低強度超聲對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

閆延鵬，鄭 杰，唐惠蘭，崔建國，胡 光

(重慶理工大學藥學與生物工程學院，重慶400054)

0 引 言

頻率超過20 kHz的聲波即為超聲波，其具有頻率高、波長短、方向性好、穿透性強的特點[1]。超聲波的生物效應主要包括機械效應、空化效應和熱效應等，這些生物效應對生物細胞生長會產(chǎn)生不同程度的影響[2]。超聲對細胞的刺激作用及相關機制已有了一定程度的研究，并取得了相應的成果。采用低強度超聲(Low-intensity Ultrasound, LIUS)刺激細胞可促進細胞新陳代謝、改善細胞內(nèi)組織營養(yǎng)、增強再生機能，尤其是對細胞增殖、軟骨修復等具有促進作用，臨床已證明LIUS可以促進新骨骨折、延遲愈合及骨折不愈合患者的康復[3-4]。已有研究表明，低強度超聲可以通過促進細胞的pH值升高[5-6]，促進細胞 Ca2+濃度升高[7-9]，尤其是改變細胞膜的通透性等方式來加快細胞的代謝生長[10-11]，其中聲孔效應是改變細胞膜通透性的最直接因素。目前，關于細胞刺激的超聲頻率選擇依據(jù)尚無統(tǒng)一標準，也缺乏詳細的理論描述，而且相關超聲刺激裝置多為換能器浸入式方式，結構缺乏嚴謹性，超聲刺激參數(shù)調(diào)節(jié)不便，并缺乏對刺激環(huán)境的整體控制和調(diào)節(jié)。

斑馬魚是研究胚胎發(fā)育分子機制的優(yōu)良資源，是繼大鼠、小鼠之后第三重要的脊椎類模式動物，已經(jīng)被廣泛應用于生命科學研究。斑馬魚具有體積小、易養(yǎng)殖、產(chǎn)量大、發(fā)育快等特點，適合實驗室高通量研究。此外，斑馬魚基因數(shù)目有約 30 000個，與人類基因組同源性高，許多基因與人類的基因存在一一對應的關系，是研究外界因素刺激對生物細胞生長發(fā)育影響的理想對象。

針對上述情況，本研究選擇低強度超聲對斑馬魚魚卵胚胎進行生長刺激研究，通過理論及仿真得到了細胞膜特征頻率；同時根據(jù)該頻率范圍設計了一種超聲刺激裝置，該裝置可對細胞刺激環(huán)境進行檢測與控制，并且能夠及時調(diào)節(jié)超聲作用參數(shù)；此外，為進一步驗證計算結果和裝置的作用，設計了正交試驗的方案，對超聲刺激頻率、刺激時間和信號激勵電壓展開了三因素、三水平的研究，以考察超聲裝置對斑馬魚魚卵孵化速度的影響，最終確定了最優(yōu)方案：在頻率為 1.26 MHz，刺激時間為30 min，信號激勵電壓為3 Vpp的超聲條件下，魚卵孵化指數(shù)明顯高于對照組。由此證明適當條件的超聲刺激可促進斑馬魚的胚胎發(fā)育。

1 理論基礎

生物細胞的共振頻率可由聲學振動理論進行推導和計算，對換能器的頻率選擇在超聲刺激細胞的研究實驗中具有重要的意義。依據(jù)共振吸聲理論，當超聲波換能器的中心頻率達到細胞膜的共振頻率時，細胞膜就會發(fā)生共振，從而使超聲能量最大限度地進入細胞，帶來一系列的生理、物理效應，尤其是聲孔效應。根據(jù)細胞的外形結構可將生物細胞分為圓球形和橢圓球形，故可分為兩種形式計算其細胞膜的共振頻率。

1.1 圓球形細胞膜的共振頻率

1.2 橢球形細胞膜的共振頻率

假設橢球細胞膜的長半軸為 a，短半軸為 b，以長軸和短軸建立x-y平面，Z為坐標x和坐標y的函數(shù)。借助里茲法解得橢球膜固有振型為[14]

1.3 超聲作用下的微泡聲孔效應

在超聲刺激細胞的過程中，超聲帶來一系列的生理、物理效應，尤其是聲孔效應。聲孔效應的出現(xiàn)是引起細胞膜通透性改變的最直接的因素[15]。通透性的改變會促進膜內(nèi)外物質(zhì)傳輸，提高胚胎細胞代謝率，加快細胞生長。聲孔效應的本質(zhì)是在短暫時間內(nèi)對細胞膜進行精確穿孔，因為高頻超聲的空化作用會在液體內(nèi)部產(chǎn)生大小不一的微泡，而處于細胞膜表面的空化微泡的劇烈破裂是引起聲孔效應的重要機制之一。在穩(wěn)態(tài)空化時，微氣泡的振動可以對附近細胞膜產(chǎn)生微聲流，或者微氣泡直接對細胞膜產(chǎn)生推拉作用；在瞬態(tài)空化時，微氣泡膨脹破裂產(chǎn)生沖擊波。這些作用可以對細胞膜產(chǎn)生可恢復或不可恢復的開裂，從而改變細胞膜通透性。

不同的細胞，其內(nèi)部成分及結構會有所差異。但從聲學角度分析，細胞可近似為充滿液體的球體，其狀態(tài)方程可用泰特(Tait)方程表示[16]：

其中：B和N為常數(shù)；pc為細胞內(nèi)部的壓強；p0為細胞內(nèi)的參考聲壓；ρc和ρc,0是細胞內(nèi)部的壓強為pc和p0時的細胞內(nèi)的流體密度?？紤]到胞內(nèi)含水量高達 80%，故可將細胞近似等同于水，即B=330.9 MPa，N=7.15，。當其他參數(shù)(如超聲頻率)不變時，通過增加超聲聲壓或減小微泡與細胞的間距，會明顯引起細胞膜的變形，從而增強聲孔效應。

可以通過建立橢圓細胞動力學模型，利用熒光探針來解釋超聲引起細胞膜通透性改變過程的機理以及對通透性影響的規(guī)律。細胞膜內(nèi)外熒光素物質(zhì)的進出同時進行，依據(jù)質(zhì)量守恒原則，質(zhì)量微分方程為[17]

其中：k1為細胞死亡熒光素損失速率常數(shù)；k2為熒光素滲入胞內(nèi)速率常數(shù)；k3為熒光素滲出胞外速率常數(shù)；E和F分別表示胞內(nèi)(外)熒光素的濃度。其中F=T-E，(T為胞內(nèi)外物質(zhì)滲透總量)。對式(8)求解得到一階常微分方程的通解：

式(9)為超聲作用下細胞膜通透性的動力學模型，其中，k1、k2、k3和T均為定值，與t、E和F無關，與超聲強度和頻率有關。上述關于細胞膜通透性改變的機制與理論分析，有利于后期超聲對細胞發(fā)育影響的闡述與說明。

2 超聲聲場與細胞特征頻率的仿真

本文使用仿真軟件COMSOL Multiphysics 5.4進行了超聲換能器流體域聲場及細胞膜特征頻率的仿真。該軟件可進行多物理場(結構力學、聲學、電磁、流體等模塊)以及多維組件的仿真，具有仿真準確、使靈活方便的特點。

2.1 細胞特征頻率的仿真

細胞膜主要由蛋白質(zhì)、磷脂和碳水化合物組成，為了方便仿真研究，本文將細胞等同于均勻的球形膜，通過細胞膜各組成成分的平均密度(蛋白質(zhì)為 1 330 kg·m-3，磷脂為 920 kg·m-3，碳水化合物為 1 200 kg·m-3)，求解均值得到細胞膜的平均密度為 1 080 kg·m-3[14]。細胞膜模型相關參數(shù)如表 1所示[18-20]。

表1 細胞膜仿真材料參數(shù)Table 1 Simulation material parameters of cell membrane

分別建立圓球形和橢球形細胞模型，通過仿真計算可知，圓球形細胞模型最小特征頻率為1.244 MHz，橢球形細胞模型最小特征頻率為1.225 4 MHz，為了簡化仿真過程，超聲高次諧波產(chǎn)生的其余特征頻率暫時不予考慮。該特征頻率下的細胞模型振型如圖1所示。由圖1可知，薄膜振型高低交替分布，振型為零的區(qū)域為節(jié)線[19]。

圖1 圓球形和橢球形細胞模型特征頻率及振型Fig.1 Characteristic frequencies and mode shapes of spherical and elliptical cell models

2.2 超聲場的仿真

仿真模型主要包括壓電換能器(非聚焦型，直徑為 10 mm，高為 2 mm)、鋁殼(厚為 0.5 mm，用作水浴槽)和流體域，如圖2所示。壓電換能器材料為PZT-5H，流體域為水，相關參數(shù)如表2所示。在流體域邊界設置完美匹配層(Perfectly Matched Layer,PML)，流體域通過引入PML來截斷，PML吸收流體中傳播的聲波，拉伸類型為有理數(shù)。

表2 仿真模型相關材料的參數(shù)Table 2 Parameters of materials related to simulation model

圖2 仿真模型二維圖Fig.2 Two-dimensional diagram of the simulation model

給予換能器上表面 3 Vpp(功率放大器的輸出電壓峰峰值)激勵電壓，下表面接地并設為“輥支承”，對模型各結構進行網(wǎng)格劃分。通過引言文獻[3-11]可知，超聲細胞刺激頻率都在0.5～2 MHz之間，并結合2.1節(jié)仿真結果與商售產(chǎn)品的實際共振頻率，本文仿真的換能器頻率為0.5 MHz、0.89 MHz和 1.26 MHz，通過計算即可得到輻射的聲場分布圖，如圖3所示，水域場正負聲壓交替分布，處于換能器中心區(qū)域上方的聲壓最高，隨著與換能器的距離增大，聲壓逐漸降低。

圖3 不同頻率換能器輻射的聲場分布圖Fig.3 Distribution nephograms of sound field radiated by transducers of different frequencies

圖4顯示了在r-z平面上換能器中心軸線r=0處以及徑向軸線z=10 mm處的聲壓分布線圖，考慮到不同徑向、縱向聲場分布趨勢較為接近，故以這兩處數(shù)據(jù)作為分析對象。圖4(a)顯示出距離換能器中心 2～4 mm 范圍內(nèi)時隨著距離的增加聲壓快速降低，由4 mm以后逐漸減小并在零聲壓場波動變化，對比圖4(a)和4(b)可以看出，換能器中心處聲壓明顯高于兩邊，而且隨著徑向距離的增加，聲壓變化較慢，但總體為減小趨勢。通過仿真結果可知，細胞刺激時為避免聲壓過高或過低，橫向距離可維持在距離換能器中心4 mm左右范圍內(nèi)，接近換能器的實際尺寸，由于縱向聲壓幅度變化較慢，縱向距離可根據(jù)實驗需要選擇，本研究選擇距離換能器約10 mm的位置。

圖4 聲場中聲壓沿中心軸線r=0 mm和沿徑向軸線z=10 mm的分布Fig.4 Sound pressure distribution along central axis of r=0 mm and along radial axis of z=10 mm in the sound field

3 超聲刺激對魚卵胚胎細胞的影響

為研究不同超聲參數(shù)下斑馬魚魚卵胚胎的生長情況，本文設計了一種超聲刺激裝置，并通過三因素三水平正交試驗 L9(34)進行了實驗測試，主要因素包括信號激勵電壓、刺激時間和超聲頻率。

3.1 超聲細胞刺激系統(tǒng)

超聲細胞刺激系統(tǒng)共包括冷卻箱、水浴箱控制裝置和超聲刺激驅(qū)動系統(tǒng)三部分，如圖5所示。冷卻箱主要是通過半導體制冷片進行冷卻箱內(nèi)部循環(huán)水的降溫。超聲刺激驅(qū)動系統(tǒng)主要包括信號發(fā)生器(北京普源RIGOL DG1012)，ATA-10功率放大器(西安安泰電子科技有限公司，內(nèi)部包括阻抗匹配器，機箱尺寸為260 mm×160 mm×60 mm)。

圖5 超聲細胞刺激系統(tǒng)Fig.5 Ultrasonic cell stimulating system

水浴箱控制裝置主要包括水浴槽、培養(yǎng)皿、顯示單元、三種壓電陶瓷超聲換能器(非聚焦型，頻率分別為0.5 MHz，0.89 MHz和1.26 MHz)、溫度控制檢測單元、循環(huán)水控制單元以及中央控制單元等部分。斑馬魚魚卵細胞最適生長溫度約為28℃，為了得到良好的刺激環(huán)境，本裝置通過 DS18B20溫度傳感器實時進行水溫檢測，溫度偏低時通過加熱片給予水溫補償，當水溫超過28℃時通過循環(huán)水控制單元和冷卻箱對水浴槽進行降溫。超聲換能器以陣列形式固定于水浴槽的底部，可以通過控制裝置對相應頻率的換能器進行選擇性激勵，因換能器在工作時會引起其正上方水槽底部的水溫升高(當水浴箱循環(huán)水關閉時，約升溫1.0℃)，可能會影響該位置處細胞生長，如圖6所示，故通過循環(huán)水控制單元驅(qū)動水泵均勻水浴槽內(nèi)的水溫，并起到一定的降溫作用。由于24孔板處于換能器上方10 mm左右處，經(jīng)測得該處水溫變化不足 0.2℃，故忽略水溫對魚卵的影響。

圖6 水槽中初始水溫和工作水溫的分布圖Fig.6 Distribution nephograms of water temperature at beginning and after work in the water tank

超聲細胞刺激驅(qū)動系統(tǒng)如圖5(b)中所示，由信號發(fā)生器產(chǎn)生與換能器頻率匹配的具有特定激勵電壓的正弦信號，該信號傳輸?shù)焦β史糯笃?功率放大器增益×10，輸出阻抗為 1 Ω)產(chǎn)生實驗所需的超聲電功率，并最終驅(qū)動換能器產(chǎn)生低強度超聲波作用于斑馬魚魚卵的胚胎細胞。

3.2 斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)

將野生型斑馬魚(AB品系)置于 28℃的循環(huán)水環(huán)境中飼養(yǎng)，光照 14 h/黑暗 10 h交替進行。斑馬魚每天喂食兩次魚食和新鮮孵化的豐年蝦。為了收集魚卵，將成對的(雄性和雌性)斑馬魚放置在產(chǎn)卵盒過夜。將收集到的魚卵每100個放在一個培養(yǎng)皿中，用10 mL培養(yǎng)液在28°C下培養(yǎng)，直到它們達到實驗所需的發(fā)育階段。裝有斑馬魚卵的培養(yǎng)皿被保存在一個恒溫28°C的培養(yǎng)箱中，其光-暗周期與水生設施相同。每天至少交換一半培養(yǎng)皿的水量。

3.3 正交試驗方案

通過預實驗及相關文獻資料可知，斑馬魚魚卵正常孵化時間為3天左右。刺激開始前將魚卵置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)32h左右，每隔一定時間清除死卵(含有白斑)，魚卵胚胎細胞如圖7所示，多為圓球形或橢球形。根據(jù)前期預實驗，確定影響魚卵孵化的主要因素與水平，其中刺激時間為10、20、30 min，信號激勵電壓為3、6、9 Vpp，超聲頻率為0.5、0.89、1.26 MHz，具體參數(shù)如表3所示。

表3 魚卵孵化正交試驗因素水平表Table 3 Orthogonal test factor level table of fish egg hatching

圖7 斑馬魚胚胎細胞Fig.7 Zebrafish embryo cells

選取健康的200顆魚卵，分為10組，每組20顆，一組為對照組，其余九組為正交試驗組。將每組魚卵分別置于相應換能器上方的24孔板的孔內(nèi)，調(diào)整實驗參數(shù)，進行刺激實驗，對照組給予空白超聲刺激。將刺激后的魚卵置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并定期統(tǒng)計孵化數(shù)目。實驗結果的評判指標為魚卵孵化指數(shù)[13]：

其中：IG為孵化指數(shù)，tD為觀察周期，本實驗以對照組開始孵化后 3h為一個周期，tG為一個周期內(nèi)的孵化個數(shù)。孵化指數(shù)表示魚卵的活力指標，指數(shù)越大，魚卵活力越高。

魚卵化正交試驗方案及孵化指數(shù)如表4所示。假設因素間無交互影響，為減小系統(tǒng)誤差，專門在表4中設置了空列。

表4 魚卵化正交試驗方案及孵化指數(shù)Table 4 Orthogonal test plan and hatching index of fish eggs

3.4 正交試驗結果分析

對實驗結果遵循極差分析法原則，計算各因素列取水平i(i=1, 2, 3)時所得孵化指數(shù)的算數(shù)平均值ki，以及各列的極差R，結果如表5所示。

根據(jù)表4可以看出，除了部分正交組(2組和5組)，其余各組孵化指數(shù)均高于對照組，說明適當超聲刺激可加快細胞生長。根據(jù)表5可知，由于極差RC＞RA＞RB，所以各因素從主到次順序為：C(超聲頻率)，A(刺激時間)，B(信號激勵電壓)，其中空列高于B列，本文推測是由于不同頻率換能器在相同激勵電壓下輸出電流有所波動，影響了刺激效果而引 起 的 。 同 時 ， 由 表 4可 知 ，k3A＞k2A＞k1A，k1B＞k3B＞k2B，k3C＞k1C＞k2C，故最優(yōu)方案為(即超聲頻率為 1.26 MHz，刺激時間為 30 min，信號激勵電壓為 3 Vpp)。該方案不在正交試驗組內(nèi)，是通過數(shù)據(jù)分析得出的，這體現(xiàn)了正交試驗的價值與優(yōu)勢。正交組最大孵化指數(shù)(4組)為29.7，為此，需要通過進一步實驗驗證該方案是否為最佳方案。

表5 試驗結果分析Table 5 Analysis of test results

3.5 超聲刺激參數(shù)的優(yōu)化分析

表6 優(yōu)化方案組和對照組及最佳正交組的孵化指數(shù)對比Table 6 Comparison of hatching index between optimized scheme group, control group and optimal orthogonal group

綜上所述，細胞在適當?shù)某晽l件刺激下，細胞膜發(fā)生共振產(chǎn)生一系列生物效應，其中空化氣泡引起聲孔效應從而改變細胞膜的通透性，加快細胞內(nèi)外物質(zhì)傳輸和細胞生長，從而促進斑馬魚胚胎細胞的孵化。

4 結 論

本文通過圓球形和橢球形細胞膜固有頻率的相關理論研究，分析了超聲空化微泡的振動和破裂產(chǎn)生的聲孔效應對細胞膜通透性的機理影響，通過仿真得到圓球形和橢球形細胞膜的特征頻率，從而確定了實驗頻率選擇范圍。根據(jù)實驗需要自行設計了一種超聲刺激裝置，該裝置可以實現(xiàn)水溫的檢測控制、水流量調(diào)節(jié)以及超聲換能器頻率選擇激勵等功能，以換能器固定于水浴槽底部的方式取代常用的浸入式，該方式換能器參數(shù)設置準確方便，能夠?qū)崿F(xiàn)對所刺激環(huán)境的整體控制和調(diào)節(jié)，能有效減小外界因素的干擾。

使用自制裝置對斑馬魚魚卵進行超聲刺激實驗，通過正交試驗和極差分析法，以孵化指數(shù)為指標，得到魚卵孵化的最優(yōu)方案是超聲頻率為1.26 MHz，刺激時間為 30 min，信號激勵電壓為3 Vpp，相應的孵化指數(shù)為 33.82，最佳頻率與仿真計算所得的圓球形細胞特征頻率(1.244 MHz)基本一致，與橢球形細胞特征頻率(1.225 4 MHz)較為接近。由此可見，本文前期的理論推導及仿真計算結果可信，實驗結果也表明適當?shù)牡蛷姸瘸暣碳た杉涌旒毎L，促進魚卵胚胎的孵化，對于生長周期較長的細胞，可以通過該方式加速其生長或增殖，縮短實驗周期，提高實驗效率。