孟靜一 曹玲亞 李建寬 高建平

中圖分類號(hào) R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）10-1209-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.10.09

摘 要 目的：研究黨參多糖對(duì)脾虛模型小鼠的補(bǔ)脾作用。方法：將60只雄性ICR小鼠隨機(jī)分為空白組，模型組，黨參多糖高、中、低劑量組[1.6、0.8、0.4 g/（kg·d）]和四君子湯組[30 g/（kg·d），以生藥總量計(jì)]，每組10只。除空白組外，其余各組小鼠均灌胃番瀉葉溶液（0.4 g/d）構(gòu)建脾虛模型。造模后，各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥液，空白組和模型組小鼠灌胃20 mL/kg生理鹽水;每天給藥1次，連續(xù)6周。給藥結(jié)束后，測(cè)定小鼠體質(zhì)量并進(jìn)行一般行為學(xué)觀察，記錄其全血中紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，測(cè)定其血清中D-木糖、胃泌素（GAS）、胃動(dòng)素（MTL）、生長抑素（SS）、血管活性腸肽（VIP）、淀粉酶（AMS）、免疫球蛋白（IgG和IgM）、脂多糖（LPS）含量，并測(cè)定其結(jié)腸組織中密封蛋白（Claudin）、閉合蛋白（Occludin） mRNA及其蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量顯著減輕（P<0.05），出現(xiàn)了背毛稀疏、無光澤等脾虛癥狀;全血中紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血清中D-木糖、SS、VIP、AMS、IgG、IgM含量以及結(jié)腸組織中Claudin、Occludin mRNA及其蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），血清中GAS、MTL、LPS含量均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，黨參多糖高劑量組小鼠體質(zhì)量顯著增加（P<0.05），脾虛癥狀顯著改善;除黨參多糖低劑量組小鼠血清中D-木糖、IgM含量和結(jié)腸組織中Claudin、Occludin mRNA及其蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P>0.05），其余各組小鼠上述指標(biāo)均顯著改善（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：黨參多糖對(duì)番瀉葉所致的脾虛模型小鼠具有改善作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)其胃腸激素分泌、增強(qiáng)免疫以及保護(hù)腸黏膜屏障有關(guān)。

關(guān)鍵詞 黨參多糖;脾虛模型;補(bǔ)脾作用;胃腸激素;密封蛋白;閉合蛋白;小鼠

Study on the Tonifying Spleen Effect of Codonopsis pilosula Polysaccharides on Sennae Folium-induced Spleen-deficiency Model Mice

MENG Jingyi，CAO Lingya，LI Jiankuan，GAO Jianping（School of Pharmacy， Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the tonifying spleen effect of Codonopsis pilosula polysaccharides （CPP） on spleen-deficiency model mice. METHODS： Totally 60 ICR male mice were randomized into blank group， model group， CPP high-dose， medium-dose and low-dose groups [1.6， 0.8， 0.4 g/（kg·d）]， Sijunzi tang （SJZT） group [30 g/（kg·d），by crude drug]， with 10 mice in each group. Except for blank group， other groups were given Sennae Folium solution intragastrically （0.4 g/d） to establish spleen-deficiency model.? After modeling， administration groups were given relevant drug intragastrically， and blank group and model group were given 20 mL/kg normal saline intragastrically， once a day， for consecutive 6 weeks. After last administration， body weight of mice in each group was measured and their general behavioral characteristics were observed. The red blood cell count in whole blood were recorded， and the contents of D-xylose， gastrin （GAS）， motilin （MTL）， somatostatin （SS）， vasoactive intestinal peptide （VIP）， amylase （AMS）， immunoglobulin （IgG and IgM） and lipopolysaccharide （LPS） in serum were determined; mRNA and protein expressions of Claudin and Occludin in colon tissues of mice were also detected. RESULTS： Compared with blank group， body weight of mice in model group was significantly decreased （P<0.05）， and the spleen deficiency symptoms such as sparse back hair and no luster appeared; the red blood cell count in whole blood， serum contents of D-xylose， SS， VIP， AMS， IgG and IgM， mRNA and protein expressions of Claudin and Occludin were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）; serum contents of GAS， MTL and LPS were significantly increased （P<0.01）. Compared with model group， the body weight of mice were increased significantly in CPP high-dose group （P<0.05）， and spleen-deficiency symptom was improved significantly. Except for the serum contents of D-xylose and IgM， the protein expressions of Claudin and Occludin in colon tissue had no statistical significance in CPP low-dose group （P>0.05）， above indexes of other groups were improved significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSION： CPP can improve spleen-deficiency model mice induced by Sennae Folium， the mechanism of which may be associated with regulating gastrointestinal hormone secretion， enhancing immunity and protecting intestinal mucosal barrier.

KEYWORDS? ?Codonopsis pilosula polysaccharides; Spleen- deficiency model; Tonifying spleen effect; Gastrointestinal hormone; Claudin; Occludin; Mice

黨參（Codonopsis Radix）是臨床常用的補(bǔ)益藥，有健脾益肺、養(yǎng)血生津的傳統(tǒng)功效[1]。中醫(yī)腑臟理論認(rèn)為，“脾”是一個(gè)功能性結(jié)構(gòu)單位，曰“脾為后天之本”“四季脾旺不受邪”“脾為之衛(wèi)”，充分反映了脾與機(jī)體防御功能的關(guān)系[2-3]。脾虛證是臨床常見證型，表現(xiàn)為運(yùn)化功能失調(diào)及免疫功能受損，與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[4]。黨參多糖是黨參發(fā)揮生物活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一，具有抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等作用[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，黨參多糖在胃腸道消化系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用，可提高正常小鼠小腸蠕動(dòng)能力、胃蛋白酶活性及其排出量[7]，也可緩解葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎[8]，但有關(guān)黨參多糖補(bǔ)脾的作用機(jī)制研究尚少。鑒于此，本研究擬采用番瀉葉所致的苦寒瀉下脾虛小鼠動(dòng)物模型來評(píng)價(jià)黨參多糖的補(bǔ)脾作用，并從調(diào)節(jié)胃腸激素分泌、增強(qiáng)免疫及保護(hù)腸黏膜屏障的角度來探討其補(bǔ)脾機(jī)制，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

MS 352型酶標(biāo)儀購自芬蘭Thermo Labsystems公司;TG16W型微量高速離心機(jī)購自湖南湘儀離心機(jī)廠;LightCycler?96型實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRF-PCR）儀購自瑞士Roche公司;PowerPacTM型電泳儀、ChemiDocTMMP型凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司;D30型核酸蛋白檢測(cè)儀購自德國Eppendorf公司;Z326K型臺(tái)式高速離心機(jī)購自德國Hermle公司;T2600型紫外-可見分光光度計(jì)購自上海佑科儀器儀表有限公司;KZ-Ⅱ型高速組織研磨儀購自武漢賽維爾生物科技有限公司;DMi8型倒置熒光顯微鏡購自德國Leica公司;101 型細(xì)胞計(jì)數(shù)器購自山東翼動(dòng)新材料科技股份有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

黨參藥材（批號(hào)20170901）購自山西省長治市，番瀉葉（批號(hào)20171201）、茯苓（批號(hào)181001）、炒白術(shù)（批號(hào)190402）、炙甘草（批號(hào)190301）藥材或飲片均購自山西省中醫(yī)院;以上藥材由山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院高建平教授鑒定分別為桔梗科植物黨參Codonopsis pilosula（Franch）Nannf.的干燥根、狹葉番瀉Cassia angustifolia Vahl的干燥葉、多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf.的干燥菌核、菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根莖。D-木糖試劑盒（批號(hào)20191028）購自南京建成生物工程研究所;小鼠免疫球蛋白G（IgG）、IgM、胃泌素（Gas）、胃動(dòng)素（MTL）、生長抑素（SS）、血管活性腸肽（VIP）、淀粉酶（AMS）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（批號(hào)分別為MM-0057M1、MM-0058M1、MM-44405M1、MM-0492M1、MM-0493M1、MM-0446M1、MM-1018M1）均購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司;小鼠脂多糖（LPS）ELISA試劑盒（批號(hào)202012）購自上海江萊生物科技有限公司;PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)A170713A）、TB Green Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）熒光定量試劑盒（批號(hào)AJ52620A）均購自寶生物工程（大連）有限公司;全蛋白提取試劑盒（批號(hào)KGP250）、BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)KGPBCA）均購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;超敏ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（批號(hào) SW134-01）購自賽文創(chuàng)新（北京）生物科技有限公司;兔源密封蛋白（Claudin）多克隆抗體（批號(hào)13050-1-AP）、兔源閉合蛋白（Occludin）多克隆抗體（批號(hào)27260-1-AP）均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;兔源β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）多克隆抗體（批號(hào)GB11001）購自武漢賽維爾生物科技有限公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號(hào)RS0002）購自美國ImmunoWay公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

ICR小鼠60只，雄性，SPF級(jí)，體質(zhì)量（18±2）g，由斯貝福北京生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2016-0002。小鼠購入后分籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20～22 ℃、相對(duì)濕度為40%～60%。實(shí)驗(yàn)操作均按照山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)的要求執(zhí)行。

2 方法

2.1 藥液的制備

2.1.1 番瀉葉溶液 稱取番瀉葉藥材50 g，加5倍量（mL/g，下同）沸水，小火煎煮3.5 min，過濾，收集濾液并濃縮至1 g/mL（以生藥量計(jì)），即得。

2.1.2 四君子湯 四君子湯的中藥組成為黨參12 g、茯苓12 g、炒白術(shù)12 g、炙甘草6 g[9]。按處方量稱取各藥材或飲片，加入8倍量水浸泡1 h，再用小火煎煮1 h，過濾，收集濾液;濾渣繼續(xù)加6倍量水煎煮1 h，過濾，收集濾液。合并2次濾液，濃縮至2 g/mL（以生藥總量計(jì)），即得。

2.1.3 黨參多糖 黨參多糖的制備參照課題組前期方法[10]。稱取黨參藥材500 g，切段，加6倍量水加熱回流提取3次、每次1 h，分別過濾并收集濾液。合并3次濾液，以4 000 r/min離心15 min，收集上清液并減壓濃縮至原體積的1/4，然后加95%乙醇至乙醇的終體積分?jǐn)?shù)為80%，在4 ℃下醇沉12 h，然后以4 000 r/min離心15 min。收集沉淀，分別用無水乙醇、丙酮、乙醚各洗3次，然后在40 ℃真空干燥至恒定質(zhì)量，即得到黨參多糖（得率為18.39%）。

2.2 分組、造模與給藥

將60只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為空白組，模型組，黨參多糖高、中、低劑量組和四君子湯對(duì)照組，每組10只。除空白組外，其余各組小鼠均按0.4 g/d灌胃番瀉葉溶液，每天1次，連續(xù)5周，以復(fù)制小鼠苦寒瀉下脾虛模型[11];空白組小鼠灌胃等體積生理鹽水。造模完成后，黨參多糖高、中、低劑量組小鼠分別按1.6、0.8、0.4 g/（kg·d）灌胃黨參多糖（給藥體積為20 mL/kg，以水為溶劑），給藥劑量參考黨參日用劑量（30 g）并按人與動(dòng)物體表面積換算劑量公式折算[1]，分別為臨床成人等效劑量的2、1、0.5倍;四君子湯組小鼠按30 g/（kg·d）（以生藥總量計(jì)）灌胃四君子湯[12]，為成人臨床等效劑量;空白組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水。每天下午給藥1次，連續(xù)給藥6周。在給藥期間，除空白組外，其余各組小鼠每天上午均繼續(xù)按0.4 g/d維持灌胃番瀉葉溶液，每天1次。

2.3 小鼠體質(zhì)量測(cè)定與行為學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)期間，每3天以及在給藥結(jié)束后稱定小鼠體質(zhì)量，并每天觀察其一般體征。參考《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》的脾虛標(biāo)準(zhǔn)，制訂本研究中脾虛動(dòng)物模型的標(biāo)準(zhǔn)為：（1）大便溏稀;（2）體質(zhì)量減輕或增長緩慢;（3）蜷縮聚堆;（4）神態(tài)萎靡，毛色枯槁;（5）弓背;（6）易疲勞。其中，前3項(xiàng)為主癥，后3項(xiàng)為次癥，具備2項(xiàng)主癥或者1項(xiàng)主癥兼2項(xiàng)次癥者，即可認(rèn)定脾虛模型構(gòu)建成功[13]。

2.4 小鼠血清中D-木糖含量測(cè)定

末次給藥12 h后，各組小鼠均灌胃6%D-木糖溶液10 mL/kg;1 h后，摘眼球取血1.5 mL，迅速吸取全血10 μL用于紅細(xì)胞計(jì)數(shù)。剩余血樣于室溫靜置90 min后，以3 000 r/min離心10 min，分離上層血清。取部分血清，按照D-木糖試劑盒說明書要求，采用間苯三酚顯色法于紫外-可見分光光度計(jì)下測(cè)定小鼠血清中D-木糖含量。

2.5 小鼠全血中紅細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定

取“2.4”項(xiàng)下全血10 μL，以生理鹽水稀釋10 000倍至100 mL，取1或2滴稀釋血樣置于載有干燥蓋玻片的紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板的一端，于倒置熒光顯微鏡下采用細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行小鼠全血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2.6 小鼠血清中生物學(xué)指標(biāo)含量測(cè)定

取“2.4”項(xiàng)下血清適量，按照試劑盒說明書方法操作，采用ELISA法以酶標(biāo)儀測(cè)定各組小鼠血清中胃腸激素（GAS、MTL、SS、VIP）、AMS、IgG、IgM、LPS含量。

2.7 小鼠結(jié)腸組織中Claudin、Occludin mRNA表達(dá)測(cè)定

采用qRT-PCR法進(jìn)行檢測(cè)。取血后將小鼠處死，取其結(jié)腸，液氮速凍后，按照Trizol法提取結(jié)腸組織總RNA，檢驗(yàn)其純度后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（共20 μL）包括cDNA 模板2 μL，上、下游引物各0.8 μL，TB Green Premix Ex Taq Ⅱ10 μL，滅菌水6.4 μL。采用兩步法進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s，60 ℃延伸31 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量（以空白對(duì)照組的值為1）。引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度見表1[引物序列由本課題組采用Primer premier 5.0軟件自行設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成]。

2.8 小鼠結(jié)腸組織中Claudin、Occludin蛋白表達(dá)測(cè)定

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。取小鼠結(jié)腸組織適量，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的蛋白提取液，用高速組織研磨儀勻漿，然后在4 ℃下以12 850 r/min離心5 min，取上清液，按照BCA蛋白定量試劑盒方法測(cè)定總蛋白含量。將總蛋白于100 ℃加熱變性10 min后，取變性蛋白樣品30 μg進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（濃縮膠層80 V恒壓、分離膠層120 V恒壓），然后以0.3 A恒流轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入Claudin、Occludin、β-actin抗體（稀釋度分別為1 ∶ 8 000、1 ∶ 6 000、1 ∶ 2 000），于4 ℃孵育過夜;TBST溶液清洗5 min×3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗（稀釋度為1 ∶ 20 000），室溫下孵育1 h;TBST溶液清洗5 min×3次，經(jīng)超敏ECL化學(xué)發(fā)光液顯色后，于凝膠成像儀上成像。使用Image Lab 1.6.0軟件分析條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）條帶的灰度值比值作為目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黨參多糖對(duì)脾虛模型小鼠體質(zhì)量和行為學(xué)的影響

實(shí)驗(yàn)期間，空白組小鼠活動(dòng)正常，背毛光澤，反應(yīng)靈敏，糞便正常。模型組小鼠自灌胃番瀉葉溶液進(jìn)行造模后，其糞便就時(shí)軟時(shí)溏;后期出現(xiàn)了體質(zhì)量增長緩慢、扎堆、懶動(dòng)現(xiàn)象，且出現(xiàn)了肛周污穢和背毛稀疏、無光澤等脾虛癥狀，提示脾虛小鼠模型造模成功。給藥6周后，各給藥組小鼠的活動(dòng)及背毛情況均恢復(fù)正常。與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，黨參多糖高劑量組小鼠體質(zhì)量顯著升高（P<0.05）。給藥6周后各組小鼠體質(zhì)量測(cè)定結(jié)果見表2。

3.2 黨參多糖對(duì)脾虛模型小鼠血清中D-木糖含量的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清中D-木糖含量顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，黨參多糖高、中劑量組和四君子湯組小鼠血清中D-木糖含量均顯著升高（P<0.05）。各組小鼠血清中D-木糖含量測(cè)定結(jié)果見表2。

3.3 黨參多糖對(duì)脾虛模型小鼠全血中紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響

空白組，模型組，黨參多糖高、中、低劑量組和四君子湯組小鼠全血中紅細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為（9.24±0.91）×1012、（6.61±0.33）×1012、（9.98±0.12）×1012、（6.06±0.31）×1012、（5.02±3.35）×1012、（9.44±0.18）×1012 L-1（x±s，n=10）。與空白組比較，模型組小鼠全血中紅細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，黨參多糖高劑量組和四君子湯組小鼠全血中紅細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著升高（P<0.05）。

3.4 黨參多糖對(duì)脾虛模型小鼠血清生物學(xué)指標(biāo)的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清中GAS、MTL、LPS含量均顯著升高（P<0.01），SS、VIP、AMS、IgG、IgM含量均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，除黨參多糖低劑量組小鼠血清中IgM含量升高不顯著外（P>0.05），其余各組小鼠上述血清學(xué)指標(biāo)均顯著改善（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠血清生物學(xué)指標(biāo)含量測(cè)定結(jié)果見表3。

3.5 黨參多糖對(duì)脾虛模型小鼠結(jié)腸組織中Claudin、Occludin mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中Claudin、Occludin mRNA的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，黨參多糖高、中劑量組和四君子湯組小鼠結(jié)腸組織中Claudin、Occludin mRNA的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠結(jié)腸組織中Claudin、Occludin mRNA的表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果見表4。

3.6 黨參多糖對(duì)脾虛模型小鼠結(jié)腸組織中Claudin、Occludin蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中Occludin、Claudin 蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，黨參多糖高、中劑量組和四君子湯組小鼠結(jié)腸組織中Claudin、Occludin 蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠結(jié)腸組織中Claudin、Occludin蛋白表達(dá)的電泳圖見圖1，表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果見表5。

4 討論

四君子湯出自《太平惠民和劑局方》，是健脾的代表方劑，臨床常用于治療消化系統(tǒng)疾病，主治脾虛證[14]?，F(xiàn)代研究表明，四君子湯可明顯改善脾虛動(dòng)物的D-木糖含量，提高其消化吸收功能，具有健脾作用[15]。因此，本研究在利用番瀉葉復(fù)制脾虛小鼠模型的基礎(chǔ)上，采用健脾代表方四君子湯為陽性對(duì)照，對(duì)評(píng)價(jià)黨參多糖的補(bǔ)脾作用并挖掘其作用機(jī)制具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，黨參多糖干預(yù)后可增加脾虛模型小鼠的體質(zhì)量，改善了其扎堆懶動(dòng)、毛發(fā)不光澤等癥狀，提示其可改善番瀉葉所致的小鼠脾虛癥狀。血清中D-木糖含量可反映小腸吸收功能[16]。AMS是一種重要的消化酶，是反映消化、吸收功能的公認(rèn)指標(biāo)之一[17]。在本研究中，模型組小鼠血清中D-木糖、AMS含量和全血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著降低，表明模型組小鼠胃腸道吸收功能下降及氣血生化不足。經(jīng)黨參多糖干預(yù)后，脾虛模型小鼠血清中D-木糖、AMS含量和全血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著升高，提示黨參多糖可以改善脾虛模型小鼠的胃腸道吸收功能及氣血生化能力。

胃腸道功能的改變受機(jī)體內(nèi)胃腸激素分泌的影響[18]。GAS能促進(jìn)胃酸、胃蛋白酶的分泌，刺激胃腸道的蠕動(dòng)，增加黏膜血流量，營養(yǎng)胃腸道黏膜[19]。MTL可激活胃腸道平滑肌，能促進(jìn)消化道運(yùn)動(dòng)，加速胃排空，并刺激胃蛋白酶和胰液分泌[20]。SS能抑制胃酸的分泌和胃的蠕動(dòng)，可舒張血管平滑肌[21]。VIP可抑制多種胃腸激素的分泌[22]。研究表明，脾虛模型小鼠胃腸道吸收功能的下調(diào)與胃腸激素的紊亂有關(guān)[23]。在本研究中，模型組小鼠血清中GAS、MTL含量異常升高，SS、VIP含量均異常降低，表明模型組小鼠胃腸激素水平失調(diào)。而與模型組相比，黨參多糖高、中、低劑量組小鼠血清中GAS、MTL含量顯著降低，VIP、SS含量顯著升高，表明黨參多糖可明顯改善脾虛模型組小鼠胃腸激素的失調(diào)狀態(tài)。以上結(jié)果提示，黨參多糖能改善脾虛模型小鼠的胃腸吸收功能，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)胃腸激素水平有關(guān)。

免疫球蛋白作為免疫活性物質(zhì)，是“衛(wèi)氣”功能活動(dòng)的重要物質(zhì)之一[24]。IgG在血清中含量最高，IgM則是抗原刺激誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答中最先產(chǎn)生的免疫球蛋白，二者是體液免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵因子，可作為評(píng)價(jià)機(jī)體免疫力的指標(biāo)[25]。在本研究中，與空白組比較，模型組小鼠血清中IgG、IgM含量均異常降低，表明模型組小鼠“衛(wèi)氣”功能下降。而給予不同劑量黨參多糖干預(yù)后，脾虛模型小鼠血清中IgG、IgM含量均不同程度升高。以上結(jié)果提示，黨參多糖可通過調(diào)節(jié)脾虛模型小鼠血清中IgG、IgM含量而提高機(jī)體免疫力，進(jìn)而發(fā)揮健脾作用。

腸上皮是機(jī)體免疫系統(tǒng)與外界的主要屏障，脾虛則會(huì)影響腸道通透性以及腸黏膜屏障完整性[26]。緊密連接蛋白是腸黏膜屏障的重要組成部分，而Claudin、Occludin蛋白是緊密連接蛋白的基本組成單位[27-28]。本研究結(jié)果顯示，脾虛模型小鼠結(jié)腸組織中Claudin、Occludin mRNA及其蛋白的表達(dá)均顯著下調(diào)，這與李晶等[29]的研究結(jié)果一致，提示其腸道屏障功能受損。而給予黨參多糖干預(yù)后，脾虛模型小鼠結(jié)腸組織中Claudin、Occludin mRNA及其蛋白的表達(dá)均不同程度上調(diào)。當(dāng)腸黏膜屏障受損后，微生物、LPS等有毒物質(zhì)會(huì)大量入血，血清中LPS含量會(huì)異常升高[30]。本研究結(jié)果顯示，脾虛模型小鼠血清中LPS含量異常升高;而給予黨參多糖后，可顯著降低脾虛模型小鼠血清中LPS含量。以上結(jié)果顯示，脾虛模型小鼠存在腸黏膜屏障受損和血清中LPS含量異常升高的現(xiàn)象，而黨參多糖可恢復(fù)腸黏膜緊密連接并顯著降低血清中LPS含量，有效改善了小鼠的腸黏膜屏障損傷，這可能是黨參多糖在脾虛模型小鼠腸道發(fā)揮“脾為之衛(wèi)”健脾作用的機(jī)制之一。

綜上所述，本研究結(jié)果揭示黨參多糖是黨參補(bǔ)脾作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一，可改善脾虛模型小鼠的胃腸吸收功能，作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)其胃腸激素分泌、增強(qiáng)免疫以及保護(hù)腸黏膜屏障有關(guān)。此外，在本研究中筆者發(fā)現(xiàn)，黨參多糖發(fā)揮補(bǔ)脾作用與腸道屏障功能有密切的聯(lián)系。而腸道微生物的多樣性與豐度會(huì)影響宿主腸道屏障功能且腸道菌群失調(diào)可誘發(fā)多種消化系統(tǒng)疾病[31]。因此，在下一步研究中，本課題組將從代謝組學(xué)和腸道菌群的角度出發(fā)對(duì)黨參多糖補(bǔ)脾功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期深入探索其補(bǔ)脾的作用機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[S]. 2020年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020：294.

[ 2 ] 劉芬，劉艷菊，田春漫.蒼術(shù)麩炒前后對(duì)脾虛證模型大鼠免疫系統(tǒng)及胃腸激素影響的比較研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2015，26（6）：1371-1373.

[ 3 ] TU J，XIE Y，XU K，et al. Treatment of spleen-deficiency syndrome with atractyloside a from bran-processed atractylodes lancea by protection of the intestinal mucosal barrier[J]. Front Pharmacol，2020，11：1-13.

[ 4 ] 孟凡征，李亞男，趙金生，等.“脾虛證”實(shí)質(zhì)的現(xiàn)代研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2019，30（12）：2975-2977.

[ 5 ] GAO S M，LIU J S，WANG M，et al. Traditional uses，phytochemistry，pharmacology and toxicology of Codonopsis：a review[J]. J Ethnopharmacol，2018，219：50-70.

[ 6 ] HE J Y，MA N，ZHU S，et al. The genus Codonopsis（Campanulaceae）：a review of phytochemistry，bioactivity and quality control[J]. J Nat Med，2015，69（1）：1-21.

[ 7 ] 馬方勵(lì)，沈雪梅，時(shí)軍.黨參多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胃腸道功能的影響[J].安徽醫(yī)藥，2014，18（9）：1626-1630.

[ 8 ] JING Y P，LI A P，LIU Z R，et al. Absorption of Codonopsis pilosula saponins by coexisting polysaccharides alle- viates gut microbial dysbiosis with dextran sulfate so-? ? ? ? dium-induced colitis in model mice[J]. Biomed Res Int，2018，2018：1781036.

[ 9 ] 趙盛云.四君子湯對(duì)脾虛證大鼠胃黏膜屏障功能影響的實(shí)驗(yàn)研究[D].沈陽：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，2014.

[10] 張霞，李建寬，曹玲亞，等.不同基源、產(chǎn)地對(duì)黨參總多糖中低分子量果聚糖的影響[J].中成藥，2020，42（1）：145-149.

[11] 黃文武，彭穎，王夢(mèng)月，等.四君子湯及其單味藥水煎液對(duì)脾虛大鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2019，25（11）：8-15.

[12] 閆清華.基于Label free蛋白質(zhì)組學(xué)和LC-Q-TOF-MS代謝組學(xué)的四君子湯干預(yù)脾虛證機(jī)制研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

[13] 鄭筱萸.中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則[S]. 2002年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2002：361-363.

[14] 高永珍，武瑞珍，陳永利.四君子湯在中醫(yī)內(nèi)科疾病脾胃氣虛證中的應(yīng)用[J].中國民族民間醫(yī)藥，2013，22（5）：52.

[15] 劉琳，李巖.四君子湯對(duì)胃腸道藥理作用的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2019，25（5）：990-994.

[16] 段永強(qiáng). Ca2+/CaM信號(hào)通路在大鼠脾虛證軀體泛化效應(yīng)中的響應(yīng)及益氣健脾中藥干預(yù)研究[D].蘭州：蘭州大學(xué)，2014.

[17] 李元.基于腦腸肽探討功能性腹瀉脾虛證“脾失健運(yùn)”生物學(xué)機(jī)制及中藥療效機(jī)制[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2018.

[18] 孫鳳蓬，宋于剛.胃泌素及其相關(guān)胃腸激素的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)（生理、病理科學(xué)與臨床分冊(cè)），2000，20（3）：229-231.

[19] FOURM D，GIGOUX V，REUBI JC. Gastrin in gastrointestinal diseases[J]. Gastroenterology，2011，141（3）：814- 818.

[20] 張國梁，豐廣寧，陶永等.消化復(fù)寧湯對(duì)肝郁脾虛大鼠胃泌素、胃動(dòng)素和胃腸運(yùn)動(dòng)功能的影響[J].安徽中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，28（3）：35-38.

[21] STENGEL A，TACHE Y. Central somatostatin signaling and regulation of food intake[J]. Ann N Y Acad Sci，2019，1455（1）：98-104.

[22] 羅云波.白術(shù)茯苓湯調(diào)控脾虛大鼠血管活性腸肽的物質(zhì)基礎(chǔ)研究[D].成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2010.

[23] 游宇，羅林，陳哲杰，等.生脈飲多糖提取工藝優(yōu)化及對(duì)脾虛模型大鼠腸道功能調(diào)節(jié)作用的研究[J].中國藥房，2019，30（4）：493-498.

[24] 林燕.基于代謝組學(xué)的肺衛(wèi)氣虛證候變化規(guī)律及中藥復(fù)方干預(yù)的臨床研究[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2014.

[25] 梁麗萍，梁一彪，李錦靈，等.補(bǔ)中益氣湯對(duì)氣虛發(fā)熱大鼠體液免疫能力的影響[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2017，37（13）：1224-1227.

[26] 黃玉珍.參苓白術(shù)散對(duì)脾虛泄瀉幼鼠模型腸黏膜屏障的影響[D].南京：南京中醫(yī)藥大學(xué)，2016.

[27] 盧璐，袁建業(yè)，費(fèi)曉燕，等.腸易激綜合征發(fā)病機(jī)制研究及治療進(jìn)展[J].中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2015，23（9）：661-665.

[28] MUZA-MOONS M M，SCHNEEBERGER E E，HECHT G A. Enteropathogenic Escherichia coli infection leads to appearance of aberrant tight junctions strands in the lateral membrane of intestinal epithelial cells[J]. Cellular Microbiology，2004，6（8）：783-793.

[29] 李晶，王垂杰，李玉鋒，等.參苓白術(shù)顆粒對(duì)功能性腹瀉大鼠結(jié)腸黏膜緊密連接蛋白表達(dá)的作用[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2016，22（12）：102-107.

[30] 陳健.黃芩苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)及機(jī)制探討[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2015.

[31] 林璋.脾虛證候患者腸道微生物和宿主代謝表型的關(guān)聯(lián)性研究[D].上海：上海交通大學(xué)，2018.

（收稿日期：2021-01-01 修回日期：2021-03-08）

（編輯：林 靜）