液相阻斷ELISA 在口蹄疫抗體檢測(cè)中的應(yīng)用

陶天宇 李道勇

（1，安徽省宣城市郎溪縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局動(dòng)物疫控中心 241000；2，華益藥業(yè)科技(安徽) 有限公司 230000）

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒(FMDV) 引起的，在偶蹄動(dòng)物之間傳染的烈性傳染病，以牛、豬最易感，羊、駱駝、象等均有累計(jì)發(fā)病報(bào)告。該病分為O 型、A 型、C 型、南非I 型、亞洲I 型等7 種血清型，其中以O(shè) 型和A 型分布最廣，危害最大。是農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的一類動(dòng)物傳染病。當(dāng)養(yǎng)殖羊患有口蹄疫病時(shí)，其口蹄部出現(xiàn)大量水泡，水泡出現(xiàn)后2～3d 開始潰爛，并導(dǎo)致周圍組織化膿?；疾⊙蛱悴砍霈F(xiàn)站立不穩(wěn)、打顫、行走姿態(tài)異常等現(xiàn)象，口部有黏稠性涎流出，流淌速度較慢呈淡青色，與正常反芻流涎略有差別。同時(shí)，病羊出現(xiàn)食欲下降、急躁等情況。

本次試驗(yàn)主要采取液相阻斷ELISA 法追蹤檢測(cè)郎溪某羊羊牲畜養(yǎng)殖家庭農(nóng)場(chǎng)養(yǎng)殖的湖羊O 型口蹄疫免疫抗體滴度。通過(guò)利用口蹄疫病毒O 型抗體會(huì)與包被板上的重組抗原和抗羊二抗酶標(biāo)結(jié)合物特異性結(jié)合，以及抗羊二抗酶標(biāo)結(jié)合物底物反應(yīng)顯色原理反映出待測(cè)血清中口蹄疫病毒O 型抗體情況[1]。為監(jiān)管基層國(guó)家強(qiáng)制免疫計(jì)劃工作開展，保證養(yǎng)殖場(chǎng)健康發(fā)展提供堅(jiān)實(shí)數(shù)據(jù)支撐，現(xiàn)將檢測(cè)應(yīng)用報(bào)告情況匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)樣品

郎溪縣某羊羊牲畜養(yǎng)殖家庭農(nóng)場(chǎng)湖羊群經(jīng)口蹄疫O 型滅活疫苗（JYBL-2014-5-21）免疫的湖羊血清樣本214 份。

1.2 試驗(yàn)器材

波長(zhǎng)450nm 和630nm 酶標(biāo)儀、37℃恒溫箱；1～10μl 移液器，10.0～100.0μl 移液器和100.0～1000.0μl12 道移液器若干；配套移液器尖若干；移液槽若干；吸水紙若干；1000ml 量筒一個(gè)，1000ml 燒瓶2 個(gè)；此次檢測(cè)試劑盒系采用中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)的改進(jìn)型O 型口蹄疫液相阻斷ELISA 檢測(cè)試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：20200109134，抗原批號(hào)：101/24）。

1.3 試驗(yàn)步驟

1.3.1 羊群免疫

使用口蹄疫O 型滅活疫苗，按照產(chǎn)品使用說(shuō)明規(guī)定免疫劑量及免疫方法對(duì)該湖羊養(yǎng)殖家庭農(nóng)場(chǎng)羊群接種免疫，于2 免24d 后采血，并進(jìn)行免疫效果檢測(cè)[2]。

1.3.2 洗滌液準(zhǔn)備

用蒸餾水或去離子水按1：10 稀釋洗滌液（如取100ml 洗滌液，需要900ml 蒸餾水或去離子水稀釋），充分混勻后備用。

1.3.3 樣品稀釋和加樣

用樣品稀釋液將待測(cè)血清按1：100 稀釋（可用試劑盒中血清稀釋板進(jìn)行稀釋，或可直接吸取血清按比例稀釋后振蕩30s）。將包被板樣品孔每孔先注入1μl 待測(cè)血清，再注入99μl樣品稀釋液。陰性和陽(yáng)性對(duì)照孔不稀釋，陰性對(duì)照孔每孔加入100μl 陰性對(duì)照品；陽(yáng)性對(duì)照孔每孔加入100μl 陽(yáng)性對(duì)照品。空白對(duì)照孔2 孔，每孔加入100μl 樣品稀釋液。全部加樣完成后，用振蕩器振蕩30s。蓋好封板膜，37℃避光恒溫箱反應(yīng)30min（詳見表1）。

1.3.4 包被板洗滌

揭開封板膜，甩去孔內(nèi)液體。排槍注滿配置好的洗滌液（約300μl），滯留1min 后甩去。重復(fù)洗滌3 次，最后一次甩凈，在吸水紙上拍干。

1.3.5 加酶反應(yīng)

除空白對(duì)照孔外，其余每孔加入酶標(biāo)結(jié)合物50μl，蓋好封板膜，37℃避光恒溫箱反應(yīng)30min。

1.3.6 包被板洗滌

揭開封板膜，甩去孔內(nèi)液體。排槍注滿配置好的洗滌液（約300μl），滯留1min 后甩去。重復(fù)洗滌3 次，最后一次甩凈，在吸水紙上拍干。

1.3.7 顯色反應(yīng)

按照一板96 孔用量，取底色液5ml 和顯色液5ml 充分混合，每孔加入100μl，蓋好封板膜，37℃避光恒溫箱反應(yīng)10min。

1.3.8 終止反應(yīng)

取出包被板，揭開封板膜，每孔加入50μl 終止液。以空白對(duì)照孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀于450nm 讀取OD 值[3]。

2 參考值設(shè)定和讀數(shù)結(jié)果

2.1 有效性判定

陰性對(duì)照孔OD 值≤0.15 則實(shí)驗(yàn)有效，反之無(wú)效；陽(yáng)性對(duì)照孔OD 值≥0.5 則試驗(yàn)有效，反之無(wú)效。

2.2 Cut—off 值

Cut-off 值（Cov）=陰性對(duì)照孔平均OD 值×2.1（陰性對(duì)照孔OD 值小于0.08 的，按0.08 計(jì)）。樣品OD 值≥Cov 的，判斷口蹄疫病毒O 型抗體陽(yáng)性；樣品OD 值≤Cov 的，判斷口蹄疫病毒O 型抗體陰性。

2.3 讀數(shù)結(jié)果

本次試驗(yàn)共使用3 塊ELISA 板，每板2 個(gè)陰性對(duì)照孔OD值均小于0.15，3 塊ELISA 板試驗(yàn)結(jié)果均有效。計(jì)算出1 號(hào)板Cov 值為0.168，抗體陽(yáng)性孔數(shù)88 個(gè)，抗體陰性孔數(shù)2 個(gè)，合格率97.7%；2 號(hào)板Cov 值0.187，抗體陽(yáng)性孔數(shù)86 個(gè)，抗體陰性孔數(shù)4 個(gè)，合格率95.5%；3 號(hào)板Cov 值0.178，抗體陽(yáng)性孔數(shù)34 個(gè)，抗體陰性孔數(shù)0 個(gè)，合格率100%（詳見表2）。

表2 3 塊ELISA 板抗體陽(yáng)性情況統(tǒng)計(jì)

3 討論

在獸醫(yī)臨床血清學(xué)檢測(cè)上，正向間接凝血試驗(yàn)、固相阻斷ELISA 和液相阻斷ELSIA 都是常用的疫苗抗體效價(jià)檢測(cè)方法。但液相阻斷ELISA 具有敏感性良好，特異性較高，重復(fù)性優(yōu)良，檢測(cè)速度更快等優(yōu)勢(shì)，因此，在檢測(cè)大批量樣本時(shí)通常表現(xiàn)出良好的適用性，可以更準(zhǔn)確地評(píng)估疫苗免疫效能。

本試驗(yàn)為某羊羊牲畜養(yǎng)殖家庭農(nóng)場(chǎng)所使用代號(hào)JYBL-2014-5-21 的口蹄疫O 型滅活疫苗抗體效價(jià)檢測(cè)提供了可靠的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，能有效指導(dǎo)該場(chǎng)口蹄疫防治工作，為本縣的O 型口蹄疫防控工作提供了堅(jiān)實(shí)的保障。

此次試驗(yàn)結(jié)果表明，抗體效價(jià)保護(hù)率為97.2%。