蘭 旭，鄧春青

甲型流感病毒(Influenza A virus，IAV)是一種有囊膜、分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，可使人、禽、豬、犬、馬和水貂等在內(nèi)的許多物種致病。根據(jù)血凝素(Hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase,NA)的差異可分為不同的亞型，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)18種 HA (H1～H18)和11種 NA (N1～N11)[1]。物種不同，流行的亞型不同。單就HA而言，禽中幾乎可以找到HA的所有類型(存在于蝙蝠中的H17和H18除外[1])；豬中主要流行H1、H2、H3[2]，同時(shí)也可見H4[2]、H6[3]和H9[4](局限于中國)等亞型；馬中主要流行H3和 H7等亞型[2]，H9[4]已出現(xiàn)；犬中以H3亞型為主，H1、H5、H6、H9和H10等亞型也已出現(xiàn)[3,5]；而海洋哺乳動(dòng)物曾分離到H1、H3、H4、H7、H10等亞型[2]。我國流行性感冒監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，目前感染人的甲型流感病毒主要為H1和H3亞型[6]。歷史上只有H1、H2和H3亞型與人類大流行有關(guān)，但H4～H7、H9～H11亞型已跨越物種屏障引起零星感染，其跨物種機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究[4,7-8]。值得注意的是，H3亞型現(xiàn)已在大多數(shù)物種中出現(xiàn)并逐漸流行，其宿主范圍最廣。由此可見，HA蛋白與病毒的宿主嗜性高度相關(guān)，這也是HA蛋白備受關(guān)注的原因之一。另外，HA蛋白作用于流感病毒生命周期的啟始，決定著病毒感染能否成功開啟，對(duì)病毒本身意義重大。自1952年流感成為第一個(gè)實(shí)行全球監(jiān)測(cè)的傳染病起[9]，流感病毒HA蛋白的監(jiān)測(cè)一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。隨著人們對(duì)HA蛋白認(rèn)識(shí)的不斷加深，抑制血凝素的藥物也一直在推陳出新。

1 形態(tài)結(jié)構(gòu)

HA蛋白是由基因組第4節(jié)段編碼的一種同源三聚體抗原蛋白，具有Ⅰ型跨膜糖蛋白結(jié)構(gòu)，其晶體結(jié)構(gòu)于1981年被Wilson IA等[10]所解析。在外觀形態(tài)上，HA蛋白可分為球形頭部和桿狀莖部。頭部主要由HA1肽鏈組成，內(nèi)含受體結(jié)合位點(diǎn)(Receptor binding site, RBS)和抗原位點(diǎn)(Antigenic site)。近年來，Zhu X等[11]認(rèn)為，近乎所有的HA(包括H17)具有相似的RBS：呈淺桶狀，邊緣由HA1 155和3個(gè)HA1結(jié)構(gòu)元素(190螺旋、130環(huán)和220環(huán))圍繞而成，底部由一些保守的芳香族殘基(Y98，W153，H183和Y195等)構(gòu)成。莖部靠近病毒囊膜，由HA1肽鏈的N、C末端及HA2肽鏈螺旋纏繞而成[12]。HA2蛋白C末端內(nèi)含疏水序列和棕櫚酸連接的質(zhì)膜定位序列，N末端內(nèi)含融合肽(Fusionpeptide，F(xiàn)P)[13]。RBS介導(dǎo)病毒與受體[唾液酸(sialic acid, SA)]特異性結(jié)合，通常人類流感病毒的RBS與SAα2, 6Gal結(jié)合，而禽流感病毒則與SAα2,3Gal結(jié)合；抗原位點(diǎn)可以刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體；而FP則與膜融合相關(guān)。

2 功能作用

過去的研究表明，流感病毒的RBS與SA特異性結(jié)合，隨后病毒粒子將通過網(wǎng)格蛋白和非網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用或大吞噬作用，以內(nèi)體(Endosome)的形式進(jìn)入宿主細(xì)胞，內(nèi)體中逐漸降低的pH值和逐漸升高的K+等信號(hào)將促進(jìn)病毒的膜融合與脫殼[14-15]。最近有學(xué)者提出，RBS與SA的多價(jià)連接以及NA對(duì)該連接的水解作用(即HA-NA-SA三者間的平衡)將實(shí)現(xiàn)病毒粒子的運(yùn)動(dòng)游走，最終使其到達(dá)指定地點(diǎn)并成功吸附[16]；而甲型流感病毒NA蛋白的第二唾液酸結(jié)合位點(diǎn)則是HA-NA-SA平衡的重要決定因素[17]。另外，通過平衡HA-NA功能可以提升病毒粒子的復(fù)制功能，從而產(chǎn)生高增長的病毒毒株H7N9 CVV[18]。Wang Z等[19]也發(fā)現(xiàn)，HA1中某一氨基酸替換(G225E)將導(dǎo)致病毒復(fù)制更快，隨后證明這與它們的組裝和出芽效率不同相關(guān)。HA蛋白的功能作用已不再局限于病毒生命周期的“起始”，病毒生命周期的其他階段，例如：復(fù)制、組裝、出芽、釋放和游走等也與其相關(guān)。當(dāng)然，隨著對(duì)HA蛋白認(rèn)識(shí)的不斷加深，一些未知功能仍有待進(jìn)一步探索。

3 變異進(jìn)化

由于宿主內(nèi)環(huán)境的選擇壓力和病毒自身特性等因素的影響，HA蛋白遺傳信息容易發(fā)生改變。個(gè)別點(diǎn)突變導(dǎo)致的抗原漂移，可引起流感的季節(jié)性流行，并決定著每年流感疫苗的組成成分。而點(diǎn)突變的積聚導(dǎo)致的抗原轉(zhuǎn)變，則可能促進(jìn)下一波流感大暴發(fā)。無論是流感病毒從一個(gè)宿主物種到另一個(gè)宿主物種的適應(yīng)，還是其免疫逃逸的產(chǎn)生，甚至是關(guān)于平衡功能尚不穩(wěn)定的HA-NA等，都與HA蛋白的變異進(jìn)化密不可分。

3.1 單一位點(diǎn)的變異 一般而言，HA蛋白的點(diǎn)突變多發(fā)生在抗原位點(diǎn)及其附近和RBS邊緣的殘基上。對(duì)于那些能夠穩(wěn)定保持著的替換趨勢(shì)，可能指示著病毒中的某些特定功能；而那些共有且保守的位點(diǎn)，則可被視作抗流感藥物研發(fā)的作用靶標(biāo)。HA蛋白的氨基酸位點(diǎn)變異具有多樣性。此外，病毒的亞型不同，相應(yīng)的位點(diǎn)變異存在差異。部分功能較為明確的氨基酸位點(diǎn)變異情況見表1。

表1 部分功能明確的HA蛋白氨基酸突變位點(diǎn)Tab.1 Partial functional mutations at amino acid sites in HA protein

在H1亞型中，D127E、S162T等替換可影響病毒的糖基化[24]；E190D[21]、D222G[24]、G225D[21]、R226Q[32]等替換是禽流感病毒為適應(yīng)人宿主而發(fā)生的適應(yīng)性改變(H3編號(hào))；D222G[24]、D225G[30]等可使病毒具有雙重受體特異性(H3編號(hào))；T200A[32]、D222G(H3編號(hào))[24]、D222N(H3編號(hào))[7,24]、G225E(H3編號(hào))[19]、E227A[33]等可增加病毒的致死率。李敏紅等[34]曾指出，存在D222G或D222N替換容易導(dǎo)致重癥(H3編號(hào))。

在H3亞型中，D81N[21]可影響糖基化；Y98F[11]降低受體結(jié)合力，但可能增加其游走性；N121K[25]、T135K[25]、H156Q[35]等與免疫相關(guān)；而W222R(H3編號(hào))[29]可影響病毒的感染力。另外，有學(xué)者曾指出[21]，為適應(yīng)人宿主，禽流感病毒的HA蛋白發(fā)生了R62I、D81N、N92K、A144G、N193S、Q226L、G228S等替換(H3編號(hào))。

在H5亞型中，126缺失[4]、T160A(H3編號(hào))[7]等影響糖基化；K58I(H7編號(hào))[20]、H103Y[20]、T315I[20]等替換可改變HA蛋白的穩(wěn)定性；A138S[21]、T160A[7]、E186D[26-27]、Q222L[27]、G224S[27]、Q226L[21]、N227S/R[7]、G228S[21]等為為適應(yīng)人宿主而發(fā)生的適應(yīng)性改變(H3編號(hào))；K58I(H7編號(hào))[20]可產(chǎn)生雙重受體特異性。

在H6亞型中，I55V[3]、L111F[3]、P186L[3]、A222V[29]、G228S[3]等替換為為適應(yīng)人宿主而發(fā)生的適應(yīng)性改變(H3編號(hào))；S137N[3]、E190G[3]、A222V[29]等產(chǎn)生雙重受體特異性(H3編號(hào))。

在H7亞型中，K58I[20]、N94K[20]、A151T[23]、G219S[20](相當(dāng)于H3編碼中的第228位)、I/L226Q(H3編號(hào))[20,31]影響HA蛋白的穩(wěn)定性；E186D(H3編號(hào))[26-27]、G186V(H3編號(hào))[21]、G219S[20]、Q226I/L(H3編號(hào))[20,31]、I368V[21]等替換為為適應(yīng)人宿主而發(fā)生的適應(yīng)性改變；G219S[20]、I/L226Q(H3編號(hào))[20,31]等產(chǎn)生雙重受體特異性；A125T[23]、A151T[23]可降低受體親和力；G218E[18]可增加病毒的復(fù)制能力。Chang P等[22]分析表明，A125T、A151T和L217Q(相當(dāng)于H3編碼中的第226位)與免疫相關(guān)。另外，A143V(相當(dāng)于H3編號(hào)中的第135位)、R148K與病毒的傳播有關(guān)[31]，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

在H9亞型中，I155T[4]、H183N[4]、A/I190T/V/D/E[4,28]和Q226L[4]等替換為為適應(yīng)人宿主而發(fā)生的適應(yīng)性改變(H3編號(hào))；而G72E、G73K、S127N、S132A、D135G、N183D、A180V(相當(dāng)于H3編號(hào)中的第190位)、L216Q(相當(dāng)于H3編號(hào)中的第226位)、N221D、N238D和V239I等替換將使A/H9N2轉(zhuǎn)變?yōu)樘右萃蛔凅w[36]。

值得一提的是，Q226L和G228S(H3編號(hào))作為病毒嗜性向哺乳動(dòng)物方向轉(zhuǎn)移的標(biāo)志性替換，在眾多亞型的HA蛋白上都曾出現(xiàn)過，目前前者涉及H2、H3、H5、H7和H9等亞型，后者涉及H2、H3、H5和H7等亞型[21]。這或許與其特殊的位置有關(guān)(H3亞型中，兩者既落在HA的抗原表位D上，又落在其RBS的220環(huán)內(nèi))。何軍等[37]發(fā)現(xiàn)，安徽省2013-2018年分離的外環(huán)境禽源A/H9N2的HAs在183、189、190、226和227等多個(gè)位點(diǎn)均發(fā)生突變，這些突變的累積效應(yīng)使其逐漸向適應(yīng)哺乳動(dòng)物方向進(jìn)化(H3編號(hào))。結(jié)合表1及近期相關(guān)文獻(xiàn)資料我們認(rèn)為，在進(jìn)化過程中相較于153、194、195等位點(diǎn)，135、186、190、222、225、226、227、228等位點(diǎn)相對(duì)容易發(fā)生突變(H3編號(hào))，且對(duì)宿主嗜性影響較為顯著。另外不難發(fā)現(xiàn)，RBS的220環(huán)上存在較多的易突變位點(diǎn)，而且部分突變還與雙重受體特異性的產(chǎn)生相關(guān)；Peacock等[38]也曾指出，220環(huán)氨基酸缺失的流感病毒(特別是在H5、H7或H9亞型中)與其他毒株相比可能構(gòu)成更高的人獸共患病風(fēng)險(xiǎn)，故應(yīng)警惕。

3.2 變異間的聯(lián)系發(fā)展 一些研究表明，HA蛋白內(nèi)不同位點(diǎn)間的替換是具有相關(guān)性的。當(dāng)Q226L與G228S突變共存時(shí)，HA蛋白對(duì)SAα2, 6Gal的結(jié)合明顯增加[39]。N224K和Q226L突變協(xié)同可改變受體結(jié)合偏好，產(chǎn)生空氣傳播的H5，但這可能還與HA上N158D和T318I替換相關(guān)[40]；Wang Z等[19]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HA-N224K/Q226L/T318I突變可使含有來自pH1N1/09病毒7個(gè)基因和來自H5N1病毒HA基因的重組病毒獲取在雪貂之間傳播的能力。另外，A/H7N9 HA上的A125T、A151T和L217Q突變可以在傳代培養(yǎng)中同步保持[22]；在進(jìn)一步的研究中Chang P等發(fā)現(xiàn)，A125T+A151T突變可完全消除病毒對(duì)SAα2, 6Gal的結(jié)合[23]。

各病毒蛋白間的位點(diǎn)變異同樣具有內(nèi)在聯(lián)系。PB1中的H99Y、HA中的H110Y和T160A被認(rèn)為對(duì)病毒在雪貂中的呼吸道傳播是必不可少的(H3編號(hào))[40]；PB2-701N和HA-260M影響著病毒嗜性向哺乳動(dòng)物方向轉(zhuǎn)變(H3編碼)[2]。當(dāng)與適當(dāng)?shù)腘A一起考慮時(shí)，HA的第180位殘基(H9編號(hào)，相當(dāng)于H3編號(hào)的第190位)是一個(gè)很好的哺乳動(dòng)物適應(yīng)的分子標(biāo)志物[28]。在人源A/H9N2分離株中，HA(183N、190T/V、227Q)、PB2(588V、627K/V、701N)和PA(356R、409N)具有關(guān)聯(lián)性，且是關(guān)鍵的哺乳動(dòng)物適應(yīng)標(biāo)記(H3編號(hào))[4]。最近還有研究顯示[41]，甲型流感病毒NA蛋白的第二唾液酸結(jié)合位點(diǎn)突變驅(qū)動(dòng)血凝素補(bǔ)償性突變，可能增加人獸共患的潛力。故HA位點(diǎn)的變異不僅在蛋白內(nèi)部具有協(xié)調(diào)性，而且其還與NA、PA、PB1和PB2等蛋白的變異相關(guān)，進(jìn)而共同影響著病毒的生物學(xué)特性。

4 藥 物

血凝素主要參與病毒生命周期的吸附與膜融合。對(duì)于其藥物的研究，在認(rèn)識(shí)的早期階段，研究者們常把目光投注于HA的球形頭部，通過影響RBS及抗原位點(diǎn)來抑制血凝素的功能?，F(xiàn)今，研究者們發(fā)現(xiàn)，相較于HA球形頭部，莖區(qū)的某些序列和結(jié)構(gòu)是高度保守的，尤其是內(nèi)含的融合肽(HA蛋白中最保守的區(qū)域)，這使得它成為一個(gè)全新的有吸引力的靶點(diǎn)。目前，許多抑制血凝素藥物的研究較前有所進(jìn)展，而作用對(duì)象大多都集中在HA莖區(qū)這一功能區(qū)域，例如：一些廣泛性中和抗體及大部分膜融合抑制劑等。

4.1 中和抗體 MEDI8852由MedImmune研發(fā)，靶向HA莖區(qū)，通過互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity-determining regions,CDR)協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)，結(jié)合至莖區(qū)高度保守的表位(涵蓋融合結(jié)構(gòu)域中的疏水槽和大部分融合肽)，從而抑制HA介導(dǎo)的膜融合過程，也可與HA前體結(jié)合來阻斷HA0的裂解[43-44]。對(duì)所有IAV均有抑制作用，已進(jìn)入Ⅱ期臨床開發(fā)[45]。

MHAA4549A由Genentech研發(fā)，通過結(jié)合HA莖區(qū)上某些高度保守的表位來阻止融合肽的展開，進(jìn)而阻斷膜融合，同時(shí)促進(jìn)依賴抗體的細(xì)胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)和依賴抗體的細(xì)胞吞噬作用(antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP)，最終實(shí)現(xiàn)抗病毒作用[43,46]?？梢灾泻退幸阎娜祟惣仔土鞲胁《径局?，在Ⅱa期研究中確定了預(yù)計(jì)的人體有效劑量(45 mg/kg)[47]。

CR6261和CR8020由Crucell[43]研發(fā)，同樣靶向HA莖區(qū)。在系統(tǒng)遺傳進(jìn)化方面，HA分為2個(gè)進(jìn)化組：組1(包含H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17、H18)和組2(包含H3、H4、H7、H10、H14、H15)[48]。CR-6261[49-50]識(shí)別HA1/HA2膜近側(cè)莖中高度保守的螺旋區(qū)，主要與HA2-A螺旋相互作用，但也與HA1-N端的部分殘基接觸；其可能通過穩(wěn)定融合前狀態(tài)來阻斷與膜融合相關(guān)的構(gòu)象重排而發(fā)揮抗病毒作用；作用于第1組，目前已進(jìn)入Ⅲ期臨床研究。而CR-8020作用的表位殘基則位于融合肽的關(guān)鍵區(qū)域(HA 21-25)和HA2的螺旋帽狀區(qū)(H3編號(hào))，其通過分離融合肽并阻止其在低pH下的釋放來阻止融合，同時(shí)還可能通過抑制宿主蛋白酶裂解HA0來干擾融合[51]；對(duì)第2組的HA有抑制作用，也已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[50]。兩者互為補(bǔ)充，聯(lián)合治療可拓寬對(duì)宿主的保護(hù)范圍。

VIS410由Vistera研發(fā)，靶向HA莖區(qū)，主要作用于其上一高度保守的A螺旋區(qū)域，通過與HA的莖區(qū)結(jié)合從而阻止膜融合過程來終止病毒復(fù)制周期，在體外試驗(yàn)中還表現(xiàn)出ADCC作用[52]?？蓮V泛中和流感病毒第1組的H1、H2、H5、H6、H9和第2組的H3、H7等亞型，已進(jìn)入Ⅱ期臨床研究[50,52-53]。另外有報(bào)道顯示[54]，在GISAID數(shù)據(jù)庫中，0.06%的HA序列中已鑒定出對(duì)VIS410體外敏感性降低的變異體(HA2 N53D)。

有待進(jìn)一步研發(fā)的抗體(靶向部位)還包括：CH65(RBS)、C05(RBS)、5J8(RBS)、F045-092(頭部)、27F3(莖區(qū))、CR9114(莖區(qū))、FI6v3(莖區(qū))、F10(莖區(qū))、PN-SIA28(莖區(qū))、CT-P27(莖區(qū))等。

4.2 受體結(jié)合抑制劑 DAS181(Fludase)[45]是一種重組的唾液酸酶融合蛋白,通過除去宿主細(xì)胞表面的唾液酸，來抑制HA蛋白的吸附過程。其對(duì)季節(jié)性甲、乙型流感病毒有抑制作用，對(duì)小鼠H5N1病毒感染有防治作用，對(duì)耐奧司他韋的H1N1臨床分離株也有效，目前處于Ⅲ期臨床研究[55]。此外，還有Cyanovirin-N、FluPep等有待進(jìn)一步研發(fā)。

4.3 膜融合抑制劑 阿比朵爾是一種吲哚類化合物，通過穩(wěn)定HA的結(jié)構(gòu)來阻斷HA介導(dǎo)的融合過程，對(duì)甲型、乙型流感病毒毒株都具有抑制作用[47]。目前，美國正在進(jìn)行Ⅳ期臨床研究，我國已上市[56]。硝唑尼特(nitazoxanide，NT-300)是一種噻嗪類廣譜抗病毒藥物，在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性形式—替唑尼特 (tizoxanide)，作用于翻譯后階段，通過阻斷HA糖基化等影響HA成熟、干擾HA0的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)[45]。其對(duì)多種人和禽流感病毒(H1N1、H3N2、H5N9、H7N1等)均有活性，目前處于Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段[50,57]。 其他噻唑類化合物還包括：RM-5014，唑沙尼特，RM-5038等[50]。同時(shí)，TBHQ、苯磺酰胺類化合物(RO5464466和RO5487624)、MBX2546和MBX2329、CBS1117和H84T等目前也在研發(fā)中。

4.4 天然小分子物質(zhì) 大自然中還存在一些對(duì)血凝素有抑制作用的天然小分子物質(zhì)，例如：赤芍、白芍、金縷梅及牡丹皮等中的鞣質(zhì)化合物(五沒食子酰基葡萄糖、單寧酸等)[58]、接骨木莓和金蕎麥等中的黃酮類化合物(甲基槲皮素和二氫楊梅素等)[59-60]、姜黃中的多酚化合物(姜黃素)[61]、穿心蓮內(nèi)酯磺化物[62]、板藍(lán)根水提物S-03[63]、PPa[64]、urumin[65]、EGCG[66]、spiromastilactones[50]、Stachyflin[55]、OA-10[66]等。

5 小 結(jié)

目前，對(duì)HA 蛋白的研究主要集中在2個(gè)領(lǐng)域，一個(gè)與頭部相關(guān)，另一個(gè)則與莖部相關(guān)，前者主要涉及IAV跨物種傳播的機(jī)制研究，后者則側(cè)重于相關(guān)藥劑的研發(fā)。最近，個(gè)別學(xué)者強(qiáng)調(diào)了HA-NA間的平衡關(guān)系，同時(shí)指出兩者具有一定的適應(yīng)性才能穩(wěn)定傳遞，這或許就解釋了為什么“H”和“N”雖然可以自由搭配但兩者組合并不是完全隨機(jī)；對(duì)于那些尚未出現(xiàn)過的HxNx，當(dāng)下或許因?yàn)榉肿娱g的不平衡性和種群障礙而被限制，但卻是我們未來警惕的方向。Sun X等[4]也曾指出，H9N2病毒的內(nèi)部基因具有較高的相容性，引起人類感染的H5N1、H5N6、H7N9和H10N8病毒都從其內(nèi)獲得了內(nèi)部基因，這就意味著H9N2病毒扮演著內(nèi)部基因供體的角色。因此，IAV的廣泛分布將導(dǎo)致病毒的重新分類和不同基因型的產(chǎn)生，這在很大程度上增加了人獸共患病的風(fēng)險(xiǎn)。其次，抗流感病毒藥物的耐藥形勢(shì)變得越來越嚴(yán)峻，例如：M2離子通道抑制劑因普遍耐藥已不推薦用于臨床，神經(jīng)氨酸酶抑制劑的耐藥株及新發(fā)耐藥位點(diǎn)與日俱增，上市不久的巴洛沙韋的耐藥株也已出現(xiàn)[67]。在未來，病原學(xué)監(jiān)測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查、生物學(xué)特性的剖析以及相關(guān)新藥的研發(fā)仍然是該領(lǐng)域的重點(diǎn)。隨著相關(guān)數(shù)據(jù)庫的健全以及抗流感藥物的不斷充實(shí)，或許有一天我們可以根據(jù)監(jiān)測(cè)信息的回報(bào)，通過對(duì)藥物的規(guī)律性使用來主動(dòng)調(diào)控甲型流感病毒的變異方向，進(jìn)而減少一些突發(fā)事件的產(chǎn)生，也讓公衛(wèi)大環(huán)境更加穩(wěn)固。

利益沖突：無