王 芬，石鳳翎，張雨桐，吳馨羽，伊風艷

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學草原與資源環(huán)境學院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼草栽培、加工與高效利用重點實驗室/草地資源教育部重點實驗室,呼和浩特 010018)

扁蓿豆(MedicagoruthenicaL.)是豆科(Leguminosae)苜蓿屬(Medicago)優(yōu)良牧草[1]；抗逆性強、適應(yīng)性廣，具有良好的繁殖能力[2]；莖葉柔軟，葉量豐富，分枝多，是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)飼料。扁蓿豆與苜蓿親緣關(guān)系較近，可作為苜蓿新品種培育及苜蓿品種抗性改良的重要種質(zhì)材料，但種子產(chǎn)量和牧草產(chǎn)量均較低[3]。自1928年采用誘變育種技術(shù)創(chuàng)制農(nóng)作物新材料、培育優(yōu)良新品以來，扁蓿豆誘變工作雖然開始較晚，但早有采用其他方式誘變牧草的種子和幼苗尋找最適誘變條件的報道[4]。我國的空間誘變育種技術(shù)始于20世紀60年代，是繼蘇聯(lián)和美國之后第三個開展植物空間誘變育種的國家，通過神舟號航天飛船和返回式衛(wèi)星等空間飛行器，已搭載了共1000多個植物品種，經(jīng)過鑒定、篩選到目前為止已有超過500多個品種產(chǎn)生了正向變異[5]，創(chuàng)制出了一大批新種質(zhì)[6～8],達到了世界先進水平，培育出了大量的優(yōu)質(zhì)作物[9～13]，如牧草[14～15]、花卉[16～18]、蔬菜[19～20]等新品種、新品系，成果顯著并得到了國際相關(guān)領(lǐng)域的一致肯定[21～22]。因此，本試驗利用太空特殊環(huán)境(如高輻射、強離子等)的誘變作用使種子產(chǎn)生變異，再返回地面培育作物新品種，能更快速獲得扁蓿豆新種質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為3個扁蓿豆品種的種子，于2018年在海流內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學草學試驗基地收獲，經(jīng)干燥處理后在4℃種子柜條件下貯藏。供試材料代號、名稱等見表1。

表1 供試材料及其植株形態(tài)

1.2 試驗處理

選取粒大飽滿的3份材料的種子供誘變處理，試驗前所有種子均用砂紙打破硬實，2020年5月5日搭載新一代載人飛船在我國文昌發(fā)射中心由長征五號B運載火箭送入太空，飛行2d 19h(67h)后試驗船返回艙在東風著陸場回收。軌道高度約300～8000km。試驗船在軌飛行期間，穿越范艾倫輻射帶。

1.3 試驗方法

將經(jīng)太空搭載后的種子分別選取100粒種子，各3次重復，以未經(jīng)太空搭載的種子為對照(CK)。將其用水浸泡吸脹后置培養(yǎng)皿中發(fā)芽，每天按時觀察，種子發(fā)芽后將其播種于育苗盤中，育苗基質(zhì)為蛭石、營養(yǎng)土、沙土1∶1∶1的混合物，播種深度約1～2cm，置于培養(yǎng)濕度為60%、培養(yǎng)溫度為25℃的人工智能培養(yǎng)箱，培育期間條件一致。每隔7d觀測一次，待種子發(fā)芽頂出土壤后統(tǒng)計幼苗的生長情況及葉片形態(tài)特征，15d后統(tǒng)計出苗率、觀察變異情況并標記，生長45d后將幼苗從育苗盤移入大田，大田緩苗后每隔7d進行一次觀測，并對成苗生長指標進行統(tǒng)計。

測定指標與計算公式如下：

發(fā)芽勢(%)=3d內(nèi)發(fā)芽率/供試種子數(shù)×100%

成苗率(%)=成活苗總數(shù)/供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt (Gt為t天的發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽天數(shù))

相對發(fā)芽率(%)=處理的發(fā)芽率/對照的發(fā)芽率×100%

相對出苗率(%)=處理的出苗率/對照的出苗率×100%

表型突變頻率(%)=表型突變株數(shù)/群體總株數(shù)×100%；

絕對株高和生長速度測定，是隨機選擇對照10株用卷尺從植株基部開始測量至頂部的長度，同類型變異株取平均值；每隔7d測定一次，計算生長速度；

葉面積測定是選取各材料植株主莖上成熟復葉，用網(wǎng)格紙標記測定小葉面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 太空搭載對扁蓿豆種子發(fā)芽及活力的影響

如圖1所示，經(jīng)太空輻射后的3個扁蓿豆品種的種子發(fā)芽率具有顯著差異性(P<0.05)，其中B3的相對發(fā)芽率顯著高于B1和B2，說明太空輻射作用于3個扁蓿豆品種損傷程度B1>B2>B3,并且對B2和B3種子的發(fā)芽具有明顯的促進作用。

圖1 太空輻射后3個扁蓿豆種子的發(fā)芽率

發(fā)芽勢是種子發(fā)芽整齊度的體現(xiàn)，而發(fā)芽指數(shù)反映的是種子發(fā)芽活力的強弱。由圖2可知，經(jīng)太空輻射后3個扁蓿豆種子的相對發(fā)芽勢具有顯著性差異(P<0.05)，B3>B1>B2。由圖3可知，B3種子發(fā)芽活力顯著(P<0.05)高于B2種子，而B1與兩者間無顯著差異?？梢?，經(jīng)太空輻射后提高并加快了扁蓿豆B3種子的發(fā)芽，同時增強了B1和B3種子的活力。

圖2 太空輻射后3個扁蓿豆種子的發(fā)芽勢

圖3 太空輻射后3個扁蓿豆種子的發(fā)芽指數(shù)

2.2 太空搭載對扁蓿豆品種出苗率的影響

由圖4看出，太空輻射對3個扁蓿豆種子的出苗率具有不同程度的影響，其中顯著促進了B2和B3種子的出苗，但明顯抑制了B1種子的出苗。B1的出苗表現(xiàn)與種子活力變化趨勢不同，可能與播種出苗后的生長活力有關(guān)。

圖4 太空輻射后3個扁蓿豆的出苗率

2.3 太空搭載后3個扁蓿豆的變異效率

試驗表明，經(jīng)太空輻射后3個扁蓿豆種子田間總成苗率為59.9%，其中B2的成苗率較高(表2)。3個扁蓿豆幼苗的表型變異率B1>B2>B3, 受太空輻射影響發(fā)生表型變異顯著的是直立型扁蓿豆(B1)，其次為蒙農(nóng)2號扁蓿豆(B2)。

表2 太空輻射對扁蓿豆幼苗表型變異的影響

如表3所示，幼苗表型性狀變異有7種，最為顯著的為第一片真葉形狀的變異，變異率為1.34%；其次為植株矮化，概率為1.17%(圖5)。

表3 太空搭載后供試材料當代幼苗各變異性狀的變異率

A為對照；B為真葉畸形；C為真葉方形；D為真葉細長；E為雙主莖株；F為真葉萎縮；G為白化；H為停止生長；I為黃化圖5 太空輻射后3個扁蓿豆幼苗的變異情況

2.4 太空搭載對植株生長速度的影響

選取4個表型變異明顯的植株進行觀測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)太空輻射誘變而產(chǎn)生變異的植株，在生長速度上無論是幼苗期還是成株期，與對照相比均有顯著差別(圖6、圖7)。變異株第一片真葉方形與第一片真葉細長的幼苗，生長速度顯著高于對照，生長速度為0.55cm/d；而矮小株與雙主莖植株，生長速度則顯著低于對照，分別為0.19cm/d、0.27cm/d；移入大田煉苗的植株在煉苗期有部分死亡，成苗變異株中第一真葉細長的變異株變化最為顯著，生長速度為0.13cm/d；而第一真葉方形變異株的生長速度為1.23cm/d，雙主莖變異株變化不明顯。

圖6 太空輻射變異株幼苗的生長狀況

由圖8可知，變異株株高與對照相比具有顯著差異，太空輻射后變異株生長速度相比于對照產(chǎn)生了顯著變化,生長45d后的絕對株高最大為方形真葉變異株，株高為92cm，矮小株的株高僅9cm。3個扁蓿豆對照之間株高無顯著差異，方形真葉變異株顯著高于對照及其他變異株。

CK1為直立型對照；CK2為平臥型對照；CK3為斜生型對照；大寫字母為同種扁蓿豆間差異，小寫字母為整體差異；相同字母表示無顯著性差異(P>0.05)圖8 太空輻射變異株生長45d后的株高

2.5 太空搭載對變異株葉片生長的影響

由表4可知，雙主莖變異株葉長、葉寬及葉面積均顯著大于CK1；真葉細長變異株葉片整體面積顯著小于CK3，葉面積同時也是最小(0.343cm2)；而方形真葉變異株葉片整體亦大于CK2，而矮小株葉長顯著小于對照，葉寬、葉面積則均大于對照。

表4 太空搭載后扁蓿豆品種各變異株葉片與其對照的比較

3 討論

太空輻射誘變是利用外層空間的特殊環(huán)境，使植物材料DNA分子產(chǎn)生變異或重組，屬于不定向變異，從而快速獲得豐富的物種資源[23]。扁蓿豆種質(zhì)材料的遺傳多樣性豐富，表現(xiàn)出較強的誘變效應(yīng)，本研究利用太空輻射誘變3個扁蓿豆品種，在當代表現(xiàn)出一定的表現(xiàn)型變異，變異頻率較高，變異幅度大，正向變異明顯。通過太空輻射誘變后直立型扁蓿豆種子發(fā)芽出苗均受到抑制，而對蒙農(nóng)1號扁蓿豆種子和蒙農(nóng)2號扁蓿豆種子發(fā)芽出苗則起到了促進作用。喬雨[24]、張雨桐[25]等人利用EMS誘變扁蓿豆種子后，在發(fā)芽及生長階段均表現(xiàn)出明顯的抑制效應(yīng)，而云娜[26]等人利用EMS誘變紅豆草后在部分低濃度處理下對其相對出苗率及相對成苗率起到促進作用，說明在誘變試驗中誘變處理程度的大小對種子的影響效果有顯著作用。本研究在同等條件下處理3個不同品種的扁蓿豆種子，可能是由于不同扁蓿豆品種遺傳上的差異，因而導致了在同等處理條件下出現(xiàn)抑制和促進的影響效果，其中蒙農(nóng)2號(B2)、蒙農(nóng)1號(B3)扁蓿豆種子是經(jīng)馴化選育的新品種。李鴻雁[27]發(fā)現(xiàn)，引起扁蓿豆種質(zhì)變異的主要性狀是千粒重、種子長和種子寬，而直立型扁蓿豆種子千粒重明顯小于其他兩種扁蓿豆種子，這也可能是導致其發(fā)芽率及出苗率低的主要原因?？资娣f[28]、王璐[29]等人利用秋水仙素誘變扁蓿豆，以探求使其染色體加倍的最適條件，結(jié)果表明經(jīng)秋水仙素誘變后的幼苗株型發(fā)生了變化，并且生長發(fā)育速度顯著低于對照。張文娟[30]等人利用空間誘變紫花苜蓿后成苗率及株高均顯著低于對照，而白麗君[31]等人利用空間誘變草地早熟禾得到矮化株生長速度顯著低于對照植株，這與本試驗結(jié)果相一致。由于太空誘變具有不定向性，所以經(jīng)太空誘變后在試驗中發(fā)生的變異類型除了較為常見的表型變異外，亦出現(xiàn)了少見的雙主莖變異，并且一些變異株出現(xiàn)生長較對照加快的現(xiàn)象，如方形真葉變異株成苗后自身生理性質(zhì)穩(wěn)定對大田環(huán)境適應(yīng)良好，生長速度從0.55cm/d上升為1.23cm/d，可能是由于第一片真葉肥大營養(yǎng)物質(zhì)充足，幼苗生長發(fā)育較好而在成苗后能更好的適應(yīng)大田環(huán)境，也可能是由于太空特殊復雜的空間環(huán)境對種子的遺傳物質(zhì)產(chǎn)生質(zhì)變的影響。生長加快類型的變異植株，具有培養(yǎng)高產(chǎn)性狀品種的潛力。

4 結(jié)論

4.1太空搭載對直立型扁蓿豆種子萌發(fā)及成苗有明顯的抑制作用，而對千粒重較大的蒙農(nóng)2號扁蓿豆和蒙農(nóng)1號扁蓿豆種子萌發(fā)及成苗有明顯促進作用。

4.2供試3個扁蓿豆品種誘變當代的變異率依次為4.26%、 3.30%、 2.22%，誘變效果較為顯著，正向變異方形真葉及雙主莖變異株優(yōu)勢突出，具有培育扁蓿豆優(yōu)良新種質(zhì)的潛力。