霉菌毒素的不同檢測方法 在飼料生產中的應用探討

張鵬 鞏新民 李玉燕 王懷娜 包丹丹 祝永華 郭龍宗

摘? 要：霉菌毒素目前常用的檢測方法有薄層層析法（TLC）、色譜法、質譜聯用技術、免疫化學檢測法等。各種檢測方法的靈敏度、準確度、穩(wěn)定性、檢測環(huán)境、操作難易程度、設備和費用的局限應用領域有較大的差異。本實驗室采用高效液相色譜（HPLC-MS/MS）、橫向流動免疫技術（LFD）、酶聯免疫吸附法（ELISA）三種方法測定玉米基質定值質控品A、B、C樣品的嘔吐毒素、黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮三種毒素的含量，評估空白樣品和定值質控品的檢測結果和回收率，根據臨床應用，比較三種不同的霉菌毒素檢測方法的優(yōu)缺點。準確度評估結果顯示：HPLC-MS/MS法>ELISA法>LFD法，但三種方法都有各自的優(yōu)缺點，實際生產可以靈活選擇使用。

關鍵詞：霉菌毒素; 色譜法;橫向流動免疫技術;酶聯免疫吸附法

中圖分類號：S856.9? ? ? ? 文獻標識碼：B? ? ? ? 文章編號：1673-1085（2021）5-0005-05

霉菌毒素是指霉菌在寄生物質上進行生命活動所產生的有毒代謝產物，常見的寄生物質包括食品或農作物等。這些有毒物質被人和動物攝入體內后，會引起肝臟、腎臟、生殖系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、被皮系統(tǒng)等各器官機能障礙，甚至危及生命。霉菌毒素廣泛存在于自然界中，種類繁多，常見的有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、T-2毒素等。因霉菌毒素污染給食品加業(yè)、畜禽養(yǎng)殖業(yè)、飼料加工業(yè)造成了巨大的經濟損失，因此霉菌毒素污染問題已經被現代農業(yè)生產者以及食品加工業(yè)高度重視，各種霉菌毒素的檢測技術及檢測試劑應運而生。目前常用的霉菌毒素檢測方法有薄層層析法（TLC）、色譜法（薄層色譜TLC、氣相色譜GC、高效液相色譜HPLC）、質譜聯用技術（氣質聯用CG-MS、液質聯用HPLC-MS/MS）、免疫化學檢測法（橫向流動免疫技術LFD、膠體金免疫層析法、酶聯免疫吸附法ELISA）等。本實驗室采用臨床常用的三種檢測方法測定玉米基質A、B、C樣品的嘔吐毒素、黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮三種毒素的含量，比較三種不同的霉菌毒素檢測方法的結果差異，總結與探討霉菌毒素檢測方法在各領域應用的優(yōu)勢和劣勢。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 玉米基質樣品? 待檢樣品為玉米基質A、B、C 3份，其中A為空白樣品（<10ppb），B、C為定

值的質控樣品。B樣品嘔吐毒素的真實值為（0.705±0.055） ppb，玉米赤霉烯酮的真實值為（125±15） ppb，黃曲霉毒素B1的真實值為（13.5±1.5） ppb;C樣品嘔吐毒素的真實值為（1.41±0.11） ppb，玉米赤霉烯酮的真實值為（250±30） ppb，黃曲霉毒素B1的真實值為（27±3） ppb。

1.1.2? 主要試劑? 選取2個品牌的3個品項的ELISA

檢測試劑盒（嘔吐毒素ELISA檢測試劑盒、玉米赤霉烯酮ELISA檢測試劑盒、黃曲霉毒素B1 ELISA檢測試劑盒），2個品牌的3個品項的LFD快速定量檢測條（嘔吐毒素LFD快速定量檢測條、玉米赤霉烯酮LFD快速定量檢測條、黃曲霉毒素B1 LFD快速定量檢測條），多功能凈化柱、色譜級甲醇、色譜級乙腈、正己烷、乙酸、三氟乙酸、霉菌毒素標準液等。

1.1.3? 主要儀器? MK3酶標儀（美ThermoFisher公司），LFD快速定量檢測條配套檢測儀，液相質譜質譜聯用儀（型號1290/6460，美國Agilent公司），電子天平，粉碎機，離心機，水浴鍋等。

1.2? 方法? 檢測方法為色譜法（HPLC-MS/MS）、

酶聯免疫吸附法（ELISA）、橫向流動免疫技術（LFD）。霉菌毒素檢測樣品的預處理及實驗分析嚴格按照試劑盒和儀器的操作說明書進行，完成A、B、C三份待檢樣品的含量測定并計算檢測結果和回收率。實驗依據GB/T27404-2008實驗室質量控制規(guī)范食品理化檢測附錄F（資料性附錄）檢測方法確認的技術要求，回收率參考范圍見表1。

2? 結果

2.1? B樣品和C樣品嘔吐毒素（DON）檢測數據

結果? 本次實驗對B樣品和C樣品中的嘔吐毒素

（DON）采用3種方法進行88次檢測，其中采用LFD方法進行22次檢測，合格率為36.4%（8/22）;采用ELISA方法進行62次檢測，合格率為69.4%（43/62）;HPLC-MS/MS方法進行4次檢測，合格率為100%（4/4）。

檢測結果見圖1。

2.2? B樣品和C樣品玉米赤霉烯酮（ZEN）檢測數

據結果? B樣品和C樣品玉米赤霉烯酮（ZEN）采用3種方法進行73次檢測，其中采用LFD方法進行15次檢測，合格率為53.3%（8/15）;采用ELISA方法進行51次檢測，合格率為64.7%（33/51）;HPLC-MS/MS方法進行7次檢測，合格率為71.4%（5/7）。檢測結果見圖2。

2.2? B樣品和C樣品玉米赤霉烯酮（ZEN）檢測數

據結果? B樣品和C樣品玉米赤霉烯酮（ZEN）采用3種方法進行73次檢測，其中采用LFD方法進行15次檢測，合格率為53.3%（8/15）;采用ELISA方法進行51次檢測，合格率為64.7%（33/51）;HPLC-MS/MS方法進行7次檢測，合格率為71.4%（5/7）。檢測結果見圖2。

2.3? B樣品和C樣品黃曲霉毒素B1檢測數據結果

B樣品和C樣品黃曲霉毒素B1采用3種方法進行73次檢測，其中采用LFD方法進行16次檢測，合格率為56.3%（9/16）;采用ELISA方法進行51次檢測，合格率為72.5%（37/51）;HPLC-MS/MS方法進行6次檢測，合格率為83.3%（5/6）。檢測結果見圖3。

3? 討論

從B、C兩份玉米基質樣品的檢測結果我們可以得出，HPLC-MS/MS法準確度高，穩(wěn)定性和重復性高，能夠檢出飼料及食品中少量的霉菌毒素，很少出現假陽性，是比較理想的一種霉菌毒素檢測方法;但由于此方法所用儀器耗材昂貴，對操作人員的技術要求較高，檢測方法及樣品前處理相對繁瑣，操作難度較大，檢測結果相對滯后，并未在畜禽養(yǎng)殖及飼料加工企業(yè)中廣泛應用，多應用于一些專業(yè)的檢測機構以及科研領域。

ELISA方法的準確度略低于色譜法，其優(yōu)點是操作簡便、靈敏度高、干擾小、安全性高、污染少、成本低、快速定量檢測，而且對樣品純度要求不高，無需貴重儀器;其缺點是ELISA試劑盒容易受溫度、試劑盒品牌、酶標儀的靈敏度影響，導致穩(wěn)定性和可重復性略差，本方法適用于飼料廠、糧食粗加工、養(yǎng)殖場對飼料原料的篩選及成品飼料的霉菌毒素含量檢測。

LFD的方法簡便快速，無需復雜的設備、攜帶方便，適用于飼料生產及糧食粗加工現場，對操作人員的專業(yè)知識要求不高，準確度略低于色譜法和ELISA法。此方法適用于飼料廠、糧食粗加工廠對原料及糧食的初篩，必要的時候采用色譜法或ELISA法對檢測結果進行確認。

在人類對食品安全意識和動物福利意識不斷提高的當下，霉菌毒素的檢測在糧食加工企業(yè)、飼料廠及養(yǎng)殖企業(yè)也得到高度重視。因此，實驗室無論采用哪種檢測方法，在首次采用方法前都要對分析方法的適用性、準確度、檢出限和定量限、線性及校準、回收率、穩(wěn)定性、測量的不確定性進行評估和驗證，根據實際需要選擇一套簡便、快速、準確的檢測方法，保證檢測結果有科學依據以及準確、可靠、可行。

Application of different detection methods of mycotoxin in feed production*

ZHANG Peng ，GONG Xinmin， LI Yuyan， WANG huaina，BAO Dandan，ZHU Yonghua** ，GUO Longzong**

（Shandong Yisheng Animal and Poultry Breeding Company，Shandong Yantai 264680，China）

Abstract： Thin layer chromatography （TLC）， chromatography， mass spectrometry and immunochemistry are commonly used to detect mycotoxins now. There are great differences in sensitivity， accuracy， stability， detection environment， operation difficulty， equipment and cost of various detection methods. The contents of vomit toxin， aflatoxin B1 and zearalenone in samples A， B and C were determined by high performance liquid chromatography （HPLC-MS / MS）， LFD and ELISA. The detection results and recovery rates of blank samples and quality control samples were evaluated. The advantages and disadvantages of three different mycotoxin detection methods were compared. The accuracy evaluation results showed that： HPLC-MS / MS > ELISA > LFD method， but the three methods have their own advantages and disadvantages， and can be flexibly used in actual production.

Keywords：Mycotoxin;Chromatography; Cross flow immunoassay; Enzyme linked immunosorbent assay.