扣除上端尖峰以及面積的積分計算;最后分別以Cycy和2-MN為內(nèi)標(biāo)物計算MOSH和MOAH的含量。
1.3.5 方法學(xué)考察
以1.3.1節(jié)條件配制潤滑油系列溶液,以MOSH和MOAH的峰面積及其對應(yīng)質(zhì)量濃度繪制工作曲線,考察礦物油的線性范圍。LOQ由進(jìn)樣質(zhì)量濃度與FID檢測鼓包峰的經(jīng)驗(yàn)值計算得出[18]。準(zhǔn)確度考察通過測定添加10、50 mg/kg潤滑油溶液的巧克力樣品,每個添加水平平行測定6 次,計算MOSH和MOAH的回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)。
使用Lab solution軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。基于內(nèi)標(biāo)中的Cycy和2-MN定量計算MOSH和MOAH的含量,采用Excel 2016、Origin 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。
礦物油為非極性混合物,易溶于非極性或弱極性溶劑中。為了避免溶劑更換,簡化實(shí)驗(yàn)操作,有必要保證提取、凈化與測定溶劑的一致性,本實(shí)驗(yàn)選擇正己烷作為提取溶劑。通常,升高溫度可以提高提取效率。考慮到礦物油目標(biāo)物為C10~C50烴類化合物,高溫會造成低沸點(diǎn)物質(zhì)損失,因此,確定提取溫度為60 ℃。此外,考察提取次數(shù)發(fā)現(xiàn),第2次提取的礦物油含量僅為第1次的5%以下,因而確定提取次數(shù)為1 次。通常,整塊巧克力的礦物油污染并不一定均勻。為了保證樣品的均勻性和代表性,本實(shí)驗(yàn)將全部包裝樣品均質(zhì)后取樣。最終確定巧克力的提取方法為:分別取同一巧克力產(chǎn)品的2~3 份(包裝),全部取出并研磨均勻或均質(zhì);稱取其中的5 g樣品,加入9 種MOSH/MOAH混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和10 mL正己烷,于60 ℃超聲提取20 min。
礦物油與脂肪互溶,提取礦物油的同時,樣品中的大部分脂肪也一并溶出,因此,需要考慮提取液中的脂肪含量。由于LC-GC儀器中LC硅膠柱的吸附容量為20 mg甘油三酯,因而一般控制進(jìn)入LC柱中的油脂不超過15 mg。通常,LC-GC儀器測定進(jìn)樣量為50~100 μL,巧克力中的脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為30%,5 g巧克力提取液中的脂肪超過了LC柱的承載量。因此,必須增加去除脂肪的步驟。本實(shí)驗(yàn)自制硅膠固相萃取柱,大約可去除0.5 g脂肪,方法是將6 g經(jīng)馬弗爐活化(400 ℃)的硅膠裝入玻璃注射器(棄去內(nèi)管與針頭),輕輕敲實(shí)后,以正己烷平衡;然后取2 mL提取液上樣,以25 mL由80%正己烷+20%二氯甲烷組成的混合溶劑洗脫,收集洗脫液至梨形瓶中,旋蒸濃縮至1 mL左右。
不同樣品基質(zhì)對礦物油造成的干擾不同,因而礦物油分析與樣品基質(zhì)密切相關(guān),例如油茶籽油等食用油中含有大量干擾MOSH的奇數(shù)碳正構(gòu)烷烴,需要用活化氧化鋁凈化[15,24-25]。一些巧克力中含有大量的烯烴,這些烯烴可能包括角鯊烯、甾烯和胡蘿卜素等[22]。由于烯烴的極性與MOAH接近,LC-GC分析中LC柱無法分離烯烴與MOAH,導(dǎo)致MOAH的GC譜圖干擾嚴(yán)重(圖1A和圖2A)。為了解決這個問題,Biedermann和Grob首先提出環(huán)氧化反應(yīng)。該反應(yīng)通過間氯過氧苯甲酸(m-CPBA)與烯烴反應(yīng)生成極性較強(qiáng)的環(huán)氧化產(chǎn)物,使其保留在LC硅膠柱上,MOAH部分照舊洗脫流出,從而達(dá)到分離MOAH與烯烴分離的目的。不過,這個反應(yīng)的條件需要低溫(0 ℃)并以二氯甲烷為溶劑,存在溶劑轉(zhuǎn)換與反應(yīng)程度較難控制等問題[22]。為了控制反應(yīng)速度、簡化操作步驟,便于實(shí)現(xiàn)自動化,Nestola等[23]提出以乙醇替代二氯甲烷減緩反應(yīng)速度,使得反應(yīng)溫度升至常溫;同時,終止試劑由碳酸鈉改為硫代硫酸鈉。但此方法僅考察橄欖油、葵花籽與棕櫚油等植物油[23],是否適用于其他樣品基質(zhì)尚待研究。
圖1 巧克力(可可脂)環(huán)氧化反應(yīng)前(A)、后(B)的效果Fig.1 Chromatograms of chocolate (cocoa butter) before (A) and after (B) epoxidation
圖2 巧克力(代可可脂)環(huán)氧化反應(yīng)前(A)、后(B)的效果Fig.2 Chromatograms of chocolate (cocoa butter substitute) before (A)and after (B) epoxidation
巧克力樣品的基質(zhì)比食用油復(fù)雜得多。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明很多樣品存在烯烴干擾,如果烯烴的干擾影響到MOAH積分計算(圖1A和圖2A),則需要凈化去除。本實(shí)驗(yàn)考察不同樣品的烯烴含量及其環(huán)氧化反應(yīng)條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)烯烴干擾情況與巧克力的組成密切相關(guān)。巧克力有可可脂和代可可脂之分,通常代可可脂的烯烴干擾嚴(yán)重,必須凈化去除;可可脂中烯烴含量相對較低,如黑巧克力中可可脂含量較高,一般質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于60%,其雖然含有烯烴,但含量較低,不干擾MOAH測定,無需環(huán)氧化反應(yīng);不過,當(dāng)可可脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于50%時,則大都需要通過環(huán)氧化反應(yīng)除去烯烴,否則無法對MOAH積分計算。環(huán)氧化實(shí)驗(yàn)表明:不同烯烴含量的樣品需要不同的m-CPBA參與反應(yīng),低可可脂樣品需要50 mg的m-CPBA即可反應(yīng)完全(圖1B),而代可可脂則需要200 mg才能反應(yīng)完全(圖2B),繼續(xù)增加m-CPBA,MOAH譜圖不再發(fā)生變化,說明樣品中烯烴反應(yīng)比較完全。研究表明,食品中的烯烴通常為角鯊烯、胡蘿卜素和甾烯,其中角鯊烯最容易與m-CPBA發(fā)生反應(yīng),其次是胡蘿卜素和甾烯[22]。因此,不同組成的樣品需要適當(dāng)調(diào)整反應(yīng)條件。
將系列質(zhì)量濃度的潤滑油溶液注入LC-GC分析,分別以MOSH和MOAH的鼓包峰面積與對應(yīng)質(zhì)量濃度繪制曲線,得到線性范圍分別為1.7~85.5 mg/kg(MOSH部分)和0.5~14.50 mg/kg(MOAH部分),對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y=106x-859 779和y=818 880x-254 169,R2=0.998,說明線性關(guān)系良好。
本方法的LOQ根據(jù)進(jìn)入FID的礦物油質(zhì)量確定。經(jīng)驗(yàn)表明,F(xiàn)ID對礦物油鼓包峰的靈敏度僅為單體化合物尖峰的1%,通常至少需要50 ng礦物油進(jìn)入FID才能滿足定量分析的不確定度要求[21]。本實(shí)驗(yàn)取5 g巧克力,以10 mL正己烷提取,取其中的2 mL提取液富集、濃縮至1 mL(1/5),環(huán)氧化反應(yīng)后注入LC-GC分析,進(jìn)樣體積為100 μL(1/10),計算LOQ,相當(dāng)于0.1 g巧克力進(jìn)入FID檢測,因此LOQ為0.5 mg/kg。
準(zhǔn)確度以巧克力樣品中添加潤滑油溶液的回收率進(jìn)行考察。分別以10、20、50 mg/kg三個水平(MOSH和MOAH總量)添加至巧克力中,平行測定6 次,結(jié)果表明:MOSH部分的加標(biāo)回收率為84.2%~93.8%,RSD為1.58%~7.01%;MOAH部分的加標(biāo)回收率為80.3%~86.0%,RSD為3.61%~8.22%,說明該測定方法的準(zhǔn)確度滿足檢測要求。
本實(shí)驗(yàn)對購買的28 個巧克力產(chǎn)品進(jìn)行了檢測。其中有8 個樣品(2 個為鋁箔包裝,6 個為鋁塑復(fù)合包裝)中的MOSH和MOAH含量低于LOQ值;其余20 個樣品檢出MOSH,有1 個樣品檢出了MOSH和MOAH(表1)??傮w來看,巧克力樣品中MOSH的含量范圍為1.83~22.23 mg/kg,平均值為7.28 mg/kg。與2012年EFSA和2015年“Food Watch”的調(diào)查數(shù)據(jù)相比[1,14],我國巧克力中的礦物油含量范圍相對較窄,但平均含量卻與國外數(shù)據(jù)相近,均低于10 mg/kg;其中1 個樣品檢出MOAH,考慮到MOAH的毒性,值得特別關(guān)注。
表1 市售巧克力中礦物油的分析結(jié)果Table 1Contents of MOH in commercial chocolate products
此外,市售巧克力的包裝材料主要有鋁箔、塑料和鋁塑復(fù)合材料3 種。本次購買的鋁箔裝巧克力均未檢出礦物油;收集的22 個鋁塑包裝產(chǎn)品中有6 個未檢出,其余的均檢出MOSH,其中1 個還檢出了MOAH。對比不同包裝材料的檢出情況,塑料包裝產(chǎn)品中的MOSH含量為1.83~6.60 mg/kg,鋁塑復(fù)合材料的含量為2.26~22.23 mg/kg,包裝材料與礦物油含量沒有顯著相關(guān)性。前期研究表明奶粉中的脂肪含量與礦物油呈正相關(guān)[26],而各巧克力產(chǎn)品的脂肪含量相近,因此也沒有顯現(xiàn)出相關(guān)性。此外,本實(shí)驗(yàn)還比較了夾心與非夾心兩類巧克力,其中夾心樣品的平均含量為10.84 mg/kg(11 個樣品),而非夾心的為4.37 mg/kg(9 個樣品),說明夾心產(chǎn)品比非夾心的更易受到污染,這可能與夾心巧克力的工藝復(fù)雜度和增加配料相關(guān)。
由樣品分析譜圖可知不同巧克力的礦物油污染來源并不相同。圖3為兩個巧克力的礦物油譜圖,從碳數(shù)范圍看,樣品1的碳數(shù)范圍在C26~C50之間,中心碳位置大致為C33(圖3A);而樣品14的碳數(shù)范圍在C20~C40之間,中心碳為C27。說明2 種巧克力可能來自不同的白油或潤滑油產(chǎn)品。由于不同巧克力的原料、生產(chǎn)工藝不同,僅從碳數(shù)范圍和譜圖特征并不能夠明確礦物油遷移途徑[1]。圖4是唯一檢出MOAH的巧克力樣品(樣品10),其MOSH和MOAH的碳數(shù)范圍均小于C24,因此可能是空氣污染或油墨擴(kuò)散遷移所致[1,27-29]。此外,相當(dāng)多的樣品分析譜圖出現(xiàn)了聚烯烴低聚飽和烴(polyolefin oligomeric saturated hydrocarbons,POSH)的特征峰,特別是塑料包裝產(chǎn)品(圖3A)[30],說明塑料制品遷移的POSH非常普遍。
圖3 樣品1(A)和樣品14(B)巧克力的MOSH譜圖Fig.3 LC-GC chromatograms of MOSH in ch ocolate samples 1 (A) and 14 (B)
圖4 巧克力(樣品10)中MOSH(A)和MOAH(B)的譜圖Fig.4 LC-GC chromatograms of MOSH (A) and MOAH (B) in chocolate sample 10
本實(shí)驗(yàn)提出基于LC-GC準(zhǔn)確測定巧克力中MOSH和MOAH的方法,包括優(yōu)化提取方法,確定除烯烴干擾的環(huán)氧化反應(yīng)條件。與已有的方法相比,本方法的LOQ為0.5 mg/kg,從而實(shí)現(xiàn)了低含量MOAH的檢測目的。實(shí)際樣品分析發(fā)現(xiàn),部分巧克力中含礦物油,特別是MOSH污染比較普遍,其中夾心巧克力的污染普遍高于非夾心產(chǎn)品;譜圖特征顯示中塑料包裝遷移的POSH非常普遍,由于POSH與MOSH無法分離,因此,巧克力中MOSH結(jié)果是這兩種飽和烴的總量。