郭方亮，李向芬，邢桂琪，郭林溪，蘇 勤

口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)(學(xué))院牙體牙髓病科，成都 610041

馬甲子（Paliurus ramosissimus（Lour.）Poir.）的葉，又名銅錢樹、鐵籬笆，是鼠李科馬甲子屬植物。據(jù)《中藥大辭典》、《中華本草》記載，具有清熱解毒、祛風(fēng)利濕、消腫止痛、散淤止血和治療癰瘡潰瘍等功效。在其95%乙醇提取物和乙酸乙酯萃取物中，主要活性成分為三萜類、生物堿類（環(huán)肽）以及黃酮類等，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等活性[1]。余悅等[2]將馬甲子乙酸乙酯提取物用于小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，發(fā)現(xiàn)該提取物能顯著降低血清TNF-α 水平，從而達(dá)到良好抗炎的效果，提示中藥馬甲子提取物具有較明顯抗炎作用。臺(tái)灣民間偏方中認(rèn)為，馬甲子可用于治療急性牙痛；但馬甲子能否用于早期牙髓炎癥的控制、促進(jìn)牙髓組織自愈能力，目前尚無相關(guān)研究報(bào)道。在牙髓炎癥中，IL-1β、IL-6 和TNFα 是在其病理過程中常見的且極為重要的炎性細(xì)胞因子。本研究擬培養(yǎng)炎癥狀態(tài)牙髓細(xì)胞，研究馬甲子提取物對(duì)體外牙髓細(xì)胞的炎癥抑制作用，為其作為牙髓治療的藥材的可行性提供基礎(chǔ)支持，也為其在口腔其他領(lǐng)域中的應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

馬甲子乙酸乙酯提取物及乙醇提取物由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院提供（批號(hào)：20170823），植株采自四川省成都市牧馬山，經(jīng)四川省中醫(yī)藥科學(xué)院舒光明研究員鑒定確認(rèn)。

馬甲子乙醇提取物得率為7.43%，馬甲子乙酸乙酯提取物的得率為20.04%。馬甲子提取物溶液配制過程如下：①馬甲子提取物（乙醇提取物、乙酸乙酯提取物）、DMSO 溶液（二甲基亞砜）、細(xì)胞培養(yǎng)液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要的用量，按照250 μg∶10 μL∶1 mL 的比例分別稱量取出。②在離心管中，將馬甲子提取物與DMSO 溶液按照250 μg∶10 μL 混合，振蕩器振蕩6 min，馬甲子提取物溶解于DMSO 溶液中。③在上步所得溶液中加入按照馬甲子提取物、DMSO 溶液、細(xì)胞培養(yǎng)液為250 μg∶10 μL∶1 mL 的比例的細(xì)胞培養(yǎng)液，振蕩20 min，使管內(nèi)各組分溶解。④無菌超凈臺(tái)下使用細(xì)菌微孔濾膜（0.22 μm）過濾所得溶液，即得到無菌的馬甲子提取物的細(xì)胞培養(yǎng)液，其濃度為250μg·mL-1，并稀釋為125、62.5μg·mL-1備用，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細(xì)胞株

人牙髓細(xì)胞（human dental pulp cells，HDPCs），收集自四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院外科門診。

1.3 試劑

CCK-8 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（同仁，日本）；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR qPCR Mix 試劑盒（Takara，日本）；人IL-1β、IL-6 和TNF-α ELISA 試劑盒（R&D，美國）；炎癥細(xì)胞炎癥合成引物（Sangon Biotech，上海）；牙齦卟啉單胞菌脂多糖（P.g-LPS，InvivoGen，法國）；細(xì)胞培養(yǎng)試劑和消耗材料產(chǎn)自Gibco、Hyclone 和Corning 公司。

1.4 主要儀器

熒光實(shí)時(shí)定量PCR 儀、超微量核酸蛋白測定儀Scandrop100（Analytikjena，德國）；多功能酶標(biāo)儀（Thermo，美國）。

1.5 方法

1.5.1 細(xì)胞收集與培養(yǎng) 經(jīng)患者知情同意后，取材于本院牙槽外科門診拔除的符合收集牙髓組織標(biāo)準(zhǔn)的年輕第三磨牙，以改良組織塊法培養(yǎng)牙髓原代細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)的方法鑒定所得細(xì)胞為人牙髓細(xì)胞[3]。配制含10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素雙抗溶液的DMEM 培養(yǎng)基，在5%CO2和37 ℃條件下培養(yǎng)，每隔2 天更換一次培養(yǎng)基,待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，用胰蛋白酶（0.25%）消化法以1∶3 或1∶4 傳代。在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，判斷細(xì)胞狀態(tài)。

1.5.2 形成體外人牙髓細(xì)胞炎癥狀態(tài) 取培養(yǎng)所得的P4 或P5 代HDPCs 按1×106個(gè)/mL 接種于6 cm 培養(yǎng)皿上，空白對(duì)照組為不加入P.g-LPS，實(shí)驗(yàn)組分別為加入1 μg·mL-1P.g-LPS 后刺激HDPCs 3、6、12、24、48h。提取各組樣本總RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，取各組復(fù)孔數(shù)為3 進(jìn)行IL-1β、IL-6、TNF-α 的RT-PCR 實(shí)驗(yàn)，引物序列根據(jù)Genebank 中的IL-1β、IL-6、TNF-α以及GAPDH 基因序列設(shè)計(jì)，委托上海生工生物工程公司合成，具體序列見表1。

表1 IL-1β、IL-6 和TNF-α 基因序列設(shè)計(jì)

RT-PCR 反應(yīng)條件：50℃下2min，95℃下10min；95 ℃下30 sec 與60 ℃下30 sec；共40 循 環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct方法進(jìn)行分析，通過炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA 表達(dá)水平結(jié)果，確定形成炎癥狀態(tài)的體外HDPCs 最佳的P.g-LPS 刺激的時(shí)間。

1.5.3 馬甲子提取物對(duì)HDPCs 生長的影響 取培養(yǎng)所得的P4 或P5 代HDPCs，按1×106個(gè)/mL 接種于96 孔板，空白對(duì)照組為正常培養(yǎng)的HDPCs；實(shí)驗(yàn)組為培養(yǎng)所得HDPCs 中分別加入1%DMSO 及250、125、62.5 μg·mL-1馬甲子提取物溶液（組名分別為DMSO 組；250 μg·mL-1乙醇提取物、250 μg·mL-1乙酸乙酯提取物；125 μg·mL-1乙醇提取物、125 μg·mL-1乙酸乙酯提取物；62.5 μg·mL-1乙醇提取物、62.5 μg·mL-1乙酸乙酯提取物）。各組取復(fù)孔數(shù)為3。分別于1、2、3、4、5 d 采用CCK-8 實(shí)驗(yàn)方法獲取各時(shí)間點(diǎn)的各組所測得OD 值（A），計(jì)算各組細(xì)胞活力相對(duì)值=（A計(jì)算孔-A空白孔）/（A對(duì)照第一天-A空白孔），繪制從1 天到5 天的各組HDPCs 的生長曲線，以確定保證HDPCs 生長的最佳的馬甲子提取物濃度。

1.5.4 馬甲子提取物對(duì)HDPCs 的炎性因子表達(dá)的影響 選取生長狀態(tài)良好的P4 或P5 代的HDPCs，以每孔2×105個(gè)的密度接種于6 孔板，空白組（LPS-）：正常培養(yǎng)HDPCs；對(duì)照組（LPS+）：加入1μg·mL-1P.g-LPS 的HDPCs；溶劑組（DMSO）：加入1%DMSO 與1 μg·mL-1P.g-LPS 的HDPCs；實(shí)驗(yàn)組（乙醇提取物、乙酸乙酯提取物）：加入125 μg·mL-1馬甲子乙醇或乙酸乙酯提取物，1 μg·mL-1P.g-LPS 的HDPCs。各組復(fù)孔數(shù)為3。各組在培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后分別收集總分泌蛋白，采用ELISA 的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)各組HDPCs 的IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白的分泌表達(dá)進(jìn)行檢測；同時(shí)完成總RNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、RTPCR 反應(yīng)，檢測各組HDPCs 的IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA 表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 20.0 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用ANOVA 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

如圖1 和圖2 所示：通過鏡下觀察，在收集原代細(xì)胞后第4～7 天，有細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，細(xì)胞形態(tài)無統(tǒng)一，排列多雜亂無序。經(jīng)培養(yǎng)一段時(shí)間至P2 代后，細(xì)胞變得均勻一致，多為梭形和多角形，胞質(zhì)豐富，核位于中央，核仁清晰，形態(tài)似成纖維細(xì)胞，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 原代細(xì)胞（40×）

圖2 P2 代細(xì)胞（40×）

2.2 P.g-LPS 刺激不同時(shí)間HDPCs 的炎癥相關(guān)因子mRNA 水平的表達(dá)情況

由表2 可見，使用P.g-LPS 刺激HDPCs 3 h，能夠顯著誘導(dǎo)IL-1β，IL-6 及TNF-α 炎癥相關(guān)細(xì)胞因子基因mRNA 的表達(dá)，并且表達(dá)水平呈高峰期，即本刺激條件能成功使體外牙髓細(xì)胞進(jìn)入炎癥狀態(tài)，可用于后續(xù)馬甲子提取物抗炎性能的實(shí)驗(yàn)研究。

表2 P.g-LPS 刺激不同時(shí)間HDPCs 炎癥相關(guān)因子mRNA 表達(dá)情況

2.3 不同濃度梯度的馬甲子提取物培養(yǎng)HDPCs的細(xì)胞生長曲線

通過測量各分組在各時(shí)間點(diǎn)的吸光度，計(jì)算各組細(xì)胞活力相對(duì)值所繪制的各組5 天內(nèi)的HDPCs生長曲線由圖3 可見，1%DMSO 對(duì)細(xì)胞生長曲線無明顯影響；125 μg·mL-1和62.5 μg·mL-1濃度的馬甲子提取物能保證細(xì)胞處于較好的生長增殖狀態(tài)，因此選用濃度相對(duì)較高的125 μg·mL-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 （A）馬甲子乙醇提取物和（B）馬甲子乙酸乙酯提取物不同濃度梯度用于培養(yǎng)HDPCs 的細(xì)胞生長曲線（n=5）

2.4 馬甲子提取物對(duì)炎癥環(huán)境下HDPCs 的炎性相關(guān)細(xì)胞因子蛋白及mRNA 表達(dá)的影響

由圖4 可見，馬甲子乙醇提取物和馬甲子乙酸乙酯提取物能下調(diào)在P.g-LPS 刺激下的HDPCs 的IL-1β、IL-6、TNF-α 的mRNA 的表達(dá)，也能抑制P.g-LPS 刺激下的HDPCs 分泌的IL-1β、IL-6 和TNF-α 蛋白。兩種提取物對(duì)炎癥因子mRNA 和蛋白的表達(dá)影響無明顯差異。1% DMSO 溶劑對(duì)炎癥HDPCs 的相關(guān)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌無顯著影響。

圖4 炎癥環(huán)境下各組HDPCs 的炎性相關(guān)細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白（A、B、C）及mRNA（D、E、F）表達(dá)量（n=3）

3 討論

牙髓組織具有一定的自身修復(fù)能力，如何消除早期或局限的炎癥牙髓組織中的感染物、保存健康牙髓、維護(hù)牙髓正常生理功能是臨床診治該類疾病的首要目的。隨著微創(chuàng)牙科理念的發(fā)展，新材料和新技術(shù)的應(yīng)用，如何精準(zhǔn)合理應(yīng)用各種治療技術(shù)和材料，最大限度地獲得損傷牙髓部分活髓保存的良好治療效果，延長患牙保存期，實(shí)現(xiàn)保髓治療效果的最大化，已成為口腔臨床醫(yī)生非常關(guān)注和迫切需要解決的問題。馬甲子的抗炎性能為其作為活髓保存的抗炎藥物提供一個(gè)新的臨床治療思路。

IL-1β、IL-6 和TNF-α 是常見的炎性因子，因此，本實(shí)驗(yàn)中通過檢測其mRNA 和蛋白的表達(dá)水平來反映牙髓細(xì)胞炎癥的嚴(yán)重程度[4-6]。LPS 通過與細(xì)胞表面TLR 受體結(jié)合后，激活多種下游的與炎癥反應(yīng)相關(guān)的信號(hào)通路，因此以LPS 刺激HDPCs 是較為常用形成炎癥狀態(tài)的牙髓細(xì)胞的方法[7]。

馬甲子提取物墨綠色粉劑難以直接溶于細(xì)胞培養(yǎng)液，為了將馬甲子提取物制備為溶液用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，以DMSO 作為中間溶劑使其與細(xì)胞培養(yǎng)液相溶。二甲基亞砜（DMSO）具有良好的熱穩(wěn)定性，能與水及大多數(shù)的有機(jī)物相溶，是一種公認(rèn)的“通用溶劑”，且有研究認(rèn)為，在4%及更低濃度的DMSO 溶液中，細(xì)胞的生長和增殖不受影響[8]。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)中也通過設(shè)置DMSO 的溶劑組消除了DMSO 可能對(duì)結(jié)果造成的偏倚。

通過實(shí)驗(yàn)檢測了馬甲子提取物對(duì)炎癥狀態(tài)的HDPCs 的炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的mRNA水平和蛋白水平表達(dá)的影響，確定馬甲子提取物能顯著抑制其炎性因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的表達(dá)，提示馬甲子提取物能對(duì)牙髓炎癥反應(yīng)產(chǎn)生一定抑制作用。該結(jié)果為馬甲子用于口腔臨床相關(guān)炎癥的治療提供了一定的基礎(chǔ)支持；但其在牙髓細(xì)胞中的抗炎的機(jī)理有待進(jìn)一步的研究。