GHSR1a敲除對小鼠黑質(zhì)區(qū)GABA信號傳遞影響

肖雪 畢明霞 焦倩 陳曦 杜希恂 姜宏

[摘要]目的 探討生長激素促分泌素受體1a（GHSR1a）基因敲除對小鼠黑質(zhì)區(qū)γ-氨基丁酸（GABA）信號傳遞的影響。方法 取3只GHSR1a敲除（Ghsr-/-）小鼠和3只同窩野生型（WT）小鼠的黑質(zhì)區(qū)，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學測序（RNA-seq）技術(shù)篩選出差異表達基因（DEGs），并通過KEGG富集分析神經(jīng)活性配體受體信號通路的變化，以及對GABA信號傳遞的影響。結(jié)果 與WT組相比，Ghsr-/-組神經(jīng)活性配體受體相互作用信號通路上的12個基因表達發(fā)生了顯著性變化，其中γ-氨基丁酸受體α2（Gabra2）和γ-氨基丁酸受體α4（Gabra4）分別是GABA-A受體α2亞基和α4亞基的編碼基因。在Ghsr-/-小鼠中，Gabra2和Gabra4表達出現(xiàn)明顯上調(diào)。除此之外，與GABA轉(zhuǎn)運相關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白溶質(zhì)載體家族6成員1（Slc6a1）基因表達出現(xiàn)明顯下調(diào)。結(jié)論 GHSR1a基因敲除通過增加GABA受體亞基表達，抑制GABA重攝取，從而調(diào)控GABA信號傳遞。

[關(guān)鍵詞]受體，胃促生長素;黑質(zhì);γ氨基丁酸;信號傳導;轉(zhuǎn)錄組測序;小鼠

[中圖分類號]R338.2

[文獻標志碼]A

[文章編號]2096-5532（2021）02-0171-03

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of growth hormone secretagogue receptor 1a （GHSR1a） gene knockout on γ-aminobutyric acid （GABA） signal transduction in the substantia nigra of mice.?Methods Three GHSR1a-knockout （Ghsr-/-） mice and three wild-type （WT） littermates were selected， and RNA-seq technology was used to screen out differently expressed genes （DEGs） in the substantia nigra. KEGG enrichment analysis was used to investigate the change in the neuroactive?ligand-receptor interaction signaling pathway and the impact of GABA signal transduction. ?Results Compared with the WT group， the Ghsr-/- group had significant changes in the expression of 12 genes in the neuroactive ligand-receptor interaction signaling pathway， among which γ-aminobutyric acid A receptor α2 （Gabra2） and γ-aminobutyric acid A receptor α4 （Gabra4） were the coding genes of the α2 and α4 subunits of GABA-A receptor， respectively. Gabra2 and Gabra4 were significantly upregulated in Ghsr-/- mice. In addition， solute carrier family 6 member 1 （Slc6a1） related to GABA transport was significantly downregulated.Conclusion GHSR1a knockout regulates GABA signal transduction by increasing the expression of GABA receptor subunits and inhibiting GABA reuptake.

[KEY WORDS]receptors， ghrelin; substantia nigra; gamma-aminobutyric acid; signal transduction; RNA-seq; mice

生長激素促分泌素受體1a（GHSR1a）是G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）家族成員，同時也是ghrelin的功能型受體[1-2]。GHSR1a由366個氨基酸殘基和7個跨膜結(jié)構(gòu)域（TMD）組成，不僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達，在外周器官中也有較低水平表達[2]。本實驗室前期研究結(jié)果也證實了ghrelin-GHSR1a系統(tǒng)具有神經(jīng)保護作用[3-6]。除了介導ghrelin的功能外，GHSR1a還具有本構(gòu)型活性，在無ghrelin刺激時可參與多種生物學活動，如影響學習記憶、生長發(fā)育、癲癇發(fā)作、血壓和癌癥等，還可以通過Gi/o信號通路影響γ-氨基丁酸（GABA）釋放，產(chǎn)生抑制性突觸后電流（IPSCs）并最終導致神經(jīng)元興奮性增強[7]。為了更加全面地了解GHSR1a影響GABA釋放的分子機制，本研究選用3月齡GHSR1a基因敲除小鼠（Ghsr-/-小鼠）和同窩野生型（WT）小鼠，對其黑質(zhì)區(qū)進行轉(zhuǎn)錄組學測序（RNA-seq），篩選差異表達基因（DEGs）并進行KEGG信號通路富集分析，以期為闡明腦內(nèi)GHSR1a參與GABA信號傳遞及影響神經(jīng)元興奮性提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

生理鹽水，水合氯醛，干冰，液氮，PBS緩沖液，手術(shù)剪，眼科鑷，EP管，玻璃培養(yǎng)皿，注射器，液氮罐，-80 ℃冰箱，制冰機。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物與分組 3月齡Ghsr-/-雄性小鼠3只（Ghsr-/-組）和同窩WT雄性小鼠3只（WT組），體質(zhì)量（20±2）g，均購自上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司。小鼠在室溫（23±1）℃、12 h晝夜循環(huán)光照的環(huán)境下進行飼養(yǎng)，可自由飲水與進食。所有動物實驗操作均遵循醫(yī)學倫理學原則。

1.2.2 小鼠黑質(zhì)區(qū)樣本的采集及測序 使用水合氯醛對小鼠進行麻醉，脫臼法處死小鼠，解剖取腦后立即置于生理鹽水中沖洗腦組織表面血污，使用眼科鑷于冰上進行黑質(zhì)組織塊的取材，取材完畢立即置于脫酶EP管中，并保存于液氮中。測序樣本從液氮中取出后干冰運輸至北京諾禾致源生物科技有限公司進行RNA-seq。對Ghsr-/-組和WT組小鼠測序所得結(jié)果進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)量控制

測序錯誤率隨著測序長度的增加而降低，本研究6個樣本的測序錯誤率均小于1%，GC含量均小于50，Q30約為90%，6個樣本間的Pearson相關(guān)系數(shù)均大于0.95，說明數(shù)據(jù)均質(zhì)化程度高，可用于后續(xù)分析。

2.2 DEGs篩選

共有533個基因在Ghsr-/-組和WT組之間呈現(xiàn)出差異性表達，其中258個基因在WT組高表達，275個基因在Ghsr-/-組高表達。

2.3 KEGG富集通路分析

有12個DEGs富集到神經(jīng)活性配體受體相互作用通路上，與WT組相比，Ghsr-/-組中表達上調(diào)基因有6個，分別為γ-氨基丁酸受體α2（Gabra2）、γ-氨基丁酸受體α4（Gabra4）、膽堿能受體煙堿α4（Chrnb4）、AMPA離子型谷氨酸受體3（Gria3）、阿片受體1（Oprd1）和甘氨酸受體（Glrb）;表達下調(diào)基因6個，分別為膽堿能受體煙堿α5（Chrna5）、N-甲基-D-天冬氨酸離子能谷氨酸受體2D（Grin2d）、離子型谷氨酸受體海藻酸鹽5（Grik5）、神經(jīng)降壓素受體2（Ntsr2）和黑色素皮質(zhì)素受體3（Mc3r）。其中，Gabra2和Gabra4是編碼GABA受體亞基的基因，其上調(diào)提示GABA-A受體表達增多。除此之外，與GABA轉(zhuǎn)運有關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白溶質(zhì)載體家族6成員1（Slc6a1）基因表達出現(xiàn)明顯下調(diào)，其下調(diào)會導致突觸間隙中GABA不能被重吸收，從而增強其神經(jīng)抑制作用。以上結(jié)果表明，GHSR1a基因敲除對GABA信號傳遞具有顯著性影響。

3 討 論

GHSR1a是由7個TMD組成的GPCR家族中的一員，主要分布于下丘腦和垂體，是ghrelin的功能型受體[8-9]。當GHSR1a被ghrelin激活時，能夠發(fā)揮抗炎、抗凋亡、增強學習記憶、促進生長發(fā)育等作用[7，10]。本實驗室前期研究結(jié)果表明，PD病人的血漿ghrelin水平顯著降低[4]。而且ghrelin激活GHSR1a之后能夠拮抗1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶對小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)毒性作用[6]。以上結(jié)果表明，ghrelin-GHSR1a系統(tǒng)具有神經(jīng)保護作用。另外，GHSR1a不依賴于ghrelin刺激的本構(gòu)型活性對腦內(nèi)功能、生長發(fā)育等多種生物學過程也產(chǎn)生影響[11-13]。缺乏ghrelin時，GHSR1a可以通過Gi/o信號通路影響突觸前Ca2+電流，減少抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的釋放和IPSCs的形成并最終導致神經(jīng)元興奮性增強[14-15]。

GABA是重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，通過與其受體結(jié)合能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性[16-17]。GABA受體屬于氯離子通道受體，分布于整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)，介導中樞神經(jīng)系統(tǒng)大部分抑制性神經(jīng)傳遞，Gabra2和Gabra4是編碼該受體亞基的基因[18-19]。本研究結(jié)果顯示，在Ghsr-/-組小鼠中Gabra2和Gabra4的表達明顯升高，這可能會增加GABA受體組裝進而增強GABA與受體結(jié)合，通過增強IPSCs導致神經(jīng)元興奮性降低[20-21]。GABA發(fā)揮抑制性突觸傳遞作用除了與受體有關(guān)，還受到GABA轉(zhuǎn)運體的影響[22]。在本研究中，Ghsr-/-小鼠GABA轉(zhuǎn)運蛋白Slc6a1基因表達出現(xiàn)明顯下調(diào)。Slc6a1為溶質(zhì)載體家族6的成員之一，是大腦中主要的GABA轉(zhuǎn)運蛋白，負責從突觸間隙重新攝取GABA[19，23]。突觸間隙中的GABA主要來源于神經(jīng)膠質(zhì)細胞細胞膜、突觸前膜或囊泡膜上GABA轉(zhuǎn)運體（CAT）的攝取。Slc6a1可使GABA在突觸間隙中的濃度降低，從而減弱GABA的突觸傳遞作用[24-25]。當Slc6a1蛋白表達降低時，從突觸間隙重新攝取GABA可能會受到抑制，從而增強GABA的抑制作用。因此，研究GHSR1a敲除對GABA信號傳遞的影響能夠更加深入地了解神經(jīng)元興奮性的影響因素，從而為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供更多思路。

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（本文編輯 馬偉平）