林福星 戴婧婷 羅菊香 張建漢

【摘 要】 殼聚糖毒性很低、生物相容性很好，同時又能夠在生物體內降解，而受到學者們的關注。然而殼聚糖的水溶性太差，使得應用研究很難開展。本文研究證實，裂解后HBC的分子量明顯降低，而MTT細胞實驗證實，裂解后HBC的細胞毒性依然很低，完全可以應用于生物材料領域。本課題為溫敏型生物材料HBC在生物、醫(yī)學等領域的推廣應用提供了堅實的基礎。

【關鍵詞】 生物材料;殼聚糖;輻射裂解;分子量;細胞毒性

【中圖分類號】 Q356.1 【文獻標識碼】 A 【文章編號】 2096-4102（2021）03-0097-03

殼聚糖是脫乙酰度（脫去乙酰基的葡萄糖胺單元數占總單元數的比例）在55%以上的甲殼質的總稱。殼聚糖具備了低細胞毒性、優(yōu)異的生物相容性、自然生物可降解性等優(yōu)良性能，在生物材料領域的應用中具備極大的潛力。

在分子結構上，由于殼聚糖鏈上眾多的羥基（-OH）以及氨基（-NH2）等基團很容易形成氫鍵，因此，殼聚糖的溶解性非常差。容易發(fā)生聚沉，穩(wěn)定的溶液濃度較低。通常，殼聚糖溶液的質量分數只能是1%-3%。

殼聚糖的應用在食品、化妝品等行業(yè)很常見，然而，殼聚糖的應用性能始終受限于溶解性，存在明顯的瓶頸。為了解決這個難題，本課題組設計改性并報道合成了一種親水性殼聚糖——羥丁基殼聚糖（HBC）。實驗結果證實，HBC在溶解性上有了比較大的提升。

由于生物材料在應用過程中，經常會用到輻射滅菌技術，以保證生物材料的安全性能。因此，對于生物材料HBC而言，他們的抗輻射穩(wěn)定性需要進行一定的探索，并且研究他們在輻照過程中的變化。

本研究通過之前報道的方法將羥丁基鍵合到殼聚糖的羥基和氨基上，成功合成了HBC。為了驗證HBC的輻射穩(wěn)定性以及輻射產物的安全性，將HBC溶液放置在60Coγ-ray的輻照下進行一定劑量（分別是0kGy，1kGy，2kGy，3kGy，5kGy，10kGy，）的輻照。之后對輻照制備的樣品進行后續(xù)的分析，包括分子量的測定和細胞毒性的研究。研究結果證實，經過輻照裂解過程之后，HBC分子量有所降低，且降低的程度與輻照劑量呈現正相關。另外，細胞毒性MTT實驗顯示，經過輻照裂解后的HBC毒性非常低，哪怕在10ug/mL的濃度下，細胞存活率依然在93.3%。這充分說明了HBC對細胞的生長沒有毒性作用，是非常良好的生物材料。這為HBC在生物、醫(yī)學等領域的推廣應用提供了堅實的基礎。

1材料與方法

1.1材料

殼聚糖（分子量Mw=2.0×105Da，脫乙酰度≧90%）以及1，2-環(huán)氧丁烷購自阿拉丁化學試劑有限公司。聚乙酰亞胺（PEI）來自美國賽默飛世爾科技有限公司。氫氧化鈉（片狀，97.0%-100%）、異丙醇（99.7%）、丙酮（99.5%）購自醫(yī)藥集團化學試劑有限公司。

細胞毒性實驗使用的3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基氮唑溴鹽（MTT）由碧云天生物科技有限公司提供，人宮頸癌細胞（Hela）培養(yǎng)在37oC以及含5%CO2的空氣中。胎牛血清從浙江天杭生物科技股份有限公司購買，青霉素-鏈霉素從美國英杰生物試劑有限公司購買，并添加在DMEM全培養(yǎng)基中。

本實驗中所使用的水均為去離子水，且上述試劑均為即買即用。

1.2 HBC的制備過程

HBC的制備原理如圖1所示。

首先，稱取25gNaOH片狀固體加入100mL燒杯，倒入50mL水并快速攪拌，待片狀固體全部溶解后通氮氣15min。隨后，取4g殼聚糖粉末加入上述的NaOH溶液中繼續(xù)攪拌，通氮氣15min。過濾，并用水洗至pH=7。之后，將濾紙上的固體加入到異丙醇/水混合溶液（V∶V=9∶1）中，并攪拌反應24h。接著，將1，2-環(huán)氧丁烷加入上一步的溶液，并繼續(xù)通氮氣15min，攪拌反應4d。然后，用丙酮沉淀并離心。將離心下來的沉淀物用水超聲洗滌，再離心分離，直至pH=9，真空干燥24h。

1.3不同吸收劑量的輻照后羥丁基殼聚糖的制備（HBC-X，X表示輻照過程中的總吸收劑量）

為了研究羥丁基殼聚糖在輻照過程的性能變化，需要將HBC溶液置于輻射源的輻照下。首先，用天平稱取10mg的羥丁基殼聚糖粉末溶解在上述的10mL濃度為0.1mol/L乙酸溶液中，超聲溶解，并通氮氣10min。之后，將羥丁基殼聚糖溶液樣品置于60Coγ-ray下輻照，劑量率為8.3Gy/min。控制不同的吸收劑量，得到不同的輻照后羥丁基殼聚糖（HBC-X）。

1.4 HBC-X的分子量測定

為了探究HBC溶液在輻照過程中變化，通過黏度法在25±0.1℃對不同吸收劑量輻照后的HBC樣品分子量進行測定。純溶劑的流出時間以1%的醋酸溶液在烏氏黏度計內的流出時間t0計算。在測試過程中，每個流出時間的測定都需要進行3次取平均值，且3次測量結果之間的極差不超過0.5s。接著，測定吸收不同劑量輻照的HBC樣品（HBC-0、HBC-1、HBC-2和HBC-3、HBC-5、HBC-10）的設置濃度梯度溶液（1、2/3、1/2）的流出時間，分別記為t1、t2和t3，然后根據設置濃度梯度的羥丁基殼聚糖溶液的流出時間（t1、t2和t3）和純溶劑的流出時間（t0），分別計算不同吸收劑量輻照后的HBC溶液的增比黏度?sp和相對黏度?r。最后，通過?sp/c和ln?r/c分別對HBC溶液的濃度c作圖，外推可得不同HBC溶液的特性黏度[?]，并通過公式1計算不同吸收劑量輻照后HBC的分子量。

[?]=K·Mα 公式1

公式1中，[?]是測得的特性黏度，K=1.8×10-3cm3·g-1，α=0.93，均為常數。

1.5 HBC-X的細胞毒性研究

為了體現HBC-X的細胞毒性水平，本次實驗選用常用的生物材料PEI作為對照，通過MTT細胞毒性實驗來表征測定。首先，以每孔5000個的密度在96孔細胞培養(yǎng)板上進行Hela細胞的培養(yǎng)，每孔添加200?L的含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的培養(yǎng)基，37oC下生長15h。之后讓細胞在100?L分別包含了HBC-0、HBC-1、HBC-2、HBC-3和PEI材料的全培養(yǎng)基中，保持溫度37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中生長48h。同時，一組添加100?L不含其他材料的細胞在純培養(yǎng)基中的自然生長設置作為空白對照。Hela細胞培養(yǎng)48h之后，將所有孔的培養(yǎng)液替換為20?LMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)4h的孵化。結束后，每個孔中加入150?L的DMSO。最后，通過酶標儀（美國博騰儀器有限公司）測定各個孔中細胞在490nm波長的吸光度。各種材料不同濃度的細胞毒性都可以通過細胞存活率來體現，細胞的存活率（Cellviability）通過公式2來計算。

[Cell viability%=AsampleAcontrol×100%] 公式2

公式2中，Asample和Acontrol分別代表材料測試組與所設置的空白對照組的細胞在490nm波長的吸光度值。

2實驗結果

2.1 HBC-X的制備

從圖1中可以很清楚地看到，沒有接受輻照的HBC溶液，是澄清無色的。經過1kGy的吸收劑量的輻照，HBC樣品溶液的顏色變成了圖中中間的淺黃色。而隨著吸收劑量的增大，殼聚糖溶液的顏色越來越少，當HBC溶液樣品被γ-ray輻照時，葡萄糖胺和N-乙酰葡萄糖胺單元的β（1-4）糖苷鍵斷裂，使得HBC的主鏈發(fā)生了鏈斷裂。另外，輻照過程通常伴隨著一些氧化反應，產生含大量的羰基和羧基，導致了整個溶液的顏色變黃。

2.2 HBC-X的分子量

烏氏黏度計法測得輻照后HBC溶液樣品的分子量如圖2所示。

不同吸收劑量輻照過后的HBC樣品測得的分子量，相比于原來的HBC-0，都有所降低。從圖2上最左邊，輻照之前的HBC-0組，分子量為35.0×104g·mol-1。吸收劑量為1kGy時，HBC樣品的分子量已經降為HBC-1的30.16×104g·mol-1。要是劑量加大到3kGy，分子量就只剩下26.34×104g·mol-1。而HBC-10這組材料，吸收劑量10kGy的時候，殼聚糖降解更加的明顯，分子量僅為19.27×104g·mol-1。HBC樣品輻照后的分子量降低，說明輻照過程中被一定程度降解。并且可以看到這樣的規(guī)律，隨著吸收劑量的增加，降解的程度越高，分子量降低越發(fā)明顯。

2.3 HBC-X與PEI的細胞毒性探究

對于吸收不同計量的輻照之后的產物（HBC-0、HBC-1、HBC-2、HBC-3）和PEI在不同濃度下的細胞毒性通過MTT法進行表征，結果如圖3所示。

HBC-0組，也就是未經過輻照的羥丁基殼聚糖，細胞存活率都接近100%，即使?jié)舛仍龃蠛芏啾?，細胞存活率也沒有明顯的降低。對于吸收一定劑量輻照之后的HBC，在0.5μg/mL的濃度下，HBC-1、HBC-2和HBC-3的細胞存活率分別是99.5%，97.3%和93.3%，遠高于PEI組的60.8%。當HBC樣品濃度從0.5μg/mL增大到10μg/mL，細胞存活率雖然有所降低，但是依然呈現比較健康的態(tài)勢。而對HBC-2和HBC-3來說，雖然比HBC-0和HBC-1略有降低，但也呈現一樣的趨勢。而之所以細胞存活率有些許降低，可能是輻照過程中所產生的含羰基以及羥基的產物給細胞帶來影響，而在相同的情況下，對比PEI組，它們的毒性非常驚人。PEI組即使在只有1μg/mL濃度下，大部分的細胞都會被殺死，假如PEI的濃度達到10μg/mL，那么，大多數細胞都會死亡，只剩下10%左右的細胞。這樣的對比，也有力地體現了HBC作為生物材料的低細胞毒性，比起劇毒的PEI有更加廣闊的臨床應用前景。

3討論

本文研究結果表明，羥丁基殼聚糖作為一種殼聚糖的衍生物，在具備溫敏等其他功能的同時，輻射相關的性質依然比較優(yōu)秀。雖然在輻照過程中，分子量會有少量的降低，但是如果輻照過程的吸收劑量不大的話，分子量降低程度較小。此外，HBC輻照之后的產物，依然具有非常低的細胞毒性，不會干擾Hela細胞的正常生長。因此，HBC作為一種溫敏型生物材料的應用是比較可靠的。

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