戚璐 徐俊 許杰 樓汪洲洋 程良斌

摘要 目的：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)探討茵陳五苓散治療原發(fā)性膽汁性膽管炎（PBC）的潛在作用機(jī)制。方法：運(yùn)用系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）檢索茵陳五苓散的活性成分和作用靶點(diǎn)。通過GeneCard、OMIM數(shù)據(jù)庫收集疾病靶點(diǎn)。運(yùn)用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。采用R語言進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。將藥理網(wǎng)絡(luò)中的核心活性化合物與法尼醇X受體（FXR）進(jìn)行分子對接，同時(shí)比較推薦的化學(xué)藥物與FXR的結(jié)合活性。結(jié)果：化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)篩選出茵陳五苓散核心活性化合物為槲皮素、異鼠李素、β-谷甾醇、阿特匹林A、豬毛蒿、芫花黃素、茵陳黃酮、3β-乙酞氧基蒼術(shù)酮、二氫槲皮素、去甲氧基茵陳色原酮等。得到GO條目2 189條（P<0.05），KEGG通路富集分析得到155條信號通路（P<0.05）。分子對接結(jié)果顯示核心活性化合物與FXR親和力與推薦藥物相近。結(jié)論：茵陳五苓散對PBC的干預(yù)作用的潛在機(jī)制可能是槲皮素、異鼠李素、β-谷甾醇、阿特匹林A、豬毛蒿、芫花黃素、茵陳黃酮、3β-乙酞氧基蒼術(shù)酮、二氫槲皮素、去甲氧基茵陳色原酮等活性化合物通過與FXR結(jié)合作用于AKT1、JUN、MAPK1、RELA、IL6、MAPK14、EGFR、ESR1、FOS、CCND1等靶點(diǎn)調(diào)節(jié)多條信號通路而發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對接;茵陳五苓散;原發(fā)性膽汁性膽管炎;原發(fā)性膽汁性肝硬化

The Mechanism of Yinchen Wuling Powder on Primary Biliary Cholangitis Based

on Network Pharmacology and Molecular Docking

QI Lu1，XU Jun1，XU Jie1，LOU Wangzouyang1，CHENG Liangbin1，2

（1 Clinical College of Traditional Chinese Medicine，Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430061，China;

2 Department of Hepatology，Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Wuhan 430061，China）

Abstract Objective：To explore the potential mechanism of intervention effect of Yinchen Wuling Powder on primary biliary cholangitis（PBC） based on network pharmacology and molecular docking.Methods：The chemical composition and target of Yinchen Wuling Powder were retrieved by traditional Chinese medicine systems pharmacology（TCMSP）.Disease targets were collected by GeneCard and OMIM databases.Cytoscape3.7.2 software was used to construct the compound-target network of medicinal materials.Gene ontology（GO） functional enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） pathway enrichment analysis were carried out by R language.The core active compound in the pharmacological network is molecularly docked with the farnesoid X receptor（FXR），and the binding activity of recommended chemical drugs and FXR were compared.Results：The compound-target network screened out the core active compounds of Yinchen Wulingsan as quercetin，isorhamnetin，β-sitosterol，atropirin A，Artemisia serrata，Daphne flavonoids，flavonoids，3β-Beta Phthalooxy atractylone，dihydroquercetin，demethoxy chromogenone，etc.2189 GO entries were obtained（P<0.05），and KEGG pathway enrichment analysis yielded 155 signal pathways（P<0.05）.The molecular docking results showed that the affinity of the core active compound and FXR was similar to the recommended drug.Conclusion：The potential mechanism of Yinchen Wuling Powder′s intervention on PBC may be quercetin，isorhamnetin，β-sitosterol，atropyrin A，Artemisia halodendron，Daphne flavonoid，Yinchen flavone，3β-ethylphthalide active compounds such as oxyatractone，dihydroquercetin，and demethoxyl chromogenone can act on AKT1，JUN，MAPK1，RELA，IL6，MAPK14，EGFR，ESR1，F(xiàn)OS，CCND1 and other targets by binding to FXR point adjusts multiple signal pathways to play a role.

Keywords Network Pharmacology; Molecular Docking; Yinchen Wuling Powder; Primary Biliary Cholangitis; Primary Biliary Cirrhosis

中圖分類號：R285.6文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.02.005

原發(fā)性膽汁性膽管炎又稱原發(fā)性膽汁性肝硬化（Primary Biliary Cirrhosis，PBC），是一種由自身免疫性疾病引起的慢性非化膿性膽汁淤積性肝病。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病程較長。膽汁合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、排泄等異常導(dǎo)致膽汁淤積，是PBC疾病發(fā)展的共同病理過程。膽汁酸和其他毒性代謝產(chǎn)物在肝臟或體循環(huán)中異常堆積，發(fā)為包括PBC在內(nèi)的膽汁淤積性疾病，引起肝細(xì)胞損傷、肝內(nèi)膽管的炎性反應(yīng)、肝纖維化，最終發(fā)展為肝硬化、肝癌、膽管癌等[1]。

目前，臨床仍缺乏特異性高、療效好、不良反應(yīng)小的治療藥物。法尼醇X受體（Farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）是目前治療PBC認(rèn)可度較高的靶標(biāo)。FXR是一種以膽汁酸為天然配體的核受體，具有抑制膽汁酸合成、降低膽汁酸毒性、促進(jìn)膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)、抗肝纖維化等功能[2]。熊去氧膽酸（Ursodexoxycholicacid，UDCA）和奧貝膽酸（Obeticholic Acid，OCA）是目前被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)用于治療PBC的藥物[3]，也是中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會PBC診斷與治療共識推薦使用的藥物[4]。但UDCA、OCA仍存在皮膚瘙癢、乏力、腹痛、皮疹、頭暈、關(guān)節(jié)痛、濕疹、甲狀腺功能異常等不良反應(yīng)，且部分患者應(yīng)答不佳[5-6]。中藥茵陳五苓散是治療濕熱黃疸的經(jīng)典方劑，臨床上廣泛用于膽汁淤積的相關(guān)病證[7]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理及分子對接技術(shù)探討茵陳五苓散治療PBC的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及潛在作用機(jī)制，旨在為后期研究提供指導(dǎo)，為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 檢索茵陳五苓散的活性化合物及靶點(diǎn)運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索茵陳五苓散中各味藥材的有效成分。以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為篩選條件。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫中的靶點(diǎn)預(yù)測功能檢索活性化合物的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)藥理網(wǎng)絡(luò) 運(yùn)用GeneCard數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）、OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/），以“primary biliary cirrhosis”作為關(guān)鍵詞檢索PBC的靶點(diǎn)。疾病靶點(diǎn)與活性化合物靶點(diǎn)取交集后用R語言生成網(wǎng)絡(luò)文本，載入Cytoscape3.7.2軟件對茵陳五苓散的藥理網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析。

1.2.2 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò) 將茵陳五苓散與PBC的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），來源選擇人類，以高置性度（0.9）為篩選條件，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（Protein-protein Interaction，PPI）。PPI網(wǎng)絡(luò)用R語言進(jìn)行可視化處理。

1.2.3 基因富集分析和通路分析 采用Bioconductor平臺（https：//www.bioconductor.org/）和R語言ClusterProfiler模塊對得到的基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路分析，將排名前20的通路進(jìn)行可視化處理。

1.2.4 分子對接分析 從蛋白晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org）中下載FXR的PDB格式文件（ID：3P89）。運(yùn)用pymol程序，刪除結(jié)晶水、雜鏈及雜原子，加氫后保存為pdb格式，作為對接受體。從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載活性化合物mol2格式文件，從PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載熊去氧膽酸、奧貝膽酸的sdf格式文件，載入Discovery Studio 3.5 Client程序，加氫后保存為pdb格式?；钚曰衔?、熊去氧膽酸、奧貝膽酸作為對接配體。在Lunix操作系統(tǒng)下，用AutodockTool1.5.6程序，添加原子電荷、分配原子類型后保存為pdbqt格式。

在Lunix操作系統(tǒng)下采用Autodock Vina1.1.2[8]進(jìn)行分子對接將配體對接。配體設(shè)置為柔性，受體設(shè)置為剛性。搜尋精度exhaustiveness均設(shè)為64，num_modes均設(shè)置為20，energy_range均設(shè)置為5;格點(diǎn)間距均為1 ;FXR的格點(diǎn)中心為x=126.662，y=158.719，z=105.100;盒子大小為x=60，y=40，z=40;其他參數(shù)默認(rèn)。

2 結(jié)果

2.1 茵陳五苓散活性化合物及靶點(diǎn)篩選 運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索后，得到符合條件的活性化合物去除重復(fù)成分后共有58個(gè)，其中茵陳13個(gè)，茯苓15個(gè)，桂枝6個(gè)，白術(shù)7個(gè)，豬苓8個(gè)，澤瀉9個(gè)。見表1。茵陳有效成分的靶點(diǎn)有368個(gè)，茯苓30個(gè)，桂枝36個(gè)，白術(shù)23個(gè)，豬苓8個(gè)，澤瀉6個(gè)。去除重復(fù)靶點(diǎn)后共169個(gè)。

2.2 活性化合物藥理網(wǎng)絡(luò) 檢索得到PBC相關(guān)靶點(diǎn)2 881個(gè)。PBC與活性化合物靶點(diǎn)交集共125個(gè)。見圖1。建立化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（共166個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)125個(gè)，活性化合物節(jié)點(diǎn)39個(gè);共430條邊，菱形為疾病、方藥，六邊形為活性化合物，橢圓為靶點(diǎn)。見圖2。藥理網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，按?jié)點(diǎn)度值、介值中心度值排名，排前10的活性化合物依次為MOL000098（槲皮素）、MOL000354（異鼠李素）、MOL000358（β-谷甾醇）、MOL008047（阿特匹林A）、MOL008040（豬毛蒿）、MOL005573（芫花黃素）、MOL004609（茵陳黃酮）、MOL000049（3β-乙酞氧基蒼術(shù)酮）、MOL004576（二氫槲皮素）、MOL008046（去甲氧基茵陳色原酮）。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 PBC與活性化合物靶點(diǎn)交集共40個(gè)，導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖。見圖3。用R語言處理排名前30的靶點(diǎn)，得到barplot函數(shù)核心靶點(diǎn)圖。見圖4?？梢?，度值排名前10的靶點(diǎn)由高到低依次為AKT1、JUN、MAPK1、RELA、IL6、MAPK14、EGFR、ESR1、FOS、CCND1。

2.4 基因富集分析和通路分析 GO功能富集分析，得到GO（P<0.05）條目2 189條，其中生物過程（BP）2 008條，細(xì)胞組成（CC）46條，分子功能（MF）135條。將前20條進(jìn)行可視化處理。見圖5。KEGG通路分析，得到KEGG（P<0.05）條目155條，涉及白細(xì)胞介素-17（IL-17）信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、肝細(xì)胞癌相關(guān)通路等。見圖6。IL-17信號通路涉及GSK3B、RELA、BAX、CASP9、CASP3等基因。TNF信號通路涉及PTGS2、MAPK14、RELA、JUN、CASP3等基因。肝細(xì)胞癌相關(guān)通路涉及GSK3B、BAX、PRKCA、EGFR、AKT1等基因。

2.5 分子對接分析 一般認(rèn)為，配體和受體結(jié)合能越低，對接活性越大，結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。取藥理網(wǎng)絡(luò)中的度值和介值中心度值排名前10的活性化合物分別與FXR對接，同時(shí)與PBC診療與治療共識推薦使用的化學(xué)藥UDCA、OCA比較，最低結(jié)合能相近。見表2。結(jié)合模式分析可見，槲皮素與FXR結(jié)合形成疏水作用、1個(gè)氫鍵，形成氫鍵的氨基酸殘基為Met328;異鼠李素與FXR結(jié)合形成疏水作用、2個(gè)氫鍵，形成氫鍵的氨基酸殘基為Ser332、Arg331;β-谷甾醇與FXR結(jié)合形成疏水作用、1個(gè)氫鍵，形成氫鍵的氨基酸殘基為Arg331。阿特匹林A與FXR結(jié)合形成疏水作用、1個(gè)氫鍵，形成氫鍵的氨基酸殘基為Ser332;豬毛蒿與FXR結(jié)合形成疏水作用，1個(gè)氫鍵形成，形成氫鍵的殘基為Met328;芫花黃素與FXR結(jié)合形成疏水作用、1個(gè)氫鍵，形成氫鍵的氨基酸殘基為Tyr369。茵陳黃酮與FXR形成疏水作用、2個(gè)氫鍵，形成氫鍵的氨基酸殘基有Ser332、His447;3β-乙酞氧基蒼術(shù)酮與FXR形成疏水作用、1個(gè)氫鍵，形成氫鍵的氨基酸殘基有His447;二氫槲皮素與FXR形成疏水作用、3個(gè)氫鍵，形成氫鍵的氨基酸殘基有Met290、Met328、Ser332。去甲氧基茵陳色原酮與FXR形成疏水作用、6個(gè)氫鍵，形成氫鍵的殘基為Phe284、Thr288、His447、Met328、Ser332、Tyr369。見圖7。

3 討論

PBC是一種慢性肝內(nèi)膽汁淤積性疾病，以進(jìn)行性非化膿性中小膽管的破壞為病理特點(diǎn)[9]。臨床以乏力、皮膚瘙癢、門靜脈高壓、黃疸等為主要癥狀。其發(fā)病過程包括膽道上皮細(xì)胞免疫耐受損傷，以及相互依賴的膽道損傷、膽汁淤積和進(jìn)行性肝纖維化[10]。中醫(yī)學(xué)將PBC歸屬于“黃疸”，中醫(yī)多以清熱解毒、利濕退黃為治療原則。茵陳五苓散出自《金匱要略》，有利濕退黃之功，由茵陳、澤瀉、豬苓、茯苓、白術(shù)、桂枝組成，“黃疸病，茵陳五苓散主之”?！稖夭l辨》云“諸黃疸小便短者，茵陳五苓散主之”。茵陳五苓散治療黃疸病得到了歷代醫(yī)家的認(rèn)同?！夺t(yī)宗金鑒》《濕熱經(jīng)緯》《溫疫論》《丹溪心法》《景岳全書》《醫(yī)方集解》《張氏醫(yī)通》等均有茵陳五苓散治療黃疸的記載。

本研究以PBC為疾病模型，構(gòu)建藥理網(wǎng)絡(luò)。從中藥材近千種已知化合物中篩選出茵陳五苓散核心化合物為槲皮素、異鼠李素、β-谷甾醇、阿特匹林A、豬毛蒿、芫花黃素、茵陳黃酮、3β-乙酞氧基蒼術(shù)酮、二氫槲皮素、去甲氧基茵陳色原酮等。PPI網(wǎng)絡(luò)分析數(shù)據(jù)顯示茵陳五苓散治療PBC的作用靶點(diǎn)主要為AKT1、JUN、MAPK1、RELA、IL6、MAPK14、EGFR、ESR1、FOS、CCND1等;通路富集分析提示茵陳五苓散治療PBC的作用機(jī)制可能涉及IL-17信號通路、TNF信號通路、肝細(xì)胞癌相關(guān)通路等。IL-17信號通路、TNF信號通路是機(jī)體的炎性反應(yīng)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生等生物學(xué)過程的重要通路。IL-17信號通路的激活分泌多種趨化因子和細(xì)胞因子，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞向膽管周圍遷移，導(dǎo)致膽管上皮細(xì)胞的損傷，最終發(fā)展為PBC[11]。TNF信號通路也是參與肝纖維化、肝癌的重要通路[12-13]。

FXR對膽汁酸代謝穩(wěn)態(tài)的調(diào)控不僅是PBC發(fā)病的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，同時(shí)也被認(rèn)為是包括PBC在內(nèi)的膽汁淤積性疾病治療的重要靶標(biāo)[14]。FXR作為膽汁酸的一個(gè)主要感應(yīng)受體，已經(jīng)成為很多實(shí)驗(yàn)性藥物研究的重點(diǎn)，并且FXR激動劑OCA已被FDA批準(zhǔn)用于治療PBC[15]。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證茵陳五苓散對PBC治療作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究對茵陳五苓散的核心化合物與FXR進(jìn)行分子對接分析，可見核心活性化合物均能與FXR通過疏水作用、氫鍵等作用穩(wěn)定結(jié)合。同時(shí)推薦使用的化學(xué)藥物UDCA、OCA與FXR進(jìn)行對接分析，數(shù)據(jù)顯示茵陳五苓散核心化合物與FXR的結(jié)合活性同推薦藥物相近。一般認(rèn)為，結(jié)合能越低配體受體結(jié)合活性越大，活性化合物作用于該受體的可能性越大。值得一提的是，β-谷甾醇與FXR結(jié)合能為-11 kcal/mol，低于UDCA、OCA與FXR的結(jié)合自由能，考慮β-谷甾醇對FXR的作用活性不亞于UDCA、OCA。氫鍵是穩(wěn)定對接體系的重要作用力。核心活性化合物與FXR結(jié)合均有氫鍵形成。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)從分子水平預(yù)測了茵陳五苓散治療PBC的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和潛在作用機(jī)制，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供指導(dǎo)意義，為臨床應(yīng)用本方治療PBC提供了一定的應(yīng)用依據(jù)。槲皮素、異鼠李素、β-谷甾醇、阿特匹林A、豬毛蒿、芫花黃素、茵陳黃酮、3β-乙酞氧基蒼術(shù)酮、二氫槲皮素、去甲氧基茵陳色原酮等活性化合物的含量可能可以作為茵陳五苓散治療PBC質(zhì)量控制的參考。簽于網(wǎng)絡(luò)藥理和分子對接技術(shù)的局限性，需設(shè)計(jì)嚴(yán)格的動物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證其作用機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

[1]Hirschfield GM，Dyson JK，Alexander G，et al.The British Society of Gastroenterology/UK-PBC primary biliary cholangitis treatment and management guidelines[J].Gut，2018，67（9）：1568-1594.

[2]Purohit T，Cappell MS.Primary biliary cirrhosis：Pathophysiology，clinical presentation and therapy[J].World J Hepatol，2015，7（7）：926-941.

[3]Goldstein J，Levy C.Novel and emerging therapies for cholestatic liver diseases[J].Liver Int，2018，38（9）：1520-1535.

[4]中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會.原發(fā)性膽汁性肝硬化（又名原發(fā)性膽汁性膽管炎）診斷和治療共識（2015）[J].中華傳染病雜志，2016，34（7）：385-394.

[5]Samur S，Klebanoff M，Banken R，et al.Long-term clinical impact and cost-effectiveness of obeticholic acid for the treatment of primary biliary cholangitis[J].Hepatology，2017，65（3）：920-928.

[6]Corpechot C，Chazouilleres O，Rousseau A，et al.A Placebo-Controlled Trial of Bezafibrate in Primary Biliary Cholangitis[J].N Engl J Med，2018，378（23）：2171-2181.

[7]王開霞，鄭超，朱曉駿，等.茵陳五苓散治療膽汁淤積研究進(jìn)展[J].陜西中醫(yī)，2019，40（12）：1822-1824.

[8]Trott O，Olson AJ.AutoDock Vina：improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function，efficient optimization，and multithreading[J].J Comput Chem，2010，31（2）：455-461.

[9]Ronca V，Mancuso C，Milani C，et al.Immune system and cholangiocytes：A puzzling affair in primary biliary cholangitis[J/OL].J Leukoc Biol，2020.

[10]Gulamhusein AF，Hirschfield GM.Primary biliary cholangitis：pathogenesis and therapeutic opportunities[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2020，17（2）：93-110.

[11]余盼攀，張勝初，張啟瑜.IL-17及其受體與肝臟疾病的關(guān)系[J].肝膽胰外科雜志，2011，23（3）：262-265.

[12]姚蓉蓉，王艷紅.肝細(xì)胞肝癌免疫微環(huán)境的研究進(jìn)展[J].中國臨床醫(yī)學(xué)，2014，21（4）：487-496.

[13]黃萃園，張洪，白瑞丹.細(xì)胞因子基因多態(tài)性與肝纖維化發(fā)展關(guān)系的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2016，36（16）：1425-1430.

[14]Santiago P，Scheinberg AR，Levy C.Cholestatic liver diseases：new targets，new therapies[J].Therap Adv Gastroenterol，2018，11：1-15.

[15]Floreani A，Mangini C.Primary biliary cholangitis：Old and novel therapy[J].Eur J Intern Med，2018，47：1-5.

（2020-05-06收稿 責(zé)任編輯：芮莉莉）

基金項(xiàng)目：國家中醫(yī)藥管理局資助項(xiàng)目（JDZX2015179）

作者簡介：戚璐（1986.03—），女，博士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥防治肝病的研究，Tel：（027）88739570，E-mail：550294523@qq.com

通信作者：程良斌（1966.04—），男，博士，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：中醫(yī)藥防治肝病的研究，Tel：（027）88739570，E-mail：18971241243@163.com