郝民琦 王佳慧 李曉玲 李海龍 吳玉泓

中圖分類號 R285;R574.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）10-1215-09

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.10.10

摘 要 目的：預(yù)測黃芪對潰瘍性結(jié)腸炎（UC）的可能作用靶點(diǎn)與機(jī)制，為臨床應(yīng)用黃芪治療UC的后續(xù)研究提供參考。方法：經(jīng)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺數(shù)據(jù)庫（TCMSP）和UniProt KB數(shù)據(jù)庫檢索黃芪的活性成分及其對應(yīng)靶點(diǎn)基因，經(jīng)Gene Cards數(shù)據(jù)庫檢索UC疾病相關(guān)靶點(diǎn)基因，借助Venny 2.1.0在線作圖工具獲取黃芪與UC的交集靶點(diǎn)基因，并應(yīng)用Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建“藥物-化合物-交集靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)。利用STRING數(shù)據(jù)庫獲取交集靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并應(yīng)用Cytoscape 3.7.0軟件進(jìn)行可視化分析和拓?fù)鋵W(xué)分析以獲取核心靶點(diǎn)基因。借助DAVID數(shù)據(jù)庫對交集靶點(diǎn)基因進(jìn)行基因本體（GO）功能注釋及KEGG通路富集，并應(yīng)用Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建“靶點(diǎn)-通路”富集網(wǎng)絡(luò)。通過AutoDock vina 1.1.2軟件將度值排名前5位的活性成分與核心靶點(diǎn)基因編碼蛋白進(jìn)行分子對接，應(yīng)用Discovery Studio 3.5軟件繪制結(jié)合模式圖。結(jié)果：黃芪中共有化合物143個(gè)，共篩選出了活性成分20個(gè)，對應(yīng)的靶點(diǎn)基因189個(gè);UC疾病相關(guān)靶點(diǎn)基因共4 356個(gè)。黃芪（涉及14種活性成分）與UC的交集靶點(diǎn)基因有126個(gè)。PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)基因?yàn)锳KT1、MAPK1、RB1、JUN等。GO功能注釋共得到GO條目2 294個(gè)（q值<0.05），包括生物過程條目2 093個(gè)（如對脂多糖的反應(yīng)、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)等）、細(xì)胞組成條目49個(gè)（如膜筏、膜微區(qū)等）、分子功能條目152個(gè)（如核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄等）。KEGG通路富集分析共得到條目160個(gè)（q值<0.05），如流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化信號通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）、白細(xì)胞介素17（IL-17）信號通路等。分子對接結(jié)果顯示，度值排名前5位的活性成分（槲皮素、山柰酚、芒柄花黃素、異鼠李素、7-O-methylisomucronulatol）與核心靶點(diǎn)編碼蛋白的結(jié)合能均小于-5.0 kcal/mol。結(jié)論：黃芪中的槲皮素、山柰酚、芒柄花黃素異等活性成分可能通過作用于MAPK14、JUN、AKT1等靶點(diǎn)基因，進(jìn)而對PI3K/Akt、IL-17等信號通路產(chǎn)生調(diào)控作用，最終發(fā)揮對UC的治療作用。

關(guān)鍵詞 黃芪;活性成分;潰瘍性結(jié)腸炎;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對接;作用機(jī)制

Study on the Mechanism of Astragali Radix in the Treatment of Ulcerative Colitis Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

HAO Minqi1，2，3，WANG Jiahui1，2，LI Xiaoling1，2，LI Hailong2，4，WU Yuhong1（1. School of Basic Medicine， Gansu University of TCM， Lanzhou 730000， China; 2. Key Laboratory of Dunhuang Medicine and Its Transformation of Ministry of Education， Gansu University of TCM， Lanzhou 730000， China; 3. Key Laboratory of TCM Mining and Innovation Transformation， Gansu University of TCM， Lanzhou 730000， China; 4. First Clinical Medicial School， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou， 730000， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE：To predict the potential target and mechanism of Astragali Radix in the treatment of ulcerative colitis （UC）， and to provide reference for the clinical application of Astragali Radix in the treatment of UC. METHODS：The active components and their corresponding target genes of Astragali Radix were retrieved by TCMSP and UniProt KB database. The related target genes of UC were searched by Gene Cards database. The intersection target genes of Astragali Radix and UC were obtained by Venny 2.1.0 online mapping tool， and interaction network of “drug-compound-intersection target” was constructed by using Cytoscape 3.7.0 software. PPI network of intersecting targets was obtained by using STRING database， and the visualization analysis and topological analysis were carried out by using Cytoscape 3.7.0 software to obtain the core target genes. By using DAVID database， the gene ontology （GO） function annotation and KEGG pathway enrichment of intersecting target genes were carried out， and the “target-pathway” enrichment network was constructed by using Cytoscape 3.7.0 software. Through AutoDock vina 1.1.2 software， the top five active components in the list of degree value were linked with the protein encoded by the core target genes; Discovery Studio 3.5 software was applied to draw out binding pattern map. RESULTS：There were 143 compounds in Astragali Radix， 20 active components were screened out， and 189 corresponding target genes were selected; there were 4 356 UC disease related target genes. There were 126 intersection target genes of Astragali Radix （involving 14 active components） and UC. The core target genes in PPI network were AKT1， MAPK1， RB1， JUN， etc. A total of 2 294 GO items （q value<0.05） were obtained from GO functional annotation， including 2 093 biological process items （e.g. response to lipopolysaccharide， response to molecule of bacterial origin）， 49 cell composition items （e.g. membrane raft， membrane microdomain）， and 152 molecular function items （e.g. nuclear receptor activity， ligand-activated transcription factor activity）. KEGG pathway enrichment analysis yielded 160 items （q value<0.05）， such as fluid shear stress and atherosclerosis signaling pathway， phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B （PI3K/Akt） signaling pathway，interleukin-17 （IL-17） signaling pathway. Molecular docking results showed that top 5 active ingredients （quercetin， kaempferol， formenonetin， isorhamnetin， 7-O-methylisomucronulatol） in the list of degree value had binding energies<5.0 kcal/mol with the protein encoded core targets. CONCLUSIONS： Quercetin， kaempferol， formononetin and other active components in Astragali Radix may play a role in the treatment of UC through the action of MAPK14，JUN，AKT1 and other target genes，and then on the signal pathways such as PI3K/Akt and IL-17.

KEYWORDS? ?Astragali Radix; Active ingredients; Ulcerative colitis; Network pharmacology; Molecular docking; Mechanism of action

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種慢性、非特異性腸道炎癥性疾病，其臨床多表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作或持續(xù)性的腹痛、腹瀉、黏液膿血便或不同程度的全身癥狀[1]。歷代中醫(yī)學(xué)家認(rèn)為，該病的主要病因?yàn)閮?nèi)外之邪影響脾胃，使脾胃運(yùn)化失司，而脾胃氣虛是發(fā)病的根本[2]。黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. var. mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，具有補(bǔ)氣固表、利水退腫、托毒排膿等功效[3]。現(xiàn)代藥理研究表明，黃芪的主要成分有黃芪多糖、黃芪甲苷Ⅳ以及黃酮類、生物堿類、氨基酸類化合物等，在保護(hù)腸黏膜、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等方面有重要作用[4-5]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，黃芪納米制劑在扶植UC模型大鼠腸道正常菌群生長、調(diào)節(jié)菌群失調(diào)等方面發(fā)揮了良好的作用，且其作用優(yōu)于雙歧桿菌活菌膠囊[6-7]。趙先亮等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在UC患者天樞、大腸俞等穴位注射黃芪注射液具有較好的療效。由此可見，黃芪及其活性成分在治療UC方面具有一定的開發(fā)價(jià)值。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)突破了“單藥物、單靶點(diǎn)”的傳統(tǒng)理念，借助拓?fù)鋵W(xué)分析、生物信息技術(shù)分析可以更系統(tǒng)、整體地探究傳統(tǒng)中藥的潛在作用靶點(diǎn)，充分挖掘其分子作用機(jī)制，為現(xiàn)代中醫(yī)藥研究提供了新的思路[9]。基于此，本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，探討黃芪治療UC多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的整體調(diào)節(jié)作用機(jī)制，并將篩選出的核心靶基因與黃芪的主要活性成分進(jìn)行分子對接，以初步驗(yàn)證黃芪治療UC的主要成分與靶點(diǎn)，進(jìn)而為其治療UC的相關(guān)后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 黃芪活性成分篩選及靶點(diǎn)基因收集

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺數(shù)據(jù)庫（TCMSP，http：//tcmspw.com/），以生物口服利用度（OB）≥30%、類藥性指數(shù)（BL）≥0.18作為篩選條件[9]，篩選黃芪的活性成分。在UniProt KB數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/）中，以“Organism：Homo sapiens（物種：智人）”為查詢條件，檢索上述活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)的UniProt ID，獲取對應(yīng)的基因簡稱，去重后即得黃芪活性成分的對應(yīng)靶點(diǎn)基因。

1.2“藥物-化合物-交集靶點(diǎn)”互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

以“Ulcerative colitis”為關(guān)鍵詞，從Gene Cards數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org/）中檢索UC疾病相關(guān)靶點(diǎn)基因。將其與“1.1”項(xiàng)下所得活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)基因分別上傳至Venny 2.1.0在線作圖工具（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）中，繪制韋恩圖，得到黃芪與UC的交集靶點(diǎn)基因。將黃芪活性成分信息、交集靶點(diǎn)基因信息分別導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件中，構(gòu)建“藥物-化合物-交集靶點(diǎn)”互作網(wǎng)絡(luò)，應(yīng)用該軟件中“Analyze network”功能對上述網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析。網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)代表藥物、活性成分和交集靶點(diǎn)基因，節(jié)點(diǎn)之間以邊相連接;節(jié)點(diǎn)度值表示與節(jié)點(diǎn)相連邊的數(shù)量，其值越大，即與其相連的節(jié)點(diǎn)就越多，表明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要，在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中起到樞紐的作用，可能是關(guān)鍵成分或者靶點(diǎn)[10]。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

將黃芪與UC交集基因?qū)氲絊TRING數(shù)據(jù)庫（http：//string-db.org/）中，選擇“Multiple proteins（多種蛋白質(zhì)）”選項(xiàng)，種屬設(shè)置為“Homo sapiens（智人）”，置信度設(shè)為“0.9”，并選擇隱藏散在的節(jié)點(diǎn)，以獲取交集靶點(diǎn)基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。應(yīng)用Cytoscape 3.7.0軟件對結(jié)果進(jìn)行可視化分析（網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)的大小及顏色的深淺與節(jié)點(diǎn)的重要性成正相關(guān)），并借助該軟件的“CytoNCA”插件進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，分別以介數(shù)中心性、接近中心性、度中心性、特征向量中心性、局部平均連通度、網(wǎng)絡(luò)中心性等參數(shù)的中位值為篩選條件，應(yīng)用R 4.0.2軟件進(jìn)行2次篩選，每次僅選取所有參數(shù)均大于中位值的靶點(diǎn)進(jìn)項(xiàng)下一次打分，末次打分所剩的靶點(diǎn)則為核心靶點(diǎn)。其中，介數(shù)中心性代表經(jīng)過某一節(jié)點(diǎn)的最短路徑的數(shù)量;接近中心性計(jì)算節(jié)點(diǎn)與網(wǎng)絡(luò)中其他節(jié)點(diǎn)的平均距離，接近中心性越大的節(jié)點(diǎn)其信息流動(dòng)性越佳;度中心性是某一節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)的鏈接性，表示節(jié)點(diǎn)的最直接影響力;特征向量中心性表示某一節(jié)點(diǎn)所處的周圍環(huán)境即鄰居節(jié)點(diǎn)的數(shù)量及質(zhì)量;局部平均連通度則注重節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的相互影響，是對度中心性的補(bǔ)充;網(wǎng)絡(luò)中心性作為一種新的基于邊緣聚類系數(shù)的關(guān)鍵蛋白中心性度量，既考慮了節(jié)點(diǎn)的中心性，又考慮了節(jié)點(diǎn)與相鄰節(jié)點(diǎn)之間的關(guān)系;這6個(gè)參數(shù)代表了整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)單獨(dú)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)渲匾裕淞炕翟酱?，說明節(jié)點(diǎn)在該網(wǎng)絡(luò)中越重要[11-13]。

1.4 基因本體功能注釋和KEGG信號通路富集

基于DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對黃芪與UC的交集靶點(diǎn)基因進(jìn)行基因本體（GO）功能注釋和KEGG通路富集分析。限定物種為“Human（人類）”，保留q值（即校正后的P值）小于0.05的富集條目，并按照q值大小進(jìn)行排序。GO分析選取排名前10位的富集結(jié)果進(jìn)行展示，KEGG分析選取排名前20位的富集結(jié)果進(jìn)行展示。將KEGG通路富集結(jié)果和交集靶點(diǎn)基因信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件中，構(gòu)建“靶點(diǎn)-通路”富集網(wǎng)絡(luò)，實(shí)現(xiàn)富集分析結(jié)果的可視化。

1.5 “藥物成分-核心靶點(diǎn)”分子對接驗(yàn)證

從PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載“1.1”項(xiàng)下黃芪活性成分中度值排名前5位的化合物的2D結(jié)構(gòu)，保存為“SDF”格式，作為小分子配體。從PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）中下載核心靶點(diǎn)對應(yīng)蛋白的3D結(jié)構(gòu)，保存為“PDB”格式，作為蛋白受體。利用Discovery Discovery Studio 3.5軟件對蛋白受體進(jìn)行去除原配體、水分子及添加氫原子等預(yù)處理并尋找活性口袋;然后，采用AutoDockTools 1.5.1軟件定義小分子配體，將小分子配體保存為“pdbqt”格式，并采用AutoDock vina 1.1.2軟件對核心靶點(diǎn)蛋白受體和黃芪活性成分小分子配體進(jìn)行分子對接[14]。通過兩者結(jié)合能來評價(jià)其結(jié)合活性：若結(jié)合能<0 kcal/mol，則表示配體與受體能夠自發(fā)地結(jié)合;結(jié)合能<-5.0 kcal/mol，表明結(jié)合活性良好，且結(jié)合能越小表明對接越穩(wěn)定（1 kcal=4.186 J）[15]。選取結(jié)合能≤-7.0 kcal/mol的受體-配體分子對接結(jié)果并應(yīng)用Discovery Studio 3.5軟件繪制核心靶點(diǎn)蛋白受體和黃芪活性成分小分子配體之間的結(jié)合模式圖，分別以3D和2D結(jié)構(gòu)進(jìn)行對接模式展示。

2 結(jié)果

2.1 黃芪中活性成分的篩選結(jié)果

通過TCMSP檢索發(fā)現(xiàn)，黃芪中共含有143個(gè)化合物，經(jīng)篩選后得到20個(gè)活性成分。黃芪活性成分的基本信息見表1。

2.2 “藥物-化合物-交集靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)的分析結(jié)果

從UniProt KB數(shù)據(jù)庫中共獲得黃芪活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)基因405個(gè)，去重后得到靶點(diǎn)基因189個(gè);從Gene Cards數(shù)據(jù)庫中共篩選出UC疾病相關(guān)靶點(diǎn)基因4 356個(gè)。兩者取交集后共得到交集靶點(diǎn)基因126個(gè)。黃芪與UC交集靶點(diǎn)基因的韋恩圖見圖1。

“藥物-化合物-交集靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)見圖2（圖中，中央圓形節(jié)點(diǎn)代表黃芪，外周圓形節(jié)點(diǎn)代表黃芪活性成分，節(jié)點(diǎn)上的編號為化合物對應(yīng)的TCMSP編號，綠色矩形代表“藥物-疾病”交集靶點(diǎn)，活性成分節(jié)點(diǎn)的大小代表與其所連接的靶點(diǎn)數(shù)目成正比）。由圖2可見，該網(wǎng)絡(luò)中共包括節(jié)點(diǎn)141個(gè)、邊274條。該網(wǎng)絡(luò)中，每個(gè)化合物平均與18.571個(gè)靶點(diǎn)相互作用，每個(gè)靶點(diǎn)平均與2.063個(gè)化合物相互作用。通過比較“藥物-化合物-交集靶點(diǎn)” 網(wǎng)絡(luò)中各成分的度值，篩選出排名前5位的活性成分分別是槲皮素、山柰酚、芒柄花黃素、異鼠李素、7-O-methylisomucronulatol，分別能與108、35、20、20、18個(gè)靶點(diǎn)蛋白發(fā)生作用;排名前5位的靶點(diǎn)蛋白分別是前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）、PTGS1、熱休克蛋白90α家族A類成員1（HSP90AA1）、蛋白質(zhì)絲氨酸蛋白酶1（PRSS1）、類視黃醇X受體α（RXR-α），分別能與13、11、10、10、8個(gè)成分發(fā)生作用。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)基因的篩選結(jié)果

拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果顯示，PPI網(wǎng)絡(luò)中共包含節(jié)點(diǎn)112個(gè)、邊447條。經(jīng)Cytoscape 3.7.0軟件中“CytoNCA”插件兩次篩選后最終得到8個(gè)核心靶點(diǎn)基因，即RELA、MYC、IL2、MAPK14、JUN、MAPK1、AKT1、RB1。黃芪與UC交集靶點(diǎn)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)如圖3，PPI核心靶點(diǎn)基因的篩選流程見圖4，核心靶點(diǎn)基因的拓?fù)鋮?shù)詳見表2。

2.4 GO功能注釋和KEGG 通路富集分析的結(jié)果

通過GO功能注釋分析共得到條目2 294個(gè)（q值<0.05），包括生物過程2 093個(gè)、細(xì)胞組成49個(gè)、分子功能152個(gè)。分析發(fā)現(xiàn)，其生物過程涉及對脂多糖的反應(yīng)、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)等;細(xì)胞組成涉及膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)域、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物等;分子功能主要集中于核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等，詳見表3、表4、表5。

KEGG通路富集共獲得條目160個(gè)（q值<0.05），排名靠前的通路包括糖尿病并發(fā)癥中晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體（AGE-RAGE）信號通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化信號通路、前列腺癌信號通路、乙型肝炎、白細(xì)胞介素17（IL-17）信號通路等。KEGG富集分析結(jié)果（前20條）見表6，其富集網(wǎng)絡(luò)（前20條）見圖5。

2.5 黃芪主要活性成分與核心靶點(diǎn)蛋白的分子對接結(jié)果

“藥物-化合物-交集靶點(diǎn)”互作網(wǎng)絡(luò)中度值排名前5位的主要活性成分與PPI核心靶點(diǎn)基因JUN、MAPK1、ATK1、IL2、MAPK14、RB1（RELA和MYC基因在數(shù)據(jù)庫中未找到對應(yīng)蛋白晶體結(jié)構(gòu)）編碼蛋白分子對接的結(jié)合能分?jǐn)?shù)色 階圖見圖6。由圖6可知，各組合對接分?jǐn)?shù)均小于-5.0 kcal/mol，表明結(jié)合活性良好。以上結(jié)果說明，黃芪的主要活性成分對UC的核心靶點(diǎn)具有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，而上述活性成分與核心靶點(diǎn)可能是黃芪治療UC的主要作用靶點(diǎn)。

結(jié)合能≤-7.0 kcal/mol的受體-配體分子對接結(jié)果3D、2D示意圖見圖7（圖中，黑色背景為3D結(jié)構(gòu)圖，主要展示對接位置及形態(tài);白色背景為2D結(jié)構(gòu)圖，主要展示對接成鍵信息）。氫鍵是促使配體結(jié)合到活性位點(diǎn)的主要作用力[16]。由圖7可知，槲皮素可與MAPK1基因編碼蛋白（PDB 編號6d5y）的活性位點(diǎn)MET-108、VAL-39形成氫鍵;槲皮素可與RB1基因編碼蛋白（PDB 編號1gux）的活性位點(diǎn)ARG-552形成氫鍵;7-O-methylisomucronulatol可與RB1基因編碼蛋白（PDB 編號1gux）的活性位點(diǎn)ARG-552、ARG-556形成氫鍵;芒柄花黃素可與ATK1基因編碼蛋白（PDB 編號1unp）的活性位點(diǎn)GLU-40、GLN-43、GLN-47形成氫鍵;芒柄花黃素可與RB1基因編碼蛋白（PDB 編號1gux）的活性位點(diǎn)THR-738、ARG-556形成氫鍵，并可在HIS-699處形成π-π堆積;異鼠李素可與MAPK1基因編碼蛋白（PDB 編號6d5y）的活性位點(diǎn)MET-108、GLU-33形成氫鍵;異鼠李素可與MAPK14基因編碼蛋白（PDB 編號5eti）的活性位點(diǎn)LEU-164、ASN-82、ASN-159形成氫鍵;異鼠李素與RB1基因?qū)?yīng)蛋白（PDB編號1gux）的活性位點(diǎn)ARG-556、ARG-552處形成氫鍵;山柰酚可與MAPK14基因編碼蛋白（PDB編號5eti）的活性位點(diǎn)ASN-159、ASN-82形成氫鍵;山柰酚可與RB1基因編碼蛋白（PDB 編號：1gux）的活性位點(diǎn)ARG-741、ARG-698、ARG-552、HIS-733形成氫鍵。

3 討論

UC是以持續(xù)或反復(fù)發(fā)作的腹瀉、黏液膿血便為主要臨床表現(xiàn)，伴腹痛、里急后重和不同程度全身癥狀的一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，其病因病機(jī)尚未完全明確[17]。近年來的研究多認(rèn)為，UC的發(fā)生發(fā)展是外源有害物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)所致宿主反應(yīng)、遺傳基因調(diào)控和過度免疫反應(yīng)三者之間相互作用的結(jié)果[18-19]，且與腸黏膜局部免疫反應(yīng)異常的關(guān)系尤為密切[16]。目前中醫(yī)臨床認(rèn)為，UC發(fā)病的根本原因?yàn)槠⑽笟馓?，治療宜以益氣健脾為主[20]?；跀?shù)據(jù)挖掘和文獻(xiàn)分析顯示，在用于治療UC的中藥當(dāng)中，補(bǔ)虛藥黃芪的使用頻次最高[21-25]。黃芪性微溫，味甘，歸脾、肺二經(jīng)，具有補(bǔ)氣固表、利水退腫、托毒排膿、生肌等功效[3，26]。相關(guān)研究表明，黃芪能夠保護(hù)免疫系統(tǒng)及腸黏膜屏障、抑制腸道內(nèi)細(xì)菌生長[27]。由此可見，黃芪可通過上述途徑發(fā)揮對UC的治療作用，但其具體分子調(diào)控機(jī)制仍不明確。

本研究結(jié)果表明，槲皮素、山柰酚、芒柄花黃素異、鼠李素、7-O-methylisomucronulatol等活性成分的作用靶點(diǎn)基因較多，為黃芪的主要活性成分。相關(guān)藥理研究表明，槲皮素最為核心且最為顯著的功效即為調(diào)節(jié)炎癥，其可通過抑制炎性細(xì)胞因子及炎癥誘導(dǎo)酶而發(fā)揮抗炎作用[28]。山柰酚具有極強(qiáng)的抗炎活性，可緩解炎癥反應(yīng)，具有保護(hù)結(jié)腸黏膜的作用[29]。氧自由基（ORF）具有很強(qiáng)的氧化作用，可引起細(xì)胞損傷及死亡，而芒柄花黃素能夠有效抑制并清除體外反應(yīng)體系中的ORF，對機(jī)體具有保護(hù)作用，且芒柄花黃素還具有抗炎活性[30-31]。異鼠李素屬于黃酮類化合物，其抗炎作用可涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)以及消化系統(tǒng)等，可通過抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)來阻斷核因子κB（NF-κB）以及p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）信號通路，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用[32]。

通過對交集靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO功能注釋分析發(fā)現(xiàn)，黃芪可以通過多種生物過程、細(xì)胞組成和分子功能對UC進(jìn)行調(diào)控。KEGG通路富集結(jié)果表明，AGE-RAGE信號通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、前列腺癌、PI3K/Akt、IL-17、TNF等信號通路為主要的調(diào)節(jié)通路，提示不同疾病之間可能存在著相同的調(diào)節(jié)機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號通路活化后可啟動(dòng)下游的NF-κB通路，釋放促凋亡蛋白和炎性細(xì)胞因子，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞凋亡，從而維持腸道炎癥，最終導(dǎo)致UC遷延難愈[33-34]。阻斷該通路后，NF-κB活化將受到抑制，使得炎性細(xì)胞因子的表達(dá)下調(diào)，從而修復(fù)結(jié)腸黏膜的炎癥損傷[35]。IL-17通過與IL-17受體結(jié)合，誘發(fā)下游信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，與炎癥和自身免疫疾病息息相關(guān)[36];此外，IL-17還可通過活化MAPK等通路誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞聚集以誘發(fā)炎癥，如代表免疫失衡的輔助性T 細(xì)胞17（Th17）細(xì)胞水平升高以及外周血中IL-17含量升高均可見于炎癥性腸病中[37]。在TNF信號通路中，TNF-α可通過上調(diào)NF-κB等因子來誘導(dǎo)多種效應(yīng)分子的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)白細(xì)胞募集、炎癥級聯(lián)放大等效應(yīng)，進(jìn)而加重UC的炎癥反應(yīng)[38]。

PPI網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果表明，MAPK14、IL2、MAPK1等8個(gè)靶點(diǎn)基因處于網(wǎng)絡(luò)的核心位置，這8個(gè)靶點(diǎn)基因不僅對應(yīng)多個(gè)活性成分，而且在PPI網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用，提示這8個(gè)基因可能是黃芪發(fā)揮治療作用的極重要的靶點(diǎn)。如MAPK基因與細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥等多種生命活動(dòng)有關(guān)，參與細(xì)胞對多種刺激的反應(yīng)，其可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化，影響細(xì)胞的存活和凋亡，與UC的發(fā)生密切相關(guān)[39-40]。IL-2是一種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，其對免疫調(diào)節(jié)有很大的作用，可與單核細(xì)胞體結(jié)合，增強(qiáng)T細(xì)胞活化和細(xì)胞殺傷作用[41]。分子對接結(jié)果表明，核心靶點(diǎn)與黃芪主要活性成分均擁有良好的對接活性（結(jié)合能<-5.0 kcal/mol），進(jìn)一步說明了黃芪主要活性成分可通過調(diào)控上述核心靶點(diǎn)對UC起到治療作用，驗(yàn)證了上述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果的可靠性。

綜上所述，黃芪中的槲皮素、山柰酚、芒柄花黃素異、鼠李素等活性成分可通過作用于MAPK14、MAPK1、JUN、AKT1等靶點(diǎn)基因，進(jìn)而對TNF、PI3K/Akt等信號通路產(chǎn)生調(diào)控作用，從而發(fā)揮其對UC的治療作用。從分析結(jié)果中還可以看出，通路及靶點(diǎn)之間存在著交叉作用，同一靶點(diǎn)可通過調(diào)控多條通路而發(fā)揮對疾病的治療作用，而代表不同疾病的信號通路（如癌癥、肝炎等信號通路）又包含相同的靶點(diǎn)，這與中醫(yī)學(xué)“同病異治，異病同治”的思想較為符合，也從現(xiàn)代分子生物學(xué)角度初步印證了中藥多靶點(diǎn)、多通路、多途徑的治療特點(diǎn)。

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（收稿日期：2020-11-25 修回日期：2021-01-28）

（編輯：林 靜）