陳善義 陳義強

摘 要：為明確不同醇化方式的片煙細菌群落結構差異，以3個等級的片煙為材料，采用氣調(diào)醇化和自然醇化2種方式進行倉儲養(yǎng)護，以初始樣為對照，利用MiSeq高通量測序?qū)?種醇化方式的片煙細菌群落結構進行分析。結果表明，醇化3年后，2種醇化方式片煙中細菌的多樣性水平降低，且氣調(diào)醇化法低于自然醇化法;據(jù)非度量多維尺度分析，2種醇化方式的樣品能明顯地區(qū)分開來;甲基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬占比在醇化過程中呈下降之勢，在2種醇化方式之間的差異不顯著;鹽單胞菌屬占比呈上升之勢，且氣調(diào)醇化顯著高于自然醇化。

關鍵詞：微生物區(qū)系;煙草;倉儲養(yǎng)護;氣調(diào)醇化;自然醇化

中圖分類號 TS441文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2021）11-0051-02

片煙的醇化是指在一定條件下，通過煙葉自身的微生物作用、酶的催化和氧化作用，使煙葉中一些不利于吸食品質(zhì)的化學物質(zhì)轉化為對感官質(zhì)量有利的物質(zhì)，達到提高煙葉使用價值的過程。片煙的倉儲醇化主要有2種方法：自然醇化法和氣調(diào)醇化法。自然醇化法操作簡便，成本低。但在實踐中存在片煙易于發(fā)生霉變和蟲蛀等現(xiàn)象，以及醇化周期不易調(diào)控、質(zhì)量最佳狀態(tài)保持時間較短等不足之處。氣調(diào)醇化法是在密封環(huán)境下，通過人工調(diào)控氧氣的含量，達到防霉、殺蟲、延長片煙儲存品質(zhì)時間的目的。對2種醇化方式差異的研究，目前主要集中在外觀質(zhì)量、感官質(zhì)量和常規(guī)化學成分、pH方面[1-4]。陳善義等[5]研究了氣調(diào)醇化過程中片煙細菌群落結構變化規(guī)律，但關于2種醇化方法片煙細菌區(qū)系差異的研究尚不多見。為此，本研究利用MiSeq高通量測序技術分析氣調(diào)醇化和自然醇化的片煙細菌群落結構的差異，旨在為片煙氣調(diào)養(yǎng)護的優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗片煙樣品產(chǎn)地為貴州（代號GZ）、福建（代號FJ）、河南（代號HN）。片煙于廈門東孚煙葉倉庫（倉庫環(huán)境年平均氣溫和相對濕度分別為25℃和58%）采用氣調(diào)醇化和自然醇化2種方式進行倉儲養(yǎng)護。片煙入庫后立即取樣作為初始樣（代號為O）。氣調(diào)醇化的操作按《片煙貯存養(yǎng)護氣調(diào)貯存法》YC/T 322—2018[6]相關要求進行。自然醇化則將片煙按200Kg/箱的規(guī)格進行裝箱打包后，于片煙倉庫中自然條件下醇化。醇化3年后分別取樣（氣調(diào)醇化代號為A，自然醇化代號為N）。

1.2 試驗方法 樣品基因組DNA的提取、PCR擴增、MiSeq測序、數(shù)據(jù)處理與分析參考包可翔等[7]及陳善義等[5]的研究。

2 結果與分析

2.1 細菌物種的多樣性 由表1可知，氣調(diào)醇化3年的樣品Chao值小于初始樣及自然醇化3年的樣品，表明氣調(diào)醇化3年后的樣品細菌物種豐富度最小;樣品Shannon指數(shù)均值大小排列為初始樣>自然醇化（3年）>氣調(diào)醇化（3年），且三者之間的差異極顯著，這說明醇化3年后的片煙細菌物種多樣性低于初始水平，且氣調(diào)醇化法醇化的片煙細菌多樣性水平最低。

2.2 屬水平細菌群落的結構差異 由圖1可知，初始樣、氣調(diào)及自然醇化法醇化后3年的片煙表面的細菌菌群，主要由甲基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、Aureimonas、假單胞菌屬、大腸志賀氏桿菌、葡萄球菌屬、鹽單胞菌屬組成。甲基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬占比在醇化3年后的樣品中顯著低于初始樣，而在自然醇化和氣調(diào)醇化樣品之間的差異不顯著;鹽單胞菌屬占比在初始樣、自然醇化及氣調(diào)醇化后3年的樣品中差異極顯著，其占比排列為氣調(diào)醇化（3年）>自然醇化（3年）>初始樣（表2）。這說明在屬分類水平上，相較于初始樣而言，醇化3年后片煙的細菌群落結構發(fā)生了巨大的變化，表現(xiàn)為：甲基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬占比顯著下降;而鹽單胞菌屬占比顯著提高，且氣調(diào)醇化其菌群占比顯著高于自然醇化。

2.3 NMDS分析 非度量多維尺度（Nonmetric Multidimensional Scaling，NMDS）分析通過描述樣品間的距離遠近關系，進一步說明了樣品間細菌群落結構的相似性和差異性。由圖2可知，同一種處理的樣品在NMDS二維圖上距離較近（除初始樣的HN-O樣品之外），不同處理的樣品距離較遠，這說明片煙細菌群落結構在不同處理間差異大于同一處理內(nèi)樣品之間的差異;此外，自然醇化3年后和氣調(diào)醇化3年后的樣品與初始樣的樣品距離較大，說明醇化3年后，片煙細菌的群落結構相較于初始樣變化較大。

3 討論

利用MiSeq高通量測序分析了氣調(diào)醇化及自然醇化3年后的片煙與初始樣中細菌的物種多樣性和群落結構差異，發(fā)現(xiàn)醇化3年后的片煙細菌物種豐富性和多樣性水平降低，這與伍雪瑩等[8]、楊金奎等[9]對陳化烤煙微生物的變化研究結果一致。周家喜等[10]對煙葉陳化過程細菌群落演替特征的研究中發(fā)現(xiàn)，甲基桿菌屬的豐度隨醇化過程的進行呈下降之勢，鞘氨醇單胞菌屬則呈上升之勢，而本研究發(fā)現(xiàn)上述2個菌屬占比均低于初始水平。造成這一差異的可能的原因是周家喜等[10]的研究主要關注醇化24個月以內(nèi)的時期，而本研究關注醇化36個月后的細菌區(qū)系。本研究發(fā)現(xiàn)，醇化3年后，2種醇化方式片煙細菌群落結構的差異主要表現(xiàn)在鹽單胞菌屬的占比上。鹽單胞菌屬屬于鹽單胞菌科，是一類能在絕對鹽度（NaCl）為0～32%條件下生長的耐鹽細菌[11]。醇化較久的煙葉，是否在微生物的代謝過程中生成一些鹽類物質(zhì)尚不清楚。鹽單胞菌屬在煙葉醇化過程中的作用，以及不同醇化方式的片煙有關鹽類物質(zhì)含量的差異有待進一步的研究。

4 結論

片煙在醇化過程中，細菌群落結構發(fā)生了顯著的變化，甲基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬占比下降，鹽單胞菌屬占比上升;自然醇化和氣調(diào)醇化片煙細菌的群落結構差異主要表現(xiàn)在鹽單胞菌屬占比上，且氣調(diào)醇化高于自然醇化。

參考文獻

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（責編：王慧晴）