Cofilin在鴨腸炎病毒感染過程中的影響研究

張楊子 王璇 吳珇彤 潘淑惠 文正常 文明

（1，貴州省畜牧獸醫(yī)研究所 550001；2，貴州大學(xué) 550001）

鴨病毒性腸炎（DVE）指的是鴨腸炎病毒（DEV）引發(fā)的禽類急性、熱性、敗血性傳染疾病，以往在多個(gè)國(guó)家流行，其給養(yǎng)鴨業(yè)造成了相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。絲切蛋白（Cofilin）為一類低分子量肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白物質(zhì)，其廣泛存在于真核生物內(nèi)。Cofilin 具體的活性會(huì)受到諸多因素調(diào)節(jié)，體現(xiàn)出與之相關(guān)的作用。結(jié)合實(shí)際情況，本文全面探究Cofifilin 在鴨腸炎病毒感染過程中的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

試驗(yàn)應(yīng)用的受精鴨蛋購(gòu)買自某地養(yǎng)殖場(chǎng)。選擇國(guó)家動(dòng)物疫病研究室內(nèi)提供的鴨腸炎病毒G Z 株為病毒菌株。自中國(guó)上海吉瑪生物有限公司購(gòu)買pGPH1/GFP/Neo-shNC 表達(dá)質(zhì)粒。本試驗(yàn)所使用的試劑為胎牛血清、DMEM、胰蛋白酶、Penicillin streptomyin、Lipofectamine3000。試驗(yàn)所使用的主要儀器：倒置型熒光相差顯微鏡及與之相關(guān)成像系統(tǒng)、孵化機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 Cofilin-shRNA 提取

首先，依照測(cè)序得出的鴨源的-Cofilin2 基因全序列，應(yīng)用在線軟件，選擇鴨源Cofilin2RNA 的相關(guān)干擾性靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)出相關(guān)干擾序列，送到中國(guó)上海吉瑪生物有限公司完成合成工作。在shRNA 模板內(nèi)的loop 結(jié)構(gòu)擇取TTCAAGAGA，以防止生成終止性信號(hào)，運(yùn)用T6 結(jié)構(gòu)為RNA 轉(zhuǎn)錄終止序列。并于正義鏈模板5’ 端增添CACC，保證其和BbsI 酶切后生成粘端互補(bǔ)。并在反義鏈5’ 端增加GATC。若siRNA 首個(gè)堿基并非G，有必要于CACC 后增加G。同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照小組。然后，試驗(yàn)應(yīng)用ddH2O，把已經(jīng)合成完畢的寡聚單鏈DNA 溶解為100μm/L。在互補(bǔ)型單鏈之內(nèi)分別取用5μl，雙雙混合，并加入共計(jì)2μl 的10×oilgo annealing buffer。加入純凈水，直至20μl為止。此后把以上物質(zhì)加熱到95℃，共計(jì)5min。室溫冷卻，最終生成雙鏈樣DNA，此后稀釋為10nM/L 的溶液。依照相關(guān)次序，分 別加5×ligation buffer、pGPH1/GFP/Neo、ds-oligo 及T4DNAliase。加入純凈水，直至20μl，并在室溫環(huán)境下放置0.5h。最后，選擇10μl 的連接產(chǎn)物，全面轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α。將其涂抹在含有壯觀霉素的LB 平板中，將其放入37℃環(huán)境下過夜。將單克隆菌落接種在內(nèi)含壯觀霉素LB 培養(yǎng)基內(nèi)恒溫過夜，提取質(zhì)粒。將其送到有資質(zhì)公司內(nèi)完成測(cè)序工作。

1.2.2 Cofilin-shRNA 相關(guān)篩選

首先，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DEF 原代細(xì)胞，具體為提取重組質(zhì)粒、制備DEF 原代細(xì)胞及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。然后在轉(zhuǎn)染24h 后應(yīng)用顯微鏡查看GFP 表達(dá)詳情及細(xì)胞生長(zhǎng)詳情。目的在于實(shí)施miRNA 的篩選工作。最后，應(yīng)用FQ-PCR 測(cè)定細(xì)胞Cofifilin 基因轉(zhuǎn)錄水平。在轉(zhuǎn)染完畢24 h 后收集好細(xì)胞，并提取總RNA后開展反轉(zhuǎn)錄工作，制作成cDNA，實(shí)施CofifilinFQPCR 測(cè)定出共計(jì)4 小對(duì)miRNA 的影響效果詳情。

2 結(jié)果

2.1 Cofilin-shRNA 染色表達(dá)結(jié)果

培養(yǎng)所得的DEF 細(xì)胞表現(xiàn)為單層后，實(shí)施轉(zhuǎn)染RNA 對(duì)質(zhì)粒加以干擾。24h 內(nèi)查看重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染詳情。結(jié)果表明細(xì)胞生長(zhǎng)滿意，因重組質(zhì)粒內(nèi)包含GFP 基因，所以被轉(zhuǎn)入細(xì)胞顯示出綠色熒光，證實(shí)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒試驗(yàn)成功。

2.2 Cofilin-shRNA 影響觀察結(jié)果

每個(gè)小組均可以測(cè)得Cofilin 基因。空白組Cofilin 水平峰值為1。陰性組實(shí)際含量水平高于質(zhì)粒小組，但比空白組低。轉(zhuǎn)染后重組質(zhì)粒Cofilin-shRNA-304 及86 后細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平比空白小組低。Cofilin-shRNA451、247 細(xì)胞的Cofilin 轉(zhuǎn)錄水平比空白組低，但并不明顯。在此其中Cofilin-shRNA86 經(jīng)處理后細(xì)胞內(nèi)部Cofilin 轉(zhuǎn)錄量最小，其沉默效果峰值達(dá)到54.03%，表示其針對(duì)于細(xì)胞的Cofifilin 沉默效果最為優(yōu)秀，可以供給后續(xù)試驗(yàn)應(yīng)用。

2.3 Cofilin-shRNA 干擾下DEV 增值動(dòng)態(tài)詳情

轉(zhuǎn)染處理后RNA 干擾質(zhì)粒后相關(guān)時(shí)間段內(nèi)Cofilin mRNA檢測(cè)結(jié)果，見表1。轉(zhuǎn)染靶向miRNA 后感染DEV 動(dòng)態(tài)性測(cè)定DEV 核酸水平，見表2。

表1 轉(zhuǎn)染處理后RNA 干擾質(zhì)粒后相關(guān)時(shí)間段內(nèi)Cofilin

表2 轉(zhuǎn)染靶向miRNA 后感染DEV 動(dòng)態(tài)性測(cè)定DEV 核酸水平

3 討論與結(jié)論

就Cofilin 具體功能分析，Cofilin 能和肌動(dòng)蛋白絲及肌動(dòng)蛋白單體相互結(jié)合體現(xiàn)出作用[2]。其于細(xì)胞中結(jié)合肌動(dòng)蛋白絲主要通過內(nèi)部不穩(wěn)定性解聚加以實(shí)現(xiàn)。同時(shí)，其也能有效抑制肌動(dòng)蛋白單體聚合，加大激動(dòng)蛋白絲翻轉(zhuǎn)。相關(guān)調(diào)查表明，Cofilin 為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力調(diào)控過程中的重要因素之一，其能有效維持細(xì)胞極性和具體形態(tài)，加速胞質(zhì)分裂，促進(jìn)細(xì)胞游走及運(yùn)動(dòng)，參加到胚胎的血管新生、發(fā)育、器官形成和腫瘤轉(zhuǎn)移等功能中[3]。

在所有生物調(diào)節(jié)過程內(nèi)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控均顯得格外重要。應(yīng)用RNA 干擾技術(shù)能以特異性的方式抑制特定化基因表達(dá)，其屬于一類快捷且高效的分析基因功能工具。本組試驗(yàn)研究結(jié)果表明，通過熒光顯微鏡收集圖像分析，4 組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染且順利表達(dá)。

其中沉默率最高為Cofifilin-shRNA-86。86 對(duì)DEF 細(xì)胞轉(zhuǎn)染處理后48～120h 沉默效率在42.6%～56.2%之間。其在轉(zhuǎn)染DEF 細(xì)胞24h 后感染DEV，測(cè)定出DEV 在轉(zhuǎn)染后24～96h 過程中的核酸量比轉(zhuǎn)染DMEM 組更低。DEV 感染小組及正常小組各個(gè)組織Cofilin2 基因于相同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)錄變化一致性強(qiáng)。其在相同組織各個(gè)時(shí)間段轉(zhuǎn)錄改變沒有體現(xiàn)出規(guī)律。篩選獲取沉默效應(yīng)顯著的Cofilin shRNA-86。經(jīng)干擾宿主處理細(xì)胞Cofilin2 基因表達(dá)情況，表明其能達(dá)到促進(jìn)DEV 增殖的效果。