樊長征 苗青 洪巧瑜 崔云 何沂 張瓊 張文江

摘要 目的：探討祛風(fēng)解痙方對(duì)哮喘模型小鼠γδT淋巴細(xì)胞表達(dá)的影響。方法：以卵清蛋白滴鼻的方法建立哮喘Balb/c小鼠模型。動(dòng)物分組：將30只小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、醋酸潑尼松片組（0.27 mg/d）及3個(gè)祛風(fēng)解痙方組（0.59、1.18、2.36 g/d），分別進(jìn)行干預(yù)，給藥14 d，1次/d。結(jié)果：與哮喘模型組比較，祛風(fēng)解痙方低劑量組的γδT細(xì)胞的細(xì)胞活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而祛風(fēng)解痙方中劑量組、祛風(fēng)解痙方高劑量組及陽性藥物組的γδT細(xì)胞的細(xì)胞活性顯著降低（P<0.05）。與模型對(duì)照組比較，祛風(fēng)解痙方低劑量組的IL-5、IL-13、TGF-β、IL-10、IFN-γ水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而祛風(fēng)解痙方中劑量組、高劑量組以及醋酸潑尼松片組在治療后IL-5、IL-13、TGF-β的表達(dá)均顯著降低（P<0.05），IL-10、IFN-γ的表達(dá)均顯著升高（P<0.05）。結(jié)論：祛風(fēng)解痙方通過抑制γδT細(xì)胞的細(xì)胞活性，降低γδT細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-5、IL-13、TGF-β表達(dá)，調(diào)高IL-10、IFN-γ的表達(dá)抑制氣道炎性反應(yīng)，改善哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)性。

關(guān)鍵詞 祛風(fēng)解痙方藥;哮喘;γδT淋巴細(xì)胞;細(xì)胞因子;細(xì)胞活性;氣道高反應(yīng)性;氣道炎性反應(yīng);中醫(yī)藥治療

Effects of Qufeng Jiejing Formula on the Expression of γδt Lymphocyte in Asthmatic Model Mice

FAN Changzheng1，MAO Qing1，HONG Qiaoyu2，CUI Yun1，HE Yi1，ZHANG Qiong1，ZHANG Wenjing1

（1 Department of Respiration，Xiyuan Hospital of China Academy of Chinese Medical Science，Beijing 100091，China;

2 Department of Traditional Chinese Medicine，Beijing Health Vocational College，Beijing 101101，China）

Abstract Objective：To investigate the effects of Qufeng Jiejing Formula on the expression of γδT lymphocyte in asthmatic model mice.Methods：The asthmatic Balb/c mice model was established by ovalbumin nasal drops.Animal grouping：a total of 30 experimental mice were randomly divided into a normal group，a model group，a prednisone acetate tablet group（0.27 mg/d）and a 3 Qufeng Jiejing Formula groups（0.59，1.18，2.36 g/d）.The mice were given intervention for 14 days，once a day.Results：Compared with the asthma model group，there was no significant difference in the cell activity of γδT cells in the low-dose Qufeng Jiejing Decoction group（P>0.05），while the middle-dose Qufeng Jiejing Decoction group and the high-dose Qufeng Jiejing Decoction group and the cell viability of γδT cells in the positive drug group was significantly reduced（P<0.05）.Compared with the model control group，the levels of IL-5，IL-13，TGF-β，IL-10 and IFN-γ in the low-dose group of Qufeng Jiejing Formula had no significant difference，while the levels of IL-5，IL-13 and TGF-β in the middle-dose group，the high-dose group and the prednisone acetate tablet group decreased significantly after treatment（P<0.05），while the levels of IL-10 and IFN-γ increased significantly（P<0.05）.Conclusion：Qufeng Jiejing Formula can by inhibiting the cell activity of γδ T cells，reduce the expression of cytokines IL-5，IL-13，and TGF-β secreted by γδ T cells，increase the expression of IL-10 and IFN-γ，inhibit airway inflammation，and improve asthmatic mice

Keywords Qufeng Jiejing Formula; Asthma; γδT lymphocyte; Cytokines;Cytoactive; Airway hyperresponsiveness; Airway inflammation; TCM treatment

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.02.012

支氣管哮喘（以下稱哮喘）主要特點(diǎn)表現(xiàn)為慢性氣道炎性反應(yīng)及氣道高反應(yīng)性，其發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵為Th1/Th2失衡，眾多細(xì)胞和因子影響著Th1/Th2平衡，其中γδT細(xì)胞表達(dá)變化影響著Th1/Th2應(yīng)答平衡，與哮喘發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此研究γδT細(xì)胞表達(dá)變化受到越來越多重視[1-3]。

根據(jù)受體不同，T細(xì)胞分為αβT細(xì)胞和γδT細(xì)胞，αβT細(xì)胞在外周血中約>90%，γδT細(xì)胞主要存在黏膜上皮及表皮組織中，約10%～50%[4]，γδT細(xì)胞在黏膜上皮及表皮中大量表達(dá)，表明其在黏膜免疫調(diào)節(jié)及防御中發(fā)揮著重要作用[5]，γδT細(xì)胞功能的參與和執(zhí)行者主要為Th1型IL-2、IFN-γ、TNF-α及Th2型IL-6、IL-4等細(xì)胞因子[6-7]。根據(jù)δ鏈的不同，人γδT細(xì)胞分為δ1和δ2 2個(gè)亞群，根據(jù)γ鏈不同，分為Vγ1、Vγ4、Vγ5、Vγ6亞群。前期研究表明卵清蛋白（OVA）致敏的小鼠哮喘模型中，Vγ1+γδT細(xì)胞亞群增強(qiáng)了哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性[8]，同時(shí)Vγ1+γδT細(xì)胞可降低IL-10和TGF-β的表達(dá)減輕哮喘小鼠氣道炎性反應(yīng)[9]，研究也表明Vγ4+γδT細(xì)胞下調(diào)Th2型應(yīng)答，降低哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性[10-11]，因此，哮喘發(fā)生發(fā)展的主要細(xì)胞群為Vγ1γδT和Vγ4γδT細(xì)胞。

中醫(yī)學(xué)者在臨床中發(fā)現(xiàn)“風(fēng)盛”是哮病發(fā)病的主要因素之一，認(rèn)為“風(fēng)盛痰阻，氣道攣急”既是哮喘發(fā)作的病因又是其發(fā)病之結(jié)果，“風(fēng)盛痰阻，氣道攣急”貫穿于哮喘的發(fā)作期、緩解期、穩(wěn)定期，這與哮喘氣道高反應(yīng)性高度一致，與氣道高反應(yīng)密切相關(guān)?；诖吮菊n題組進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探索了祛風(fēng)解痙方藥對(duì)哮喘小鼠γδT淋巴細(xì)胞的影響[7]，現(xiàn)匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 6～8周齡雄性Balb/c小鼠，動(dòng)物體質(zhì)量（35.0±3.0）g左右，清潔級(jí)，溫度18～22 ℃，濕度50%～60%，光照12 h/12 h，購自湖北省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（生產(chǎn)許可證：31162040001417），動(dòng)物合格證號(hào)SYXK（鄂）2013-0069。

1.1.2 藥物 祛風(fēng)解痙方：炙麻黃9 g、杏仁10 g、防風(fēng)10 g、地龍12 g、蟬蛻10 g、柴胡9 g、蒼耳子6 g、烏梅6 g、陳皮10 g、半夏9 g、茯苓12 g、甘草6 g（中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院中藥房）;醋酸潑尼松片（天津力生制藥股份有限公司，批號(hào)：1709111）。

1.1.3 試劑與儀器 卵清蛋白（OVA）（Sigma，美國，貨號(hào)：A5503-1G）;氫氧化鋁（Al（OH）3（Sigma，美國，貨號(hào)：V900163-500G）;蘇木素（福州邁新生物，貨號(hào)：CTS-1099）;伊紅（北京索萊寶，貨號(hào)：G1100）;唑來膦酸（上海Aladdin，Z129382）;CCK8反應(yīng)液（上海碧云天，貨號(hào)：C0038）;IL-2（北京Solarbio，貨號(hào)：P00198）;IL-5（聯(lián)科生物，美國，貨號(hào)：EK2051）;IL-13（聯(lián)科生物，美國，貨號(hào)：EK2131/2）;IL-10（聯(lián)科生物，美國，貨號(hào)：EK2101/2）;TGF-β（博士德生物，美國，貨號(hào)：EK0515）;IFN-γ（聯(lián)科生物，美國，貨號(hào)：EK2801/2）;酶標(biāo)儀（Multiskan MK3，美國，型號(hào)：Thermo Scientific）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 按照隨機(jī)數(shù)字表將30只小鼠分為6組;空白對(duì)照組（不造模，給予等體積生理鹽水，灌服，n=5）;模型組對(duì)照組（造模后，給予等體積生理鹽水，灌服，n=5）;模型組對(duì)照組（造模后，給予等體積生理鹽水，灌服，n=5）;祛風(fēng)解痙方低劑量組（造模后，給予1倍劑量中藥，0.59 g/d，灌服，n=5）;祛風(fēng)解痙方中劑量組（造模后，給予2倍劑量中藥，1.18 g/d，灌服，n=5）;祛風(fēng)解痙方高劑量組（造模后，給予4倍劑量中藥，2.36 g/d，灌服，n=5）;陽性對(duì)照組（造模后，給予1倍劑量醋酸潑尼松片，0.27 mg/d，灌服，n=5）。在無菌環(huán)境中飼養(yǎng)適應(yīng)1周后，進(jìn)行第一次致敏，腹腔內(nèi)注射20 μg OVA和2 mg Al（OH）3;第2、3周后進(jìn)行第2、3次致敏，腹腔內(nèi)注射10 μg OVA和1 mg Al（OH）3;第5周開始每天用等量的PBS配制的5%OVA 40～50 min滴鼻處理。正常對(duì)照組用生理鹽水致敏，滴鼻處理用等量的PBS，連續(xù)7 d后評(píng)估模型是否成功。

1.2.2 給藥方法 祛風(fēng)解痙方按人體每日用藥量的1倍，2倍，4倍劑量給藥。醋酸潑尼松片（5 mg/片），成年10片/d，給藥量按照人與小鼠體表面積換算方式計(jì)算，按人體每天用藥量的1倍量給藥。模型建立后，第2天開始灌胃給藥干預(yù)，飼料正常給予。給藥14 d。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 肺氣道組織γδT細(xì)胞的分離純化及擴(kuò)增：小鼠麻醉處死后，將各組小鼠肺組織用無菌手術(shù)刀取出，切碎并用collgenase消化得到的細(xì)胞，用抗TCRγδ磁珠分選γδ T細(xì)胞及檢測(cè)其濃度。分離純化的γδ T細(xì)胞加入50 mL培養(yǎng)瓶中，加入含10%血清濃度為100 U/mL雙抗RPMI-1640培養(yǎng)基3 mL，再加IL-2（終濃度為200 IU/mL）、唑來膦酸（終濃度為300 pg/mL），置于CO2濃度為5%，溫度為37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)9～12 d，其中每3 d換1次液，調(diào)整細(xì)胞濃度為106個(gè)/mL。CCK-8檢測(cè)γδT細(xì)胞的增殖活性：對(duì)各組小鼠肺組織通過分選得到γδT細(xì)胞，取擴(kuò)增10天細(xì)胞，CCK-8檢測(cè)分選純化后γδT細(xì)胞的增殖活性。接種培養(yǎng)10 d的各組肺氣道組織γδT細(xì)胞，向每孔加入CCK8反應(yīng)液10 μL，接著將培養(yǎng)板置于37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。然后用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。ELISA法測(cè)定γδT細(xì)胞：分泌的細(xì)胞因子濃度按照各指標(biāo)試劑盒說明書（IL-5、IL-13、IL-10、TGF-β、EK0515、IFN-γ）的操作步驟進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋和加樣。將測(cè)樣品50 μL加入酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部后晃動(dòng)混勻，晃動(dòng)時(shí)不要觸及孔壁。封板后放置于溫度為37 ℃的溫箱中溫育30 min。溫育30 min后揭掉封板膜去液體甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，用上面相同的方法重復(fù)5次后拍干。每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，溫育30 min后洗滌。每孔依次入顯色劑A 50 μL、B 50 μL，小心晃動(dòng)混勻，在37 ℃避光條件下顯色15 min后加終止液50 μL終止反應(yīng)，當(dāng)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色時(shí)以空白空調(diào)零，在15 min內(nèi)采用450 nm波長依序測(cè)量各孔吸光度（OD值）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，本試驗(yàn)數(shù)據(jù)檢驗(yàn)為方差齊，正態(tài)分布，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，做單因素ANOVA-LSD檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8檢測(cè)γδT細(xì)胞的增殖活性 與正常對(duì)照組比較，哮喘模型小鼠的γδT細(xì)胞的細(xì)胞活性顯著增強(qiáng)。與哮喘模型組比較，祛風(fēng)解痙方低劑量組的γδT細(xì)胞的細(xì)胞活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而祛風(fēng)解痙方中劑量組、祛風(fēng)解痙方高劑量組以及陽性藥物組的γδT細(xì)胞的細(xì)胞活性顯著降低。見圖1、圖2。

2.2 ELISA法測(cè)定γδT細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子濃度? 取各組擴(kuò)增10天γδT細(xì)胞，ELISA測(cè)定γδT細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-5、IL-13、IL-10、TGF-β、IFN-γ濃度。結(jié)果如圖3及表1所示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組的IL-5、IL-13、TGF-β水平上升。與模型對(duì)照組比較，祛風(fēng)解痙方低劑量組的IL-5、IL-13、TGF-β水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而祛風(fēng)解痙方中劑量組、祛風(fēng)解痙方高劑量組以及醋酸潑尼松片組在治療后IL-5、IL-13、TGF-β的水平均顯著降低（P<0.05）。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組IL-10、IFN-γ水平降低。與模型對(duì)照組比較，治療后IL-10、IFN-γ水平上升，祛風(fēng)解痙方低劑量組的IL-10、IFN-γ水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而祛風(fēng)解痙方中劑量組、祛風(fēng)解痙方高劑量組以及醋酸潑尼松片組在治療后IL-10、IFN-γ的水平均顯著升高（P<0.05）。

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為哮喘的主要病理機(jī)制為痰阻氣道、肺失宣降、風(fēng)盛痰阻、氣道攣急等，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為哮喘的發(fā)病機(jī)制有氣道炎性反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)、氣道高反應(yīng)性和神經(jīng)因素等[5]。氣道高反應(yīng)性是一種反映哮喘患者氣道功能異常狀態(tài)的關(guān)鍵指標(biāo)之一，在哮喘診斷及哮喘患者的病情和預(yù)后評(píng)估中具有重有意義，指氣道對(duì)刺激物的反應(yīng)性增高，氣道出現(xiàn)支氣管平滑肌收縮、黏液分泌增多及免疫炎性遞質(zhì)釋放，氣道阻力上升和肺通氣功能下降[6]。β2激動(dòng)劑與糖皮質(zhì)激素是控制哮喘主要的藥物，長期使用這些藥物后部分患者出現(xiàn)激素抵抗，療效下降，不能很好控制癥狀[12]。祛風(fēng)解痙方是根據(jù)哮喘氣道高反應(yīng)性的病因病機(jī)“風(fēng)盛痰阻，氣道攣急”組成。炙麻黃為君，宣肺平喘。麻黃堿可松弛支氣管平滑肌，麻黃提取物對(duì)機(jī)械刺激引起的咳嗽有明顯的鎮(zhèn)咳效果[13]。杏仁、防風(fēng)、柴胡、地龍、蟬蛻為臣藥，杏仁止咳平喘，苦杏仁苷對(duì)呼吸中樞呈抑制作用而達(dá)到鎮(zhèn)咳平喘效應(yīng)[14]。防風(fēng)有抗炎、抗菌、抗過敏等藥理作用[15]。地龍可通過其抗炎纖溶和抗組胺作用干預(yù)氣道重構(gòu)的信號(hào)通路和絲裂原活化蛋白激酶通路，對(duì)氣道重構(gòu)起到防治和逆轉(zhuǎn)作用[16]。蟬蛻有抗炎、鎮(zhèn)咳祛痰平喘、鎮(zhèn)靜止痛解痙、抗驚厥、抗凝等作用[17]。蒼耳子、陳皮、半夏、茯苓為佐藥，蒼耳子具有抗過敏、抑菌、抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用[18];茯苓、陳皮、半夏健脾燥濕祛痰，與麻黃、防風(fēng)、柴胡起到宣發(fā)肺氣暢通氣道之功。甘草、烏梅為使藥。甘草甘微溫，用以調(diào)和諸藥，緩麻黃燥烈之性。烏梅斂肺、生津，與柴胡、防風(fēng)配伍，調(diào)和陰陽。該方藥能改善哮喘患者肺功能，降低易感性，降低呼吸道阻力，降低機(jī)體對(duì)過敏因素的應(yīng)激反應(yīng)，使肺小氣道變?yōu)槭鎻?，氣道通順，能明顯緩解哮喘氣道高反應(yīng)性，明顯改善哮喘氣道高反應(yīng)性患者臨床癥狀，較好控制哮喘發(fā)作，改善哮喘氣道阻塞，是防治哮喘患者氣道高反性的有效方法[19]。

Lahn等[20]發(fā)現(xiàn)小鼠肺γδT細(xì)胞一方面下調(diào)過敏反應(yīng)中的氣道高反應(yīng)性，另一方面募集嗜酸粒細(xì)胞，活化B細(xì)胞和T細(xì)胞，表現(xiàn)出2種不同的免疫效應(yīng)。γδT細(xì)胞主要是募集B細(xì)胞到過敏反應(yīng)局部影響其分泌Ig類型[21]。向小鼠注射γδT細(xì)胞的單克隆抗體導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性-哮喘的發(fā)生[20]。因此，γδT細(xì)胞通過影響Th1/Th2應(yīng)答平衡左右哮喘氣道高反應(yīng)性的發(fā)生發(fā)展。支氣管哮喘還表現(xiàn)為氣道慢性炎性反應(yīng)，T淋巴細(xì)胞在哮喘炎性反應(yīng)病理過程也起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。γδT細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞的一種，有研究顯示γδT細(xì)胞具有促進(jìn)氣道炎性反應(yīng)的作用[22]。本研究顯示，與正常對(duì)照組比較，哮喘模型組γδT細(xì)胞的細(xì)胞活性顯著增強(qiáng)，表明哮喘模型鼠肺組織的炎性反應(yīng)加重。祛風(fēng)解痙方中劑量組、祛風(fēng)解痙方高劑量組及陽性藥物組的γδT細(xì)胞的細(xì)胞活性顯著減弱，表明中藥治療和陽性藥物治療可以顯著緩解哮喘模型小鼠肺組織的炎性反應(yīng)，具有一定的治療效果。

哮喘主要特點(diǎn)為慢性氣道炎性反應(yīng)及氣道高反應(yīng)性，其發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵為Th1/Th2失衡，眾多細(xì)胞和因子影響著Th1/Th2平衡。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13、IL-25等高表達(dá)可引起哮喘患者氣道高反應(yīng)性。IL-4和IL-13促進(jìn)IgE高表達(dá)，IL-5、GM-CSF增強(qiáng)嗜酸性粒細(xì)胞增殖、活化、聚集，IL-13還直接增加氣道黏膜分泌，IFN-γ和TNF-β等引發(fā)細(xì)胞免疫，同時(shí)IFN-γ可抑制IL-4及下調(diào)IgE的合成。我們的研究結(jié)果表明祛風(fēng)解痙方中劑量組、祛風(fēng)解痙方高劑量組在治療后IL-5、IL-13、TGF-β的水平均顯著降低，而IL-10、IFN-γ的水平均顯著升高。因此，祛風(fēng)解痙方可緩解哮喘模型小鼠肺組織的炎性細(xì)胞浸潤情況，且祛風(fēng)解痙方高劑量組的治療效果最明顯。

綜上所述，祛風(fēng)解痙方通過抑制γδT細(xì)胞的活性，降低γδT細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-5、IL-13、TGF-β表達(dá)水平，調(diào)高IL-10、IFN-γ的表達(dá)水平抑制氣道炎性反應(yīng)，改善哮喘模型小鼠的氣道高反應(yīng)性，其中高劑量中藥對(duì)于哮喘模型小鼠具有良好的治療效果。

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（2019-04-26收稿 責(zé)任編輯：王明）

基金項(xiàng)目：北京自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（7172190）——祛風(fēng)解痙中藥調(diào)節(jié)γδT細(xì)胞抑制哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性的機(jī)制

作者簡介：樊長征（1979.03—），男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥防治肺系疾病研究，Tel：（010）2835377，E-mail：faanchzh@163.com