文/ 長征縱橫

氣相分析方法開發(fā)的十二個步驟// 方法開發(fā)是個復雜而又神秘的工程，往往需要扎實的理論知識儲備，但同時也少不了經(jīng)驗的積累；對于方法開發(fā)，需要我們從多學科出發(fā)，分析儀器學、色譜學、藥學、有機化學、分析化學等學科綜合，也需要我們熟練掌握文獻信息檢索，從中吸取精華，同時不斷去試錯，下面就把我個人職業(yè)生涯的經(jīng)驗進行總結(jié)提煉，供同行一起學習探討。

步驟一、確認主要工作內(nèi)容

1.殘留溶劑檢測分析方法：GC-HS方法、GC直接進樣方法。

2.基因毒雜質(zhì)檢測分析方法。

3.高沸點樣品雜質(zhì)分離與含量檢測方法。

步驟二、信息收集

1.要確定待測物質(zhì)的溶解性、極性、沸點，主要針對“溶劑殘留”。

2.需要確定樣品的溶解性、熱穩(wěn)定性、極性、沸點、化學性質(zhì)（酸堿）、物理屬性（固體/液體/半固態(tài)）。

3.收集并計算化合物（待測物質(zhì)）的CH含量%比值，CH含量%比值越高檢測靈敏度就越好，反之，CH含量%比值越低檢測靈敏度就越差。

步驟三、色譜柱使用選擇指南（分離關(guān)鍵）

1.非極性色譜柱：分離主要根據(jù)沸點高低，沸點低先出，沸點高后出；同沸點的含有O含有N的極性先出，烴類后出，如：DB-1、HP-1、BP-1、SE-30；

2.極性色譜柱：分離主要根據(jù)分子極性大小，極性小先出，極性大后出,如DB-Wax；

3.首選中極性毛細管色譜柱，既能兼顧沸點差異又能兼顧極性差異，如：DB-624、HP-5，表1列舉了幾種常見色譜柱的極性及使用范圍；

表1 常見色譜柱的極性與使用范圍

4.色譜柱直徑（內(nèi)徑/粒徑）越窄/越小，柱效越高，峰展寬越小，峰越尖銳，峰靈敏度越高，增加分離度；

5.色譜柱膜厚影響傳質(zhì)阻力，液膜越薄的傳質(zhì)阻力越小，在同樣的線速度下能夠獲得更高的柱效，柱效越高，峰展寬越小，峰越尖銳，峰靈敏度越高，增加分離度；液膜厚，保留時間延長。

步驟四、進樣方法的選擇

1.方法有溶液直接進樣法、頂空進樣法。

①殘留溶劑-HS：大多數(shù)是低沸點物質(zhì)（醇/酯/烷烴/醚），90%以上采用頂空進樣（GC-HS），清潔進樣，基本不出雜峰（溶劑），原料不被破壞但經(jīng)濟費用高。

②殘留溶劑-DS：5%及少數(shù)采用溶液直接進樣（GC-DS），雖然經(jīng)濟，但出雜峰多（主要原料破壞帶入），易損壞色譜柱，需清潔老化保護，表2總結(jié)了一些方法開發(fā)選擇需要考慮的方面。

表2 開發(fā)選擇考慮總結(jié)

2.溶劑沸點過高（沸點大于180℃），且樣品對熱比較穩(wěn)定，首選溶液直接進樣法。

3.溶劑沸點低（沸點小于150℃），且樣品對熱不穩(wěn)定，首選頂空進樣法。

4.頂空進樣法可消除因溶液直接進樣會產(chǎn)生降解雜質(zhì)峰而干擾目標峰（進樣口溫度大于200℃），采用頂空進樣方法還可以減少對樣品的預處理。

5.基因毒雜質(zhì)方法開發(fā)，優(yōu)先選擇溶液直接進樣法（限度低，主要考慮提高靈敏度）；樣品雜質(zhì)分離選擇使用溶液直接進樣法。

6.對于基因毒雜質(zhì)限度小于2 ppm以下方法開發(fā)，優(yōu)先選擇GC-MS溶液直接進樣法。

7.查看CH含量%比值選擇進樣方法：

①CH含量%比值高：對于殘留溶劑檢測選擇頂空進樣法，對于雜質(zhì)分離/控制或基因毒雜質(zhì)控制選擇溶液直接進樣法時，可開發(fā)低濃度供試品溶液。

②CH含量%比值低：對于殘留溶劑檢測選擇溶液直接進樣法，對于雜質(zhì)分離/控制或基因毒雜質(zhì)控制選擇溶液直接進樣法時，可開發(fā)高濃度供試品溶液。

步驟五、確定定量方法

1.外標法：殘留溶劑、含量（準確）。

2.內(nèi)標法：殘留溶劑（主要針對易揮發(fā)烷烴類）。

3.面積歸一化法：樣品雜質(zhì)分離及純度。

步驟六、樣品預處理方法

1.氣相色譜儀能直接分析的樣品通常是氣體或液體，固體樣品在分析前應先溶解在適當?shù)娜軇┲?，而且還要保證樣品中不含GC不能分析的組分（如無機鹽：進樣口溫度不能保證鹽汽化），往往會聚集在進樣口襯管或分流平板導致污染/堵塞，還有可能通過載氣進入色譜柱中，損壞色譜柱的填料。

2.樣品預處理/溶解原則：根據(jù)相似相溶原理。

3.樣品分類：氣體樣品、液體樣品、固體樣品。

4.氣體/液體樣品預處理方法：

①直接進樣分析（純度分析與檢測），如：甲烷、乙醇；

②脂溶性液體樣品（雜質(zhì)），通常需要用脂溶性有機溶劑溶解樣品，如：甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、正己烷、

DMSO、DMF；

③進樣方式：溶液直接進樣、頂空進樣。

5.固體樣品（含鹽）樣品預處理方法：

①樣品性質(zhì)：易溶于水，難溶于有機溶劑，樣品熔點高，難汽化，如：鈉鹽/鉀鹽/鹽酸鹽/硫酸鹽/磷酸鹽/富馬酸鹽；

②如果選擇水作溶劑-盡量使用頂空進樣方法；

③靈敏度不理想且限度低（1~10 ppm）-可使用水溶解二氯甲烷/正己烷萃取法來進行預處理樣品，這樣既可以使用溶液直接進樣又可以使用頂空進樣，檢測雜質(zhì)/殘留/基因毒通用。

6.固體樣品（不含鹽）樣品預處理方法：根據(jù)相似相溶原理。

步驟七、溶劑系統(tǒng)選擇

1.如果是溶液直接進樣法，優(yōu)先考慮溶劑選擇，溶解樣品的溶劑和最大溶解限度；如果是頂空進樣法，可根據(jù)樣品和溶劑都能溶解；

2.原則上水溶性樣品優(yōu)先選擇水，非水溶性樣品可選擇酯/醇、DMF、DMSO、NMP、DMAC；

3.溶液直接進樣-樣品溶劑選擇考慮：

①化學穩(wěn)定（水解/醇解），優(yōu)先選擇水（水溶性）/醇/酯（脂溶性）作為溶劑；反之選擇烷烴、質(zhì)子溶劑（萬能溶劑：DMF、DMSO、NMP、DMAC）作為溶劑；

②樣品具有酸/堿性，但是檢測殘留溶劑或雜質(zhì)也具備酸/堿性，可根據(jù)待測物質(zhì)酸/堿性質(zhì)選擇酸堿中和樣品；如鹽酸/硫酸/富馬酸鹽等產(chǎn)品檢測胺類，需要單獨使用堿性溶劑進行中和解離，同樣反之，如吡啶/鈉/鉀鹽等產(chǎn)品檢測酸類，需要單獨使用酸性溶劑進行中和解離，具體溶劑選擇需要進行加標回收驗證實驗。

③供試品溶液要澄清，不與樣品及待測物質(zhì)反應或結(jié)合。

4.頂空進樣-樣品溶劑選擇考慮：

①化學穩(wěn)定（水解/醇解），優(yōu)先選擇水（水溶性）作為溶劑；反之選擇質(zhì)子溶劑（萬能溶劑：

DMF、DMSO、NMP、DMAC）；

②樣品具有酸/堿性，同上“3.②”。

③樣品溶解完全沒要求,頂空進樣氣體（溶劑殘留）。

5.對于低限度燃燒值大的物質(zhì)，可選用鹽析溶劑系統(tǒng)，如：苯殘留、三氯甲烷。

6.樣品溶解溶劑選擇，也要考慮殘留溶劑的溶解度（如：烷、醚類不溶解水）。

7.大部分溶劑系統(tǒng)優(yōu)先選擇DMSO、NMP、DMF，因為既能溶解樣品又能溶解溶劑。

步驟八、柱溫開發(fā)研究

1.等溫：對于溶劑個數(shù)少（1~3個），且各溶劑沸點差異不算很大，此時可選擇等溫法，比如50℃保持10~15分鐘，適合殘留溶劑檢測、基因毒雜質(zhì)檢測、含量測定。

2.程序升溫：對于溶劑個數(shù)多（大于5個），且各溶劑沸點差異較大，此時可選擇程序升溫法，比如40℃保持10分鐘，以10℃/min速率升至180℃，保持5分鐘，適用于產(chǎn)品雜質(zhì)分離、殘留溶劑檢測，表3、表4展示了經(jīng)典的程序升溫。

表3 經(jīng)典程序升溫（殘留溶劑、雜質(zhì)分離）

表4 雜質(zhì)分離的程序升溫

3.極端分離：對于大部分沸點低溶劑（當使用DB-624）且考慮分析時長時，可選用低溫程序升溫法，比如初始溫度為35~40℃，分析環(huán)境一定要保證溫度＜25℃。

步驟九、頂空條件方法選擇和研究

1.爐溫（加熱-頂空瓶平衡溫度）：

①以水為溶劑，溫度范圍選擇75~90℃，最高選擇90℃；

②以DMSO、DMF等為溶劑，溫度范圍選擇80~145℃，最高選擇140℃；溫度過高要考慮高溫時長導致溶劑反應降解產(chǎn)生新的未知雜峰；

③考慮溫度過高有爆瓶危險，特別在使用鹽析方法時（因為溶劑系統(tǒng)里有水分存在）爆瓶概率增加；

④加熱溫度研究最高溫度一般低于溶劑10℃（在考慮靈敏度情況下）。

2.定量環(huán)溫度：溫度要大于爐溫10℃。

3.傳輸線溫度：溫度要大于定量環(huán)溫度10℃。

4.頂空瓶（加熱）平衡時間：根據(jù)大部分溶劑沸點，沸點都相對高平衡時間就長，沸點都相對低平衡時間就短；常規(guī)平衡時間為30~60分鐘，經(jīng)典平衡時間為30分鐘。

十、檢測器選用

1.90%分析方法工作優(yōu)先選用FID檢測器：含碳氫化合物。

2.基因毒雜質(zhì)選用FID-MS檢測器。

3.如含電負性基團（F/Cl/Br）且含CH量少，選用ECD電子捕獲檢測器，如三氯甲烷無H物質(zhì)。

4.含有非碳氫化合物組分時，且對檢測靈敏度要求不高，通常選擇TCD檢測器，主要是氣體檢測，如輔材：氮氣。

5.其他：N/P（氮/磷）檢測器。

步驟十一、方法建立

1.進樣口溫度：一般選擇200~230 ℃，進樣口溫度要大于傳輸線溫度，可根據(jù)樣品性質(zhì)研究選用中高溫，如150~180 ℃（考慮樣品不被熱解）。

2.檢測器溫度：一般選擇230~260℃。檢測器溫度要大于進樣口和色譜柱溫度。

3.流速：3.0~5.0 mL/min，經(jīng)典流速為：4 mL/min和5 mL/min。

4.分流比：①5:1-50:1；②選擇規(guī)則：響應值高，使用大分流比，反之，則使用小分流比；③經(jīng)典分流比為5:1（頂空進樣）和50：1（溶液直接進樣）。

5.進樣量：頂空進樣為1 mL，溶液直接進樣為0.2-1 uL，也可根據(jù)進樣峰型進行改進。

6.樣品濃度/配制開發(fā)研究：

①頂空進樣：0.2~1 g（根據(jù)限度/靈敏度要求進行研究），對于大濃度要考察樣品提取平衡；濃度一般控制在0.1~0.4 g/mL（頂空裝量控制在1~5 mL）；

②溶液直接進樣：一定要考慮溶解完全，濃度可根據(jù)限度/靈敏度要求進行開發(fā)研究；一般控制在0.5~200 mg/mL；

③開發(fā)研究合適的樣品濃度，一定要根據(jù)雜質(zhì)限度/靈敏度做相應研究調(diào)整。

7.對于雜質(zhì)分離（溶液直接進樣法），在方法開發(fā)同時也要考察殘留問題，可增加清洗老化色譜柱方法程序，也可增加清洗進樣針方法；還有對于對氣相管路有吸附殘留性質(zhì)也可增加清洗程序（如胺類、＞150 ℃高沸點物質(zhì)），增加程序一定要作為分析方法的一部分，且一定要經(jīng)過驗證驗收。

8.方法開發(fā)時遇到難點：分離度、靈敏度、峰型。

分離度優(yōu)化研究：

①極性色譜柱與非極性色譜柱的轉(zhuǎn)換使用（DB-Wax與DB-624轉(zhuǎn)換）；

②使用程序升溫（速率可低至3~5 ℃/min，但是分析時長增加，靈敏度減?。?；

③使用長色譜柱（如30 m→45 m→75 m）；

④使用小粒徑色譜柱（3 um→1.8 um→1 um）；

⑤降低流速（變流速如：3→1 mL/min）；

⑥使用程序降溫（120→40℃，速率10-20 ℃/min）。

靈敏度優(yōu)化研究：

①增加進樣量（1→2uL）；

②增大流速；

③增加頂空瓶裝樣量（最大5 mL，可研究6~8 mL）；

④使用小粒徑色譜柱（3 um→1.8 um→1 um）；

⑤使用鹽析方法（成功典型：苯、三氯甲烷）；

⑥頂空方法：適當增加頂空瓶加熱溫度和時長（進行對比研究）。

峰型優(yōu)化研究：

①使用小粒徑色譜柱；

②增大柱流量；

③使用專屬柱（如胺類分析柱、醇類分析柱）；

④升高柱溫。

9.系統(tǒng)干擾考察研究：先走空白2針：樣品1針、對照1針，查看空白、樣品溶液的干擾情況，空白與樣品應無干擾峰出現(xiàn)（方法驗證-專屬性），且對LOQ和LOD測試無干擾，基本能通過LOQ和LOD驗證（方法好壞體現(xiàn)在系統(tǒng)與溶劑對測試的干擾）。

10.系統(tǒng)有干擾可通過換溶劑或調(diào)整程序升溫來消除對目標峰的干擾。

11.進行LOQ考察：只確認靈敏度（響應值）最小的2個，將LOQ試驗出來，LOQ對應濃度是否合格（LOQ含量不得高于限度的50%）。

12.最后進行100%加標回收測試，回收結(jié)果如果滿足90%~105%，方法基本確定。

步驟十二、分析方法評價與挑戰(zhàn)

1.分析方法開發(fā)評價標準：

①空白考察：空白溶液無干擾峰出現(xiàn)，應該對測試無影響（最小干擾＜LOD）；

②分離度：最低分離度標準為，各相鄰峰間分離度＞2.0（最小1.5）；

③LOQ：確認靈敏度（響應值）最小的2個，將LOQ試驗出來，LOQ對應濃度是否合格（LOQ含量不得高于限度的50%），且LOQ的S/N要大于10；

④加標回收標準（90%~110%）；

⑤溶液穩(wěn)定性：100%加標溶液考察0、2、4、8、24小時的穩(wěn)定性，主要考察峰面積RSD%（n=5）以及各溶劑的回收率%。

2.分析方法簡單預實驗（預驗證）：

①線性：50%、100%、150%、200%（每點進2針），R大于0.999；

②準 確 度：50%、100%、200%（每點進2針），回收率%應在90%~110%；

③SST實驗：6針對照結(jié)果，各溶劑峰峰面積RSD%（n=6）均小于6.0%，且考察各溶劑峰的拖尾因子或?qū)ΨQ因子（0.9~1.1，最大不可超過2.0）。