恩諾沙星乳在羅非魚體內(nèi)的藥代動力學(xué)及組織分布

朱曉漫，劉永濤，楊秋紅，胥 寧，劉紹春，董 靖，宋 懌，艾曉輝

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點實驗室，武漢 430223；4.岳陽漁美康生物科技有限公司，湖南岳陽 414199)

恩諾沙星(enrofloxacin,ENR)是一種氟喹諾酮類動物專用抗菌藥，具有廣譜殺菌性，在養(yǎng)殖魚類中被廣泛應(yīng)用于由嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[1]、大腸桿菌(Escherichiacoli)、維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)[2]及粘球菌(Myxococcuspiscicola)[3]等引起的病癥，其代謝產(chǎn)物為環(huán)丙沙星(ciprofloxacin,CIP)。國內(nèi)外已有較多有關(guān)恩諾沙星在水生動物體內(nèi)藥代動力學(xué)方面的研究報道，Koc等[4]分析了口服和靜脈給藥10 mg/kg恩諾沙星在褐鱒體內(nèi)的藥代動力學(xué)，達峰時間(Tmax)為8 h，峰濃度(Cmax)為(2.30±0.08)μg/mL；Zhai等[5]研究了恩諾沙星在脊尾白蝦體內(nèi)的藥代動力學(xué)；Kim等[6]研究了恩諾沙星在鯰體內(nèi)的藥代動力學(xué)。施建中[7]、徐維海等[8]研究了恩諾沙星在羅非魚體內(nèi)的殘留消除規(guī)律，但恩諾沙星在羅非魚(Oreochromsmossambcus)體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究尚未見報道；恩諾沙星乳作為一種近年來開發(fā)的新劑型，國內(nèi)外尚未展開其在水產(chǎn)動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究。羅非魚是聯(lián)合國糧農(nóng)組織推廣養(yǎng)殖的品種之一，為我國重要的出口創(chuàng)匯水產(chǎn)品，無乳鏈球菌病是危害羅非魚最嚴重的疾病之一，該菌在羅非魚腦組織中分布量較多，因常規(guī)抗菌藥物難以穿透血腦屏障，目前尚無好的防治藥物[9]。本試驗采用本實驗室研制的恩諾沙星乳新劑型，研究了口灌給藥方式下恩諾沙星乳在羅非魚體內(nèi)的藥代動力學(xué)及其在各組織的分布規(guī)律，旨在為羅非魚養(yǎng)殖過程中合理使用恩諾沙星乳提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試驗用魚與養(yǎng)殖條件

健康羅非魚96尾，由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所基地提供，平均體重為(100±20)g。試驗前在玻璃水族箱(規(guī)格為1 m×0.6 m，水深0.5 m)中暫養(yǎng)一周。試驗用水為充分曝氣自來水，養(yǎng)殖和試驗過程中水體持續(xù)充氧，保持水中溶氧大于 5.0 mg/L，pH為7.5～8.0，溫度恒定在(30±1)℃。

1.1.2 儀器設(shè)備

實驗中使用的主要儀器包括:Waters Acquity超高效液相色譜儀(Binary Solvent Manager、 Sample Manager、 FLR Detector、 配Empower色譜工作站，美國Waters公司)；精密電子天平(AE-240， METTLE-TOLEDO公司)；高速冷凍離心機； 氮吹儀(KD200，杭州奧盛儀器有限公司)；濃配罐(100L，宜興市江益環(huán)保有限公司)；渦旋混合器(HQ-60-IV，北方同正)；超聲波清洗器(KQ2200DE，昆山市超聲儀器有限公司)等。

1.1.3 藥品與試劑

恩諾沙星標(biāo)準品(純度>99.0%,Dr.Ehrenstorfer GmbH)，環(huán)丙沙星標(biāo)準品(純度>95.0%,Dr.Ehrenstorfer GmbH)，恩諾沙星乳(無色至淡黃色液體，規(guī)格5 g：100 mL，恩諾沙星乳滴呈球形，平均粒徑為(18.23±5.022) nm，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司GMP車間中試生產(chǎn)，批號：1711001)，乙腈、正己烷、水(色譜純，美國CNW公司)，甲酸(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)無水硫酸鎂(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，肝素鈉(源葉生物)。

1.2 實驗方法

1.2.1 恩諾沙星乳藥液的配制

首先將表面活性劑聚氧乙烯蓖麻油-40和助表面活性劑乙酸在濃配罐內(nèi)攪拌混勻，然后加入油相肉豆蔻酸異丙酯和恩諾沙星原藥，繼續(xù)攪拌混勻，最后加入去離子水，繼續(xù)攪拌直至體系變得澄澈透明，即形成恩諾沙星乳劑。制備出的恩諾沙星乳質(zhì)量濃度為5%，用蒸餾水將恩諾沙星乳稀釋10倍，所得藥液的恩諾沙星含量為5 mg/mL。

1.2.2 口灌給藥和樣品采集

羅非魚開始實驗前停食24 h，隨機抽取6尾作為空白對照，確定空白樣品無恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留后，以10 mg/kg 劑量對羅非魚單次口灌恩諾沙星乳。分別在給藥后的0.5、1、2、4、6、8、12、18、24、48、72、96、120、144、168 h采集血漿(抽取血液轉(zhuǎn)移至1%肝素鈉處理的離心管，輕輕轉(zhuǎn)動離心管后4 000 r/min離心5 min，取上清)，同時采集肌肉、肝臟、腎臟和腦組織，每個采樣點設(shè)定6尾魚為平行樣，-20 ℃貯存待測。

1.2.3 樣品前處理

在室溫下，將冷凍樣品自然解凍。準確量取血漿0.5 mL于10 mL離心管中，加入4 mL酸化乙腈(乙腈 ∶鹽酸 ∶水=250 ∶1 ∶1)，渦旋震蕩30 s，加入0.5 g無水硫酸鎂，渦旋震蕩30 s，7 000 r/min離心5 min，取上清液于另一10 mL離心管中。剩余殘渣再加入4 mL酸化乙腈，重復(fù)提取一遍，合并上清液。50 ℃氮氣吹干，1 mL流動相(0.2%甲酸水∶乙腈=82∶18)復(fù)溶，加入1 mL 正己烷旋渦混合30 s去脂，7 000 r/min離心5 min，取1 mL下層溶液過0.22 μm有機濾膜，供超高效液相色譜儀分析測定[10]。

稱取肌肉和肝臟樣品1 g，以及全部的腎臟和腦組織樣品于15 mL離心管中，加入6 mL酸化乙腈(乙腈∶鹽酸∶水=250∶1∶1)，渦旋震蕩30 s，加入0.5 g無水硫酸鎂，渦旋震蕩30 s，7 000 r/min離心5 min，取上清液于10 mL離心管中。剩余殘渣再加入6 mL酸化乙腈，重復(fù)提取一遍，合并上清液。50 ℃氮氣吹干，2 mL流動相復(fù)溶，加入2 mL 正己烷旋渦混合30 s去脂，7 000 r/min離心5 min，取1 mL下層溶液過0.22 μm有機濾膜，供超高效液相色譜儀分析測定[10]。

1.3 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，17 μm)，柱溫30 ℃；流動相：0.2%甲酸水(0.2%甲酸+99.8%水)∶乙腈=82∶18，流速0.3 mL/min；激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長450 nm；進樣量：3 μL。

1.4 標(biāo)準溶液的配制和標(biāo)準曲線的制備

精確稱取恩諾沙星、環(huán)丙沙星各10 mg，分別用乙腈溶解后定容至100 mL，配制成濃度為100 μg/mL的恩諾沙星和環(huán)丙沙星的標(biāo)準品母液，4 ℃避光保存?zhèn)溆?。用流動相將恩諾沙星和環(huán)丙沙星標(biāo)準品母液依次稀釋至10、50、100、500、1 000、2 000 μg/L，用超高效液相色譜檢測。以標(biāo)準品濃度作為橫坐標(biāo)(X軸)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y軸)繪制標(biāo)準曲線，計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.5 方法回收率與檢測限

取羅非魚各組織的空白樣品，分別加入10、50、100 μg/kg恩諾沙星和環(huán)丙沙星標(biāo)準品，放置30 min，以“樣品前處理”方法進行處理后進行超高效液相色譜檢測，每個濃度3個平行，得到樣品實測濃度，計算回收率和相對標(biāo)準偏差(RSD)。以引起3倍基線噪音的藥量的質(zhì)量濃度作為最低檢測限。

1.6 數(shù)據(jù)處理

標(biāo)準曲線以及恩諾沙星、環(huán)丙沙星的藥-時曲線用Microsoft Excel 2010進行計算和繪制；采用WinNonlin軟件進行恩諾沙星和環(huán)丙沙星的藥代動力學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準曲線與方法回收率

在本實驗方法條件下，恩諾沙星和環(huán)丙沙星在10～2000 μg/L的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，以 恩諾沙星和環(huán)丙沙星峰面積為縱坐標(biāo)(Y軸)，以化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X軸)，繪制得到的標(biāo)準曲線方程分別為Y=2283.1X+5504.5和Y=1268.3X+5132.6，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999。在本實驗條件下，恩諾沙星和環(huán)丙沙星最低檢測限為2 μg/L，定量限為10 μg/L。如表1所示，恩諾沙星和環(huán)丙沙星在各組織中的平均回收率為75.21%～108.77%，RSD<10%，滿足分析方法要求。

表1 恩諾沙星和環(huán)丙沙星在羅非魚各組織中的回收率

2.2 恩諾沙星乳在羅非魚血漿中的藥代動力學(xué)特征

所得恩諾沙星乳在羅非魚各組織中的藥代動力學(xué)參數(shù)見表2。結(jié)果顯示：血漿中恩諾沙星在2 h的藥物峰濃度Cmax為4.38 mg/L、消除速率常數(shù)ke值為0.02 h-1、藥時曲線下面積AUC為106.11(mg/L)·h；血漿中環(huán)丙沙星在8 h的Cmax為0.1 mg/L、ke值為0.01 h-1、藥時曲線下面積AUC為5.35(mg/L)·h。

表2 羅非魚單次口灌恩諾沙星乳后血漿中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的藥代動力學(xué)參數(shù)

2.3 恩諾沙星乳在羅非魚腦、肌肉、肝臟和腎臟中的吸收與分布

如圖1所示，單次口灌10 mg/kg恩諾沙星乳后，恩諾沙星在腦中的代謝規(guī)律與血漿基本一致，在給藥結(jié)束后2 h含量到達峰值4.38 mg/L(血漿)、4.31 mg/kg(腦)，隨后在2～24 h內(nèi)濃度迅速下降，24 h之后下降速率減緩，72 h后趨于平穩(wěn)。肌肉中的恩諾沙星略高于血漿和腦，在給藥結(jié)束后4 h含量到達峰值6.22 mg/kg。肝臟中，恩諾沙星在給藥結(jié)束后1 h藥物濃度到達峰值12.37 mg/kg，高于其他組織，之后在24 h內(nèi)恩諾沙星濃度迅速下降但仍保持一個較高的濃度水平，達到3.0 mg/kg以上。腎臟中的恩諾沙星濃度達峰時間較其他組織晚，在6 h到達峰值7.82 mg/kg，6 h之后組織中藥物濃度下降速率也比其他組織平緩，且之后各時間點的濃度均高于其他組織。

圖1 單次口灌10 mg/kg恩諾沙星乳在羅非魚各組織的藥-時曲線

羅非魚單次口灌10 mg/kg 恩諾沙星乳后，各組織中恩諾沙星的消除方程及參數(shù)見表3。各組織中恩諾沙星的消除半衰期T1/2為腎﹥腦﹥肌肉﹥肝、藥物平均駐留時間MRT為腎﹥腦﹥肝﹥肌肉、藥時曲線下面積AUC為腎﹥肝﹥肌肉﹥腦。

表3 羅非魚單次口灌恩諾沙星乳后各組織的消除方程及參數(shù)

2.4 環(huán)丙沙星在羅非魚體內(nèi)的分布

通過檢測環(huán)丙沙星和恩諾沙星在羅非魚體內(nèi)的含量，對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析發(fā)現(xiàn)，血漿中環(huán)丙沙星占恩諾沙星的百分比約為4.68%、肌肉中約為3.97%、肝臟中約為6.03%、腎臟中約為3.22%。環(huán)丙沙星在血漿、肌肉、肝和腎中有檢出，Tmax分別為8、6、4和6 h，Cmax分別為0.1 mg/L、0.39、0.15和0.23 mg/kg(見圖2)。單劑量10 mg/kg口灌恩諾沙星后，其主要代謝物環(huán)丙沙星在羅非魚各組織的分布為肝﹥腎﹥肌肉﹥血漿，與恩諾沙星在羅非魚各組織中的分布情況一致。給藥后168 h，血漿和肌肉中的環(huán)丙沙星下降到0.01 mg/kg以下，肝臟和腎臟中的環(huán)丙沙星下降到0.02 mg/kg以下。

圖2 單次口灌10 mg/kg恩諾沙星乳后環(huán)丙沙星在羅非魚體內(nèi)的分布

羅非魚單次口灌10 mg/kg 恩諾沙星乳后，其主要代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星的消除方程及參數(shù)見表4。各組織中環(huán)丙沙星的消除半衰期T1/2為腎﹥肝﹥肌肉、藥物平均駐留時間MRT為肝﹥腎﹥肌肉、藥時曲線下面積AUC為腎﹥肝﹥肌肉。

表4 單次口灌后羅非魚各組織環(huán)丙沙星的消除方程及參數(shù)

3 討論

3.1 恩諾沙星乳在羅非魚體內(nèi)的代謝規(guī)律

本實驗條件下，恩諾沙星在羅非魚血漿、肌肉、肝臟、腎臟和腦的Tmax分別為2、4、1、6和2 h，Cmax分別為4.38、6.22、12.37、7.82和4.31 mg/kg，AUC為106.11(mg/L)·h、159.02、250.42、392.71和103.14(mg/kg)·h。研究顯示，單劑量口服或口灌10 mg/kg恩諾沙星，鯽血漿在0.5 h的Cmax為3.55 mg/L[11]；大黃魚血漿在7.67 h的Cmax為3.59 mg/L[12]。恩諾沙星乳在羅非魚血漿中的藥物峰濃度均高于鯽和大黃魚，羅非魚對恩諾沙星的吸收速度比大黃魚快，比鯽慢。恩諾沙星在羅非魚肝臟中最快達到藥物峰濃度，且峰濃度最高，這可能是由于肝臟中含有多種藥物代謝酶，是魚類藥物和毒物代謝的最主要器官。恩諾沙星在羅非魚腎臟中消除最慢、T1/2和MRT最長、AUC最大，藥物濃度在到達峰值之后就一直高于其他組織，恩諾沙星總吸收量最高，這是因為在恩諾沙星不斷經(jīng)過腎臟隨著尿液排出的過程，其他組織中的一部分恩諾沙星會被運輸?shù)侥I臟，從而導(dǎo)致恩諾沙星在腎臟中的蓄積。由此可見，肝臟和腎臟是羅非魚代謝恩諾沙星的主要器官，對于恩諾沙星在羅非魚體內(nèi)的代謝和消除具有重要作用。恩諾沙星在腦組織中總吸收量較低，但T1/2和MRT都比較長，說明其在腦組織比在其他組織難代謝和消除，這可能是因為腦作為一個高度分化的器官，其中代謝藥物的酶較少。

3.2 恩諾沙星的主要代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星在羅非魚體內(nèi)的代謝規(guī)律

恩諾沙星在魚體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物是環(huán)丙沙星，環(huán)丙沙星在羅非魚血漿、肌肉、肝臟和腎臟的Tmax為8、6、4和6 h，Cmax為0.1 mg/L、0.39、0.15和0.23 mg/kg，AUC為5.35(mg/L)·h、6.5、14.99和15.83(mg/kg)·h。由數(shù)據(jù)可知，環(huán)丙沙星在血漿中的吸收和消除都比恩諾沙星慢，且濃度遠低于恩諾沙星。在水產(chǎn)動物體內(nèi)，大部分恩諾沙星都以原藥形式代謝出體外[13]。本實驗中環(huán)丙沙星在羅非魚血漿、肌肉、肝和腎中含量占恩諾沙星的比例分別為4.68%、3.97%、6.03%、3.22%，說明恩諾沙星在羅非魚體內(nèi)很少代謝。肝臟中環(huán)丙沙星含量最高，一方面是因為羅非魚給藥后恩諾沙星肝臟中的濃度最高，另一方面也說明恩諾沙星主要在肝臟中脫乙基代謝成環(huán)丙沙星，這與大部分水產(chǎn)動物體內(nèi)恩諾沙星的代謝規(guī)律相一致[14,15]。在腦組織中未檢測到環(huán)丙沙星，說明腦組織基本不代謝恩諾沙星。環(huán)丙沙星在羅非魚的肝、腎和肌肉組織中的T1/2和MRT都較大，表明環(huán)丙沙星在羅非魚各組織的消除普遍較慢，滯留時間長。除此之外，各組織的環(huán)丙沙星在達峰時間之后都兩次或多次出現(xiàn)含量降低、升高再降低的現(xiàn)象。這可能是由于恩諾沙星代謝環(huán)丙沙星后的肝腸循環(huán)產(chǎn)生的，魚體中將恩諾沙星代謝成環(huán)丙沙星的主要器官是肝臟，恩諾沙星脫乙基后形成的環(huán)丙沙星由肝臟排出后進入腸道，組織對其產(chǎn)生了代謝后的再吸收。恩諾沙星和環(huán)丙沙星兩種藥物的雙重代謝，造成了峰值時間后環(huán)丙沙星藥物濃度的波動，在很多水產(chǎn)動物中，環(huán)丙沙星都呈現(xiàn)出這一規(guī)律[16-18]。

3.3 恩諾沙星乳的優(yōu)越性

本研究所用的恩諾沙星乳新劑型，具有溶解度好、易吸收、抗菌活性強、與普通的恩諾沙星粉劑相比，其抑菌作用提升了1倍[19]。有研究表明，羅非魚單次口灌40 mg/kg魚體重恩諾沙星普通劑型，血漿中恩諾沙星在1 h的Cmax為3.47 mg/L[7]。本研究中，羅非魚單次口灌10 mg/kg魚體重恩諾沙星乳后，2 h的Cmax為4.38 mg/L，給藥濃度是上述研究的四分之一，血藥濃度峰值卻高于3.47 mg/L，說明恩諾沙星乳新劑型促進了羅非魚對藥物的吸收，提高了生物利用度。封琦等[20]的研究也指出同一藥物不同劑型在同一物種中的藥代動力學(xué)特征也會有所不同。恩諾沙星乳納米粒子粒徑為納米級，納米粒子的重要特征是具有靶向作用，能夠突破血腦屏障進入腦組織發(fā)揮作用[21]。由于血腦屏障的作用，所有大分子藥物和98%的小分子藥物都不能進入腦組織，很多神經(jīng)性疾病不能被有效治療[22]。據(jù)報道，β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物中的第三、四代頭孢類菌素藥物的血腦屏障通透率僅為5%～15%[23]；羅非魚單次口灌10 mg/kg 恩諾沙星乳后，恩諾沙星在腦組織和血漿中的分布見圖1，藥物峰濃度分別為4.31 mg/kg 和4.38 mg/L，兩者濃度差異不大，證實了恩諾沙星乳具有極高的血腦屏障透過性，完全突破了血腦屏障，可用于治療魚類中樞神經(jīng)系統(tǒng)因細菌感染的疾病。

3.4 恩諾沙星乳的給藥方案探討

恩諾沙星對大多數(shù)水產(chǎn)動物致病病原菌的MIC均較小，如鏈球菌屬(0.25～0.45 mg/L)[24]。根據(jù)邴曉菲等[25]以及曾蘇[26]的研究，Cmax/MIC﹥8時，臨床有效率可達90%。本實驗中血漿中的恩諾沙星的Cmax=4.38 mg/L，腦組織中的Cmax=4.31 mg/L，其他組織的藥物濃度均大于血漿和腦組織，可以滿足絕大部分的水產(chǎn)動物疾病的治療需要。以10 mg/kg單次給藥恩諾沙星乳后，對MIC較高的鏈球菌(0.45 mg/L)，血漿及各組織中有效藥物濃度維持時間都在24 h以上。因此，對恩諾沙星敏感的病原菌所引起的疾病，可考慮單次給藥10 mg/kg恩諾沙星乳，1日給藥一次，連續(xù)給藥3日。