謝斯玉，譚曉凝，田佳緣，霍慶秀，楊 琨,2,3*

（1.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生物醫(yī)學研究中心/甘肅省動物細胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學 生物醫(yī)學研究中心/生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030）

藏羊又稱藏系羊[1]，發(fā)育成熟晚，主要分布于青藏高原，主要產(chǎn)區(qū)在青海。因其耐高寒、耐干旱、喜濕冷等習性，相比于綿羊更適合高原低氧環(huán)境而成為西北牧民的主要飼養(yǎng)畜種。此次試驗根據(jù)藏羊自身耐缺氧的特點開展相關(guān)研究。

在適應性低氧反應的調(diào)控因子中，本試驗所研究的低氧誘導因子家族（HIFs）是不可或缺的一類[2]。在1997年HIF-2α被Tian等[3]克隆出來，前期各種研究表明其mRNA幾乎僅在內(nèi)皮細胞中表達，因此又稱為“內(nèi)皮PAS蛋白1（endothelial PAS domain protein 1，EPAS1）”。HIF-2α和HIF-1α的結(jié)構(gòu)相差不大，屬于異源二聚體，分別由功能型亞基HIF-2α和結(jié)構(gòu)型亞基HIF-1β所組成。HIF-2α的N端具有能與DNA結(jié)合的basic Helix-Loop-Helix（bHLH）結(jié)構(gòu)域和Per-Art-Ser（PAS）結(jié)構(gòu)域，肺血管對急性和慢性低氧做出反應極其重要的結(jié)構(gòu)域是在其C端含有的轉(zhuǎn)錄激活作用的反式活化結(jié)構(gòu)域[4]，HIF-2α能調(diào)控血管再生，促進細胞增殖，還具有加快血細胞成熟、肺血管發(fā)育等功能[5,6]。在藏羊的肺臟器官中為了提高其細胞對高原低氧的適應性而增加HIF-2α在肺臟的含量，從而使ATP產(chǎn)能增加，減少氧化物產(chǎn)量[7]，進而達到預期效果。本次研究以藏羊的肺臟為試驗材料，檢測HIF-2α蛋白在藏羊肺臟中的表達分布情況。

1 材料與方法

1.1 材料采集

所有健康藏羊來自臨夏回族自治州屠宰場，其肺臟組織均在藏羊放血后用4%的多聚甲醛及時固定采集。

1.2 材料處理

將藏羊的肺臟組織（長、寬均為1 cm左右，厚度不超過5 mm的小塊）進行石蠟包埋，染色方法按具體試驗步驟進行。

1.3 試驗試劑

所用試劑均購自于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，主要有HIF-2α兔多克隆抗體（bs-1447R）、SP試劑盒（兔）（SP-0023）、DAB染色試劑盒（C02-04001）。

1.4 HE染色法

取大約1 cm3的肺臟組織制成石蠟切片（厚4～5 μm），切片進行HE染色觀察藏羊肺臟組織結(jié)構(gòu)的完整性及結(jié)構(gòu)特點。

1.5 免疫組織化學方法檢測

將HIF-2α兔多克隆抗體作為HIF-2α抗體，抗體的稀釋比例為1∶100，當組織切片加入一抗后，需要在37℃環(huán)境下孵育2～3 h。使用免疫組織化學染色方法檢測，根據(jù)試劑盒說明書進行具體操作。

1.6 結(jié)果判定

免疫組織化學染色結(jié)果有3種，即強陽性表達（顯色結(jié)果為深棕色）、弱陽性表達（顯色結(jié)果為黃棕色）、陰性表達（顯色結(jié)果為棕黃色）。

2 結(jié)果

2.1 藏羊肺臟的組織學結(jié)構(gòu)

藏羊肺臟HE染色結(jié)果如圖1所示。對HE染色的肺臟組織切片并展開了組織學觀察，肺泡在單位面積中數(shù)量多且較小，肺泡壁較厚，由扁平細胞和分泌細胞圍成肺泡腔。肺泡膈較厚，其內(nèi)的毛細血管均呈擴張狀態(tài)。

圖1 藏羊肺臟組織切片HE染色法觀察結(jié)果

2.2 免疫組織化學方法檢測HIF-2α蛋白表達

藏羊HIF-2α蛋白免疫組化染色如圖2所示，在藏羊肺臟組織中，免疫組化染色結(jié)果顯示HIF-2α蛋白在終末支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞中的表達高于肌細胞等結(jié)構(gòu)中的表達，為強陽性表達，在肺泡隔間充質(zhì)細胞可見少量表達。I型細胞中HIF-2α的表達少于肺泡Ⅱ型細胞。

圖2 藏羊肺臟組織切片免疫組化觀察結(jié)果

3 討論

藏羊已在形態(tài)和生理上適應了高原的缺氧環(huán)境，其肺組織單位面積中不僅肺泡數(shù)量多，血管數(shù)量也多，毛細血管內(nèi)的紅細胞數(shù)量也有隨著海拔高度升高而增加的趨勢，這些都有利于增加肺通氣量和肺血流量，從而提高藏羊肺臟的肺泡通氣量，并加快肺臟中的血氧運輸速度。藏羊在低氧環(huán)境下肺氣體交換率的改變都是基于這些特征，這些適應性變化為藏羊維持體循環(huán)和肺循環(huán)的正常功能提供了生理條件基礎(chǔ)[8,9]。

氧氣是調(diào)節(jié)HIF-2α表達的關(guān)鍵因素。Talks[10]等研究表明，正常氧濃度下除了巨噬細胞外的健康細胞基本檢測不到HIF-2α的表達外，通過低氧處理后健康未受損的細胞內(nèi)可以發(fā)現(xiàn)HIF-2α的表達幾乎都顯著增多。Raghavan等[11]在HPASMCs模型的鉆研中得到低氧下肺動脈平滑肌細胞是增殖的，這就是HIF-2α在低氧情況下通過誘導Forkhead Box M1而產(chǎn)生的效果。Cowburn等[12]發(fā)現(xiàn)通過HIF-2α能增強下游靶基因Arginase-1的表達，從而引起肺血管重塑和肺動脈高壓，表明慢性低氧增加了HIF-2α的穩(wěn)定性。低氧能夠增強HIF-2α在藏羊肺臟中的表達效果，影響藏羊的肺功能，從而推測其是藏羊能在高原低氧環(huán)境下生存的重要影響因素。

4 結(jié)論

藏羊肺臟在肌細胞等結(jié)構(gòu)的表達程度遠低于肺泡導管、終末支氣管上皮細胞和Ⅱ型肺泡細胞的表達程度。