高 帆 尹旭崗 馮 佳 呂俊平 劉 琪 南芳茹 劉旭東 謝樹蓮

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 太原 030006)

杜氏藻(Dunaliella)屬于綠藻門(Chlorophyta),綠藻綱(Chlorophyceae), 團藻目(Volvocales), 杜氏藻科(Dunaliellaceae), 多分布于鹽湖、海洋及濕地,單細胞, 無細胞壁, 可進行無性或有性生殖, 是一類特色微藻資源[1]。杜氏藻耐鹽性較強, 在代謝水平上, 該藻主要通過甘油合成代謝來調(diào)節(jié)胞內(nèi)外滲透壓平衡[2]; 在細胞水平上, 該藻可通過質(zhì)膜ATPase泵驅(qū)動鈉/氫離子的吸收與釋放來響應(yīng)鹽脅迫[3]; 在分子水平上, 該藻可通過耐鹽基因的差異表達來應(yīng)答不同濃度的鹽脅迫[4]。杜氏藻易繁殖, 可提取天然β-胡蘿卜素、甘油等高附加值產(chǎn)品, 還可固定CO2, 可有效減緩溫室效應(yīng), 已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等工業(yè)領(lǐng)域[5]。

目前, 國內(nèi)外對于杜氏藻屬的研究多限于局部范圍內(nèi)部分品系的分類鑒定[6]、耐鹽機理機制的探索[7]、代謝途徑中關(guān)鍵基因挖掘及活性產(chǎn)物的特性研究[8]。藻類研究者從形態(tài)和分子水平已鑒定到杜氏藻屬種類共28個[9,10], 然而對于不同地理來源的多種杜氏藻資源, 其多相化分類研究仍然很少, 這在一定程度上限制了國內(nèi)外杜氏藻的系統(tǒng)分類和多樣性研究。杜氏藻廣譜耐鹽, 研究者們已探索了杜氏藻的部分鹽脅迫應(yīng)答機制, 耐鹽基因及其代謝途徑[11—13], 但相關(guān)研究多以模式藻株D. salina為實驗材料[14,15], 杜氏藻屬的耐鹽普通機制仍須系統(tǒng)深入地研究。我國土壤鹽漬化嚴重, 挖掘高耐鹽杜氏藻特色品系, 為深入探究其鹽脅迫響應(yīng)普適機制,進而利用生物手段改良鹽堿地具有重要的現(xiàn)實意義。

本研究以國內(nèi)外不同來源的20株杜氏藻為研究對象, 對其進行形態(tài)學(xué)、生理生化和分子水平的多相化特征研究, 篩選特色耐鹽藻株的同時, 進一步揭示了杜氏藻屬不同品系間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。研究結(jié)果可為杜氏藻屬的分類鑒定、特色資源的篩選與保護、以特色藻株為生物反應(yīng)器進行活性產(chǎn)物的工業(yè)化開發(fā)與利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

在山西運城鹽湖進行采樣, 輔以國內(nèi)外藻種庫搜集, 共獲得20株不同地理來源的杜氏藻藻株(表1)。

表1 國內(nèi)外不同品系杜氏藻信息Tab. 1 Information of Dunaliella in the world

1.2 藻株培養(yǎng)及杜氏藻屬鑒定

藻株在分離純化后, 以實驗室前期優(yōu)化的BG11培養(yǎng)基(3 g/L NaCl, 1.5 g/L NaNO3, 0.04 g/L K2HPO4,0.075 g/L MgSO4·7H2O, 0.036 g/L CaCl2·7H2O, 0.02 g/L Na2CO3, 0.006 g/L C6H8O7, 0.006 g/L C6H10FeNO8,1000 mL ddH2O定容)對20株杜氏藻進行室內(nèi)擴大培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中定期通過顯微鏡觀察藻株生長狀態(tài), 排查有無染菌, 每20天左右注入少量新鮮培養(yǎng)基補充液保證總體積不變。以1株實驗室前期已鑒定的Dunaliellasp. YC01[16]為參考, 利用18S rDNA對20株杜氏藻進行屬內(nèi)初步鑒定。利用CTAB法[17]提取60d左右的藻株DNA, 18S rDNA擴增正向引物: 5′-TTGGGTAGTCGGGCTGGTC-3′,反向引物: 5′-CGCTGCGTTCTTCATCGTT-3′。18S rDNA-PCR的反應(yīng)體系(25 μL)為: 2.5 μL dNTPs(2 mmol/L), 1.5 μL Mg2+(25 mmol/L), 1 μL DNA,0.3 μLTaq酶(5 U/μL)和2.5 μL 10×反應(yīng)緩沖液,1 μL引物對, ddH2O補齊。PCR反應(yīng)程序為: 94℃5min, 94℃ 40s, 53℃ 40s, 72℃ 1min, 循環(huán)35次后72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)華大基因測序驗證后, 利用MEGA 6.0及最大似然法(Maximum likelihood)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 基于ITS的杜氏藻系統(tǒng)發(fā)育分析

ITS序列擴增同1.2的方法, 提取杜氏藻DNA。設(shè)計并合成杜氏藻ITS擴增通用引物對(正向引物: 5′-GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG-3′,反向引物: 5′-TCCTCCCTTATTGATATGC-3′)。ITS-PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)程序同1.2。電泳檢測并收集800—1000 bp特異性擴增產(chǎn)物。純化后送華大基因測序。

系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建ClustalX2.0聯(lián)合MEGA6.0軟件對測序數(shù)據(jù)進行比對, 利用MEGA6.0軟件中Modles模塊進行ITS替換矩陣極大似然估計, 根據(jù)Tamura-Nei模型估算堿基替代模式和比率[18]。利用MEGA6.0軟件的Distance模塊計算遺傳距離, 選擇成對計算模式。利用MEGA6.0和MrBayes 3.1.2軟件, 基于最大似然法、臨接法(Neighbour-joining)和貝葉斯法(Bayesian)分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, 后驗概率表示拓撲結(jié)構(gòu)支持率[19]。外類群物種選用萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。

1.4 基于cox2-3的杜氏藻系統(tǒng)發(fā)育分析

同1.2的方法, 提取杜氏藻DNA。設(shè)計并合成杜氏藻cox2-3擴增通用引物對(正向引物: 5′-AC CAGCATTATTCTTATTAGTAG-3′, 反向引物: 5′-CCAATTAATAATGGTAAAAT-3′), 擴增產(chǎn)物大小約500 bp左右,cox2-3-PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)程序同1.2。外類群物種同樣選用萊茵衣藻(C. reinhardtii)。cox2-3的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建方法同1.3。

1.5 細胞密度及耐鹽性測定

以實驗室前期對杜氏藻細胞的監(jiān)測結(jié)果[16,20],利用紫外-可見光分光光度計測定685 nm處的藻液吸光值, 繪制OD685-藻細胞密度標準曲線, 測算優(yōu)化培養(yǎng)基配方條件下不同生長時期的杜氏藻細胞密度。富集新鮮藻細胞, 以3×104個/mL接種濃度,約100 mL的接種量分別接種到含0、0.5、1.0、2.0和4.0 mol/L NaCl的1000 mLBG11培養(yǎng)液中, 最終的NaCl濃度梯度為: 0.005、0.46、0.91、1.82和3.64 mol/L, 每個鹽度設(shè)置3個平行。

1.6 生理生化指標測定

光合效率測定參考常毅洪等的方法[21], 將0.46 mol/L NaCl脅迫條件下的藻液在不同生長周期(5d、15d、30d和60d)分別暗適應(yīng)30min后, 利用MINI-PAM(WALZ, 德國)超便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x測定不同杜氏藻品系的最大熒光產(chǎn)量(Fm), 可變熒光產(chǎn)量(Fv), 計算PSII的潛在最大光合能力(Fv/Fm)。

中性脂含量測定取0.46 mol/L NaCl脅迫條件下的100 mL成熟期藻液(60d左右), 參考Takagi等[22]的方法, 測定不同品系杜氏藻的中性脂干重。

β-胡蘿卜素含量測定取0.46 mol/L NaCl脅迫條件下的5 mL成熟期藻液(60d左右), 參考王婷等[20]的方法分離杜氏藻的β-胡蘿卜素提取液, 繪制OD480-β-胡蘿卜素含量標曲, 測定不同品系杜氏藻的β-胡蘿卜含量。

3-磷酸甘油磷酸酶活性測定取0.46 mol/L NaCl脅迫條件下的5 mL成熟期藻液(60d左右),參考Hunt等[23]的方法, 測定3-磷酸甘油磷酸酶酶活性, 酶活單位以每mg蛋白每小時釋放無機磷的μg數(shù)表示［μg Pi/(mg·pro·h)］。

2 結(jié)果

2.1 杜氏藻的鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

由20株杜氏藻的18S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹可知,所有藻株間的親緣關(guān)系較近(以Dunaliellasp. YC01為參考), 均屬于杜氏藻屬, 可用于下一步種內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育分析。

20株杜氏藻ITS的PCR擴增結(jié)果均呈陽性。在杜氏藻ITS基因中, A和G之間的替換率最高(A/G:13.71, G/A: 14.54), 其他堿基間的替換率較低(表2)。杜氏藻ITS基因間的遺傳距離為0.01—0.58。將最大似然樹、鄰接樹和貝葉斯樹結(jié)合, 以鄰接樹為模板作為結(jié)合樹形, 并在節(jié)點處輔以3種算法的支持率進行顯示(圖1A)。杜氏藻ITS系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果顯示, 20株杜氏藻品系整體親緣關(guān)系較近(各分支的支持率相對較高, 與外類群顯著分離), 大體可分為兩簇。第一簇中D19和D20間的支持率達100/1/100,證實這2個品系確為D. salina, D1和D5間的支持率也為100/1/100, 推測它們極可能為同1個品系, 也提示了兩者的原始鑒定記錄或有偏差。第二簇中D7、D11、D12、D15和D18間的支持率達100/1/100, 表明5株杜氏藻間遺傳關(guān)系很近, 但其中又有遺傳變異存在, 如D7與D12間仍存在部分差異(支持率: 74/?/89)。

表2 杜氏藻ITS堿基替換矩陣的極大似然估計Tab. 2 Maximum likelihood estimation of ITS base substitution matrix in Dunaliella

20株杜氏藻cox2-3的PCR擴增結(jié)果均呈陽性。在杜氏藻cox2-3基因中, G和A、T和C之間替換率最高(A/G: 19.15, T/C: 15.21), 其他堿基間的替換較低(表3)。杜氏藻cox2-3基因間的遺傳距離為0.01—0.68。杜氏藻的cox2-3系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果顯示(圖1B), 20株品系可劃分為兩簇且親緣關(guān)系較為接近(各分支的支持率相對較高, 與外類群顯著分離)。第一簇的D1、D2、D3、D4、D9和D10遺傳關(guān)系較近(支持率: 99/?/77), 聚為一個分支; D5、D6、D16和D17則依次單獨聚為旁支。第二簇中的D13單獨聚為一支, D7與D12聚為另一支且親緣關(guān)系較近(支持率: 99/1/100); D8、D11、D14、D15、D18、D19和D20聚為另一個分支(支持率: 89/1/65),其中D11與D15親緣關(guān)系極近(支持率: 100/1/100),推測它們可能屬同一品種, 同時也提示兩者的原始鑒定記錄或有偏差。

表3 杜氏藻cox2-3堿基替換矩陣的極大似然估計Tab. 3 Maximum likelihood estimation of cox2-3 base substitution matrix in Dunaliella

圖1 基于ITS和cox2-3的20株杜氏藻系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic trees of 20 strains of Dunaliella based on ITS and cox2-3

2.2 杜氏藻形態(tài)多樣性

觀察20株杜氏藻60d左右的形態(tài)(圖2A和2B),總結(jié)其主要形態(tài)學(xué)特征(表4)。

表4 杜氏藻細胞形態(tài)指標Tab. 4 Morphological indicators of Dunaliella cells

圖2 20株杜氏藻成熟期形態(tài)Fig. 2 Morphology of 20 strains of Dunaliella at maturity phase

不同品系杜氏藻60d左右的細胞大小顯示:D13體型最大(細胞長18—20 μm, 細胞寬: 13—13.5 μm), D4和D14體型最小(細胞長8、9—10 μm,細胞寬4—5 μm), 體積相差近6倍, 這可能與其品系的天然遺傳特征有關(guān), 其他品系則體型差異較小。從細胞形狀看, D1、D5、D6、D7、D9、D16、D17、D18、D19和D20為橢圓狀, D2、D3、D8、D10、D11、D12和D15為圓形, D4和D1為梨形,D14為長頸形。多樣的細胞形態(tài)可能與其適應(yīng)環(huán)境滲透壓脅迫能力有關(guān)。與從細胞顏色看, D1、D4、D6、D7、D12和D20為淡綠色, D5、D11、D16和D17為黃褐色, D2、D15和D19為黃綠色,D3和D14為深綠色, D13和D18為綠色, D8為黃色,D9為灰綠色, D10為淡黃色。細胞微觀顏色與宏觀藻液顏色多數(shù)一致, 少數(shù)存在偏差, 這可能與其不同的細胞密度有關(guān)。從有無鞭毛看, D1、D5、D6、D7、D9、D11、D13、D16、D17和D18具有2條等長的鞭毛; D19與D20只發(fā)現(xiàn)1條鞭毛, 其余藻株均未發(fā)現(xiàn)鞭毛存在, 表明這些藻細胞未發(fā)育或鞭毛退化消失, 游動能力差, 更適合靜態(tài)水域或濕地生存。D1、D9和D20發(fā)現(xiàn)眼點, 其余藻細胞均未發(fā)現(xiàn), 表明這3株品系感光性更強。

2.3 杜氏藻生長周期及耐鹽性

由圖3A可知, 20株杜氏藻在0—15d內(nèi)的細胞密度增長量較低, 平均增幅(177±12)×103/mL, 為生長延遲期。在15—50d, 各品系藻細胞密度快速增長, 平均增幅(3859±168)×103/mL, 為對數(shù)生長期, 其中D6和D10生長速度最快(第45天左右即達到最大生物量), 可作為工業(yè)化快速培養(yǎng)的特色品系。在50—60d, 多數(shù)品系的藻細胞生長速度減緩, 各品系藻細胞密度平均增幅(590±21)×103/mL, 進入穩(wěn)定期生長期。從第60天以后, 多數(shù)品系的藻細胞密度呈緩慢下降趨勢, 僅D15仍緩慢生長, 但增幅僅(140±8)×103/mL, 顯示其生長能力較差。

由圖3B可知, 在杜氏藻的成熟生長期(60d左右), 不同品系的耐鹽性各不相同。在微量NaCl(0.005 mol/L NaCl)脅迫條件下, D2藻細胞密度最大, 達(1107±10)×103/mL, 顯示該品系也可適應(yīng)淡水環(huán)境。在0.46和0.91 mol/L NaCl脅迫條件下, D6藻細胞密度均最大, 分別達到(4947±17)×103/mL和(4767±24)×103/mL, 表明該藻株為低耐鹽品系。在1.82 mol/L NaCl脅迫條件下, D5藻細胞密度最大,達(3507±17)×103/mL, 表明該藻株為中度耐鹽品系。在3.64 mol/L NaCl脅迫條件下, D18藻細胞密度最大, 達(1564±13)×103/mL, 表明其為高耐鹽品系, 適合作為藻類耐鹽機制研究的實驗材料。

圖3 20株杜氏藻細胞密度及耐鹽性Fig. 3 Cell density and salt tolerance of 20 strains of Dunaliella

2.4 杜氏藻生理生化特征

由圖4A可知, 不同生長階段的杜氏藻最大光合效率各不相同, 總體變化趨勢是先下降后升高。在第5天, D9的Fv/Fm值最大(0.62±0.082), 表明該品系在生長延遲期光合效率較高。在第15、30和60天, D7的Fv/Fm值均最大, 分別達到0.28±0.079、0.23±0.059和0.55±0.130, 表明該品系在整個生長周期內(nèi)(延遲期除外)的光合效率最高。

一般來說, 杜氏藻生物量越大, 胞內(nèi)中性脂積累量越高[24]。因此, 杜氏藻成熟期的中性脂含量側(cè)面反映了其產(chǎn)脂能力。由圖4B可知, D6和D18的中性脂干重最高, 分別達到(2.77±0.044)和(2.78±0.028) mg/mL, 屬于高產(chǎn)油品系, 適合用于藻類生物柴油的開發(fā)與利用。D15的中性脂干重最低, 僅(1.36±0.035) mg/mL, 為低產(chǎn)油品系。

同中性脂積累相似, 杜氏藻成熟期的β-胡蘿卜素含量反映了其次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)出能力[25]。由圖4C可知, D11的β-胡蘿卜素含量最高, 每100 mL藻液可提取β-胡蘿卜素(86.26±2.05) mg, 可作為β-胡蘿卜素生產(chǎn)加工的適用品系。

3-磷酸甘油磷酸酶是杜氏藻甘油合成代謝的關(guān)鍵酶之一[26], 其酶活力的測定對于高產(chǎn)油杜氏藻特性的研究可提供參考。由圖4D可知, 成熟期的D7在90min內(nèi)酶活力均處于較高水平, 最高達27.38 μg Pi/(mg·pro·h)(75min), 結(jié)合其較高的中性脂積累能力(2.64±0.033) mg/mL(圖4B), 推測該藻株亦屬高產(chǎn)油品系, 可作為微藻脂類代謝的實驗研究。

圖4 20株杜氏藻生理生化指標測定Fig. 4 Determination of physiological and biochemical indexes of 20 strains of Dunaliella

3 討論

ITS序列是植物系統(tǒng)分類研究中常用的參考基因,cox2-3則常用于動物物種的分類學(xué)研究。藻類尤其是鞭毛藻從進化上更接近于植物, 但從功能上又有原生動物的某些特征[27]。鑒于此, 本研究同時選用上述2種基因并結(jié)合3種不同算法對20株杜氏藻資源進行系統(tǒng)發(fā)育研究。為避免生物數(shù)據(jù)庫相關(guān)藻類基因信息的誤差, 本研究對20株藻的ITS和cox2-3基因進行了重新擴增并測序, 增加了結(jié)果的可信度。從2個基因的分析結(jié)果看, 2種系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果整體較一致, 海洋品系(D3、D9和D10)在2種預(yù)測結(jié)果中均聚為一簇, 其他鹽湖品系的聚類結(jié)果無顯著與地理性相關(guān)的特征。本研究的杜氏藻系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果較以往研究者利用傳統(tǒng)單一基因聯(lián)合已報道生物數(shù)據(jù)建樹結(jié)果[6,10]更加可靠, 適用于藻類, 尤其是微藻的系統(tǒng)發(fā)育研究。

張會永等[28]對7株杜氏藻的RAPD分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),D. bioculata、D. parva、D. pericei和D. primolecta親緣關(guān)系較近。上述藻株對應(yīng)本研究品系分別為D4/D15、D6、D7和D9。2種基因的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果同時顯示, D4、D6和D9聚為一類, D7和D15聚為一類, 這部分驗證了張會永等[28]的研究結(jié)果, 差異可能是由于系統(tǒng)分類的遺傳標記不同所致。D. pericei與其他杜氏藻品系的遺傳關(guān)系仍待進一步研究。王偉等[6]、姜瑋等[29]和王冬梅等[30]通過不同基因的系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn),D. viridis與其他杜氏藻品系間親緣關(guān)系均較近。本研究利用2種不同的基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, 發(fā)現(xiàn)2種建樹結(jié)果中, 2株D. viridis品系(D2和D12)同時分別被劃分在2個不同的分支且與其他品系親緣關(guān)系較近, 這提示了D. viridis可能是20株品系中更古老的種類。鑒于搜集的少數(shù)杜氏藻種類與系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果不一致, 我們不排除藻株最初鑒定結(jié)果有誤差。目前, 模式杜氏藻D. salina的細胞器基因組[31]和核基因組序列(版本: NSFN00000000.1)已經(jīng)公布, 下一步搜集全球范圍內(nèi)更多杜氏藻資源, 利用基因組重測序或泛基因組技術(shù)對其進行基因組或泛基因組水平的進化分析, 將有助于全面揭示杜氏藻屬的起源與進化問題。

20株杜氏藻細胞形態(tài)整體相似, 但仍有一定差異, 其原因首先可能是遺傳變異的影響, 這種影響可能不僅局限于不同種間, 同種不同品系間的差異也會存在, 如D13和D14同為D. salina, 但前者細胞體積遠大于后者, 而后者細胞形態(tài)呈獨特的長頸形。其次, 盡管杜氏藻廣譜耐鹽, 但當不同品系遭遇不同濃度鹽脅迫時, 細胞形態(tài)可能發(fā)生適應(yīng)性改變, 這種改變可能與藻細胞調(diào)節(jié)滲透壓平衡的能力有關(guān)。另外, 一些品系觀察到鞭毛和眼點, 鞭毛(含信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和能量代謝相關(guān)蛋白)和眼點(具感光性)均有助于杜氏藻逃逸或應(yīng)答不利環(huán)境[32], 而穩(wěn)定的棲息環(huán)境往往可能導(dǎo)致它們的功能退化甚至突變消失。

綜合20株杜氏藻資源的耐鹽性及4項代表性生理生化指標值, 我們發(fā)現(xiàn), 耐鹽性越強的品系, 其中性脂的積累量及3-磷酸甘油磷酸酶活性往往較高。研究顯示[33], 脂類代謝尤其是甘油酯代謝與杜氏藻的耐鹽性緊密相關(guān), 高滲透壓環(huán)境往往加速了藻細胞的脂代謝過程及相關(guān)酶活性, 而大量的油脂又進一步緩解了細胞膜的滲透壓, 保證藻細胞耐受高鹽環(huán)境。光合效率較強的杜氏藻細胞, β-胡蘿卜素合成量一般較高。作為類胡蘿卜素的一種, β-胡蘿卜素合成量往往提示了該藻株的可見光吸收能力, 光合效率主要反映細胞對葉綠素合成代謝水平[34],兩者有一定的聯(lián)系但并非完全正相關(guān)。

4 結(jié)論

本研究以國內(nèi)外不同地理來源的20株杜氏藻資源為研究對象, 從系統(tǒng)發(fā)育、形態(tài)和生理生化水平對其進行多相特征研究。結(jié)果表明, 20株杜氏藻的ITS和cox2-3系統(tǒng)發(fā)育樹均劃分為2大簇, 盡管少數(shù)品系拓展支持率略有差異, 但各品系間的親緣關(guān)系仍較為相近。杜氏藻形態(tài)多樣, 其中D13細胞體積最大, D14體積最小且呈獨特長頸形, 藻細胞顏色多以綠色或黃綠色為主, 一些品系不具鞭毛和眼點。D6和D10生長速率快, 可用于杜氏藻工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)。D18耐鹽性最強, 可用于耐鹽基因挖掘與鹽脅迫響應(yīng)機制的深入研究。在優(yōu)化培養(yǎng)條件下, D7最大光合效率最高, 可用于杜氏藻光合與呼吸作用的研究。D6和D18富油能力最強, 可用作生物柴油研制的特色材料。D11的β-胡蘿卜含量最高, 可作為工業(yè)提取胡蘿卜素的生物原料。D7的3-磷酸甘油磷酸酶活性最強, 可用于杜氏藻甘油酯代謝調(diào)控機制的研究。研究結(jié)果為杜氏藻資源的挖掘與保護, 特色品系工業(yè)化開發(fā)與利用奠定了基礎(chǔ)。