陳小凡, 王路路, 肖騰飛, 朱葆華, 李 赟, 潘克厚,2??

(1. 海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實驗室(中國海洋大學(xué)), 山東 青島 266003; 2. 嶗山實驗室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室, 山東 青島 266237)

海洋微擬球藻(Nannochloropsisoceanica)屬于真眼點(diǎn)藻綱(Eustigmatophyceae)微擬球藻藻屬(Nannochloropsis)[1],是一種海洋單細(xì)胞微藻,具有生長速度快,油脂含量高等優(yōu)點(diǎn)[2]。微藻體內(nèi)油脂主要由中性脂與極性脂組成,中性脂是微藻碳和能量的儲存形式,被認(rèn)為是生物柴油的理想來源[3]。微擬球藻脂質(zhì)含量占干質(zhì)量的39.4%～44.9%[4]是微藻生物柴油生產(chǎn)的模式藻株。

在對已有的微擬球藻藻株進(jìn)行比較基礎(chǔ)上,開展誘變選育是獲得高油脂產(chǎn)率藻株的重要途徑。目前優(yōu)良微藻藻株的育種方法包括誘變育種和轉(zhuǎn)基因育種。微藻的誘變育種包括物理法(如紫外線、射線、等離子體和重離子束等)和化學(xué)法(如甲烷磺酸乙酯(EMS)亞硝基胍(NTG)等)[5-6]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)則是將油脂合成的功能基因轉(zhuǎn)入微藻體內(nèi)以定向改變油脂的積累能力。誘變是不定向的,轉(zhuǎn)基因也需要考慮轉(zhuǎn)基因藻株的最終生物學(xué)功能,故在誘變和轉(zhuǎn)基因后,都需要對獲得的藻株進(jìn)行快速篩選。尼羅紅染色熒光強(qiáng)度與中性脂質(zhì)密切相關(guān)[7],利用尼羅紅染色結(jié)合流式細(xì)胞儀分析是目前快速篩選高油脂含量微藻的有效方法,這一方法已廣泛用于硅藻、金藻、褐藻和綠藻等微藻油脂含量的分析[8]。

微藻的油脂產(chǎn)率由微藻的生長速率和微藻的中性脂含量共同決定,因此篩選優(yōu)良的藻株時需要同時考慮這兩個因素。利用轉(zhuǎn)基因方法、化學(xué)和物理誘變方法,本實驗室獲得了75株微擬球藻變異藻株。為評價這些變異藻株的油脂生產(chǎn)潛力,使用尼羅紅染色結(jié)合流式細(xì)胞儀分析藻株的中性脂含量,同時考慮藻株的生物量,綜合比較了藻株的油脂生產(chǎn)性能,以期為這些藻株的生產(chǎn)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及培養(yǎng)方法

本實驗所用微擬球藻誘變藻株均來自野生藻株085,其中基因過表達(dá)藻株12株[9],分別為Δ6去飽和酶基因(NoD6)3株、Δ12去飽和酶基因(NoD12)3株,以及2條來自三角褐指藻1條來自擬南芥的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶DGAT基因,命名為PtDGAT1(2株)、PtDGAT2(3株)和AtDGAT(1株)。28株物理誘變藻株均為常壓室溫等離子(ARTP)誘變[10]。33株化學(xué)誘變藻株分別為博來霉素誘變5株[11],甲基磺酸乙酯(EMS)誘變7株[12],亞硝基胍(NTG)誘變18株[13-14]。另外還有Sandoz9785抗性篩選藻株3株[15]和煙氣馴化實驗1株。所有藻種均保存在中國海洋大學(xué)應(yīng)用微藻生物學(xué)實驗室微藻種質(zhì)庫,保存條件為 (17±1) ℃,光照強(qiáng)度35～45 μmol·m-2·s-1,光暗周期10 h∶14 h,每6個月轉(zhuǎn)接1次。

為活化保存藻株用于實驗,對藻種進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),培養(yǎng)基為f/2海水培養(yǎng)基,鹽度30±2,光照強(qiáng)度為50～60 μmol·m-2·s-1,溫度為(25±3) ℃,每天定時搖瓶3次,培養(yǎng)至指數(shù)生長期用于后續(xù)實驗。

1.2 藻株中性脂含量的檢測

尼羅紅是一種脂溶性熒光染料,其在特定波長下熒光強(qiáng)度與油脂含量呈顯著的線性關(guān)系[16],可用于表征微藻的中性脂含量,其相關(guān)系數(shù)達(dá)0.998[17]。

本實驗所用的流式細(xì)胞儀型號為Beckman Coulter FC500,氬離子激光器激發(fā)波長為488 nm,尼羅紅發(fā)射波長為617 nm。分析軟件為CXP Analysis,選擇使用FL3通道。因微藻體內(nèi)自有色素干擾實驗結(jié)果,故在測定時先測定無染色藻株的自發(fā)熒光作為背底,后測量染色細(xì)胞熒光數(shù)值,去背底得到最終結(jié)果。每次測量時3個平行樣品均取1萬個細(xì)胞,共同計算表征樣品熒光強(qiáng)度。

具體操作為取培養(yǎng)至平臺期的微擬球藻藻液2 mL于離心管中,6 000 r/min離心5 min,去上清,加入過濾后的海水進(jìn)行吹打清洗后再次離心,重復(fù)2次,棄上清,保留藻細(xì)胞。加入用海水稀釋過的體積分?jǐn)?shù)為25%的DMSO溶液0.5 mL,充分震蕩后室溫避光靜置10 min[8]。為確定尼羅紅濃度和染色時間,保持其他條件不變,設(shè)定不同濃度的尼羅紅染料對微擬球藻進(jìn)行染色處理:0,0.1, 0.3,0.5,1和5 mg/mL。在不同染色濃度的基礎(chǔ)上設(shè)定了兩組染色時間為10與30 min。每組實驗重復(fù)3次,取平均值用于分析。

1.3 藻株培養(yǎng)過程中中性脂含量分析

為確定微藻中性脂含量測定的時間,選取野生藻株與ARTP誘變藻株194進(jìn)行比較實驗。

兩株藻接種后藻液(75 mL)光密度值(OD)均為0.1,在100 mL的錐形瓶中進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)條件同預(yù)培養(yǎng),每株藻均做3個重復(fù)。培養(yǎng)過程中,每天定時取2 mL藻液通過分光光度計(Hitachi U-3310)測定其在680 nm波長下的OD值[18],以1 mL蒸餾水進(jìn)行調(diào)零。培養(yǎng)周期為12 d。

分別取培養(yǎng)第1,3,5,7,9,11,13天的藻液2 mL,如1.2所述步驟進(jìn)行洗滌染色,采用優(yōu)化后的染色條件,尼羅紅濃度為1 mg/mL,染色時間為10 min,利用流式細(xì)胞儀測定中性脂的相對含量。

1.4 藻株生物量和中性脂產(chǎn)率的測定

取10 mL藻液于離心管中,用烘干至恒重的GF/C玻璃纖維素膜(直徑47 mm,孔徑0.45 μm)抽濾藻液,濾膜放入恒溫箱中60 ℃烘干至恒重后,稱量過濾后生物膜的質(zhì)量,減去生物膜的質(zhì)量,計算生物量。

以原始藻株作為標(biāo)準(zhǔn),將變異藻株與原始藻株的生物量之比作為生物量提升的指標(biāo),同理將變異藻株與原始藻株的熒光強(qiáng)度之比作為中性脂提升的指標(biāo),二者乘積為變異藻株的相對中性脂產(chǎn)率,用于表征其產(chǎn)油能力的水平[19]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

本文所涉及實驗均設(shè)置3個平行,數(shù)據(jù)采用軟件SPSS25.0進(jìn)行單因素方差分析,事后分析為圖基(HSD)檢驗,顯著性水平P<0.05,采用Origin Pro 2018繪圖。

2 結(jié)果分析

2.1 微擬球藻尼羅紅染色方法優(yōu)化

尼羅紅染色后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光強(qiáng)度測定。結(jié)果顯示(見圖1),微藻熒光強(qiáng)度受染尼羅紅染色時間和濃度共同影響,尼羅紅濃度較染色時間對熒光強(qiáng)度影響更顯著。染色10 min處理組中,熒光強(qiáng)度與染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均有所上升,染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)1 mg/mL處理組與5 mg/mL處理組差別不顯著。此外,染色30 min處理組中,當(dāng)濃度為0.1～1 mg/mL時,隨著尼羅紅濃度的增加,熒光強(qiáng)度與染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均有所上升,但高濃度長時間處理會影響細(xì)胞活性,導(dǎo)致5 mg/mL處理組熒光強(qiáng)度與染色細(xì)胞數(shù)均下降。綜合兩方面的結(jié)果,濃度1 mg/mL的尼羅紅染色10 min比較理想。

(a,b表示方差分析差異程度,同一圖中有相同字母的組之間差異不顯著(P>0. 05)。 a、b represents the analysis of variance difference. Values in the same picture with the same superscripts are not significantly different(P>0.05).)

2.2 藻株生長及中性脂含量測定時間的確定

用OD值表征微藻的生長情況,結(jié)果顯示(見圖2(A)),兩株微擬球藻的生長周期無顯著差異。在經(jīng)過2 d的適應(yīng)后,藻株進(jìn)入指數(shù)生長期,藻細(xì)胞密度快速增長。在第6天進(jìn)入平臺期,生長放緩,生物量趨于穩(wěn)定緩慢上升。隨著微藻生長,藻細(xì)胞脂質(zhì)含量經(jīng)過一個先升高后降低并逐漸穩(wěn)定的過程(見圖2(B))。藻株085中性脂在第3天達(dá)到最高,第7天后趨于穩(wěn)定。藻株194總體中性脂含量高于085,其脂質(zhì)含量在第1天達(dá)到頂峰后產(chǎn)生波動,在第7天趨于穩(wěn)定。由于第1天和第3天微藻處于指數(shù)生長期,生物量較低,第9天其生物量與油脂含量較高且處于穩(wěn)定狀態(tài),同時考慮微藻生長與油脂積累,選擇微藻培養(yǎng)至第9天為測量藻株油脂積累量的時間。

圖2 原始藻株085與誘變藻株194培養(yǎng)過程中細(xì)胞密度(A)和熒光強(qiáng)度(B)的變化

2.3 微擬球藻藻株的篩選比較

2.3.1 變異微藻的油脂產(chǎn)率分析 以原始藻株085作為對照,分析實驗藻株中性脂含量和生物量的增長情況,結(jié)果顯示(見表1),除藻株104和198之外,其余實驗藻株生物量均大于原始藻株,藻株183生物量提升幅度最大,為原始藻株的57.5%。除藻株229和191外,其余實驗藻株中性脂含量均大于原始藻株,藻株183中性脂提升幅度最大,為原始藻株的154.9%。綜合比較藻株中性脂的產(chǎn)率,結(jié)果顯示,所有實驗藻株的相對產(chǎn)率均大于原始藻株,其中藻株231相對產(chǎn)率提升幅度最大,為原始藻株的223.8%。

表1 75株微擬球藻生物量與中性脂相對含量

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),藻株192的生物量明顯高于原始藻株(原始藻株的154.6%),但脂質(zhì)含量未見顯著提升(僅為原始藻株的119.80%),其油脂相對產(chǎn)率并不優(yōu)異(僅為原始藻株的185.2%)。而藻株232脂質(zhì)含量高于原始藻株(為原始藻株的146.50%),但生物量未見顯著提升(為原始藻株117.4%),其相對產(chǎn)率也不突出(僅為原始藻株的172.0%)。這說明,微藻的脂質(zhì)產(chǎn)率受到兩方面的影響,一是生物量,二是油脂含量,在高油脂微藻藻株篩選過程中不僅要考慮藻株的脂質(zhì)含量,也要考慮藻株的生物量生產(chǎn)能力。

2.3.2 不同育種技術(shù)提高油脂產(chǎn)率的效果分析 以油脂相對產(chǎn)率提升到210%做為優(yōu)良藻株的篩選指標(biāo),轉(zhuǎn)基因誘變藻株中,5株轉(zhuǎn)基因藻株中性脂相對產(chǎn)率均高于210%,其中088號藻株相對產(chǎn)率最高,為252.2%。ARTP誘變藻株中,有6株相對產(chǎn)率高于210%,其中182號藻株相對產(chǎn)率最高,為244.6%。EMS誘變藻株中,有3株相對產(chǎn)率高于210%,其中101號藻株相對產(chǎn)率最高,為259.0%。博萊霉素誘變藻株,僅212號藻株相對產(chǎn)率高于210%,為247.8%。NTG誘變藻株中,有4株相對產(chǎn)率高于210%,231號藻株相對產(chǎn)率最高,為323.8%。另外,除草劑Sandoz9785篩選的3株藻株中,252號藻株相對產(chǎn)率最高,為196.8%,煙氣馴化藻株相對產(chǎn)率較低,僅為126.5%。上述結(jié)果表明,不同育種技術(shù)用于微擬球藻高油脂產(chǎn)率的培育存在明顯不同,其中231號、088號和101號藻株表現(xiàn)格外突出,其油脂相對產(chǎn)率均高于250%,有望應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。

3 討論

微藻中性脂傳統(tǒng)的測定步驟包括溶劑萃取、薄層色譜(TLC)、氣相色譜(GC)等,其操作繁瑣,費(fèi)時費(fèi)力,難以實現(xiàn)對誘變藻株的快速篩選[17]。尼羅紅(NR-9-二乙氨基-5-苯并[α]苯并惡嗪酮)是一種脂溶性熒光染料,Cooksey等在1987年發(fā)現(xiàn),尼羅紅可與細(xì)胞內(nèi)的中性脂結(jié)合,產(chǎn)生黃金色熒光,熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)結(jié)合中性脂的量密切相關(guān),可作為微藻中性脂含量檢測的方法[20]。2010年Doan等[21]將改良的尼羅紅染色法運(yùn)用到微擬球藻中性脂含量的分析之中并取得良好效果。2016年Alemán-Nava等[8]在前人的研究基礎(chǔ)上制定了不同微藻尼羅紅脂質(zhì)測定的規(guī)范方法,該方法涉及脂質(zhì)測定所必須遵循的五個步驟,本實驗基于該方法開展了實驗藻株中性脂含量的分析。

誘變和基因工程是促進(jìn)微藻脂質(zhì)合成的兩種策略?；蚬こ炭梢园凑赵O(shè)計者意愿直接改變油脂合成路徑中的關(guān)鍵酶基因[22]。二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)作用于TAG生物合成路徑中的最后一步,催化二酰甘油和游離?；o酶A縮合反應(yīng)生成三酰甘油即TAG,此外Δ6去飽和酶與Δ12去飽和酶位于PUFA合成路徑中,與油脂合成相關(guān)。結(jié)果顯示,改變以上基因均有效地提高了微擬球藻的中性脂含量,因未改變生長過程相關(guān)基因,故其生物量并未出現(xiàn)顯著變化。5株轉(zhuǎn)基因藻株中性脂產(chǎn)率均高于210%,說明轉(zhuǎn)入目標(biāo)功能基因可大幅度提高微藻產(chǎn)油能力,但同時也可看到,本實驗轉(zhuǎn)基因藻株中性脂產(chǎn)率并不是最高的,說明進(jìn)一步篩選油脂合成基因以及促進(jìn)生長基因?qū)τ谔岣呶M球藻的油脂產(chǎn)率還是很有必要的。目前微擬球藻的全基因組測序工作已經(jīng)全部完成[9],基因的注釋工作還在繼續(xù),這為獲得以上兩方面優(yōu)良基因提供了可能。

微藻常壓室溫等離子體誘變(ARTP)是一種基于射頻和大氣壓離子體射流的物理誘變技術(shù)。Cao等[23]于2017年利用ARTP誘變獲得了一株蛋白核小球藻的突變體,與對照組相比,其OD680增加了32.08%,干質(zhì)量和產(chǎn)脂量分別增加了22.07%和16.85%。Sun等[24]利用ARTP誘變并定向篩選丙二酸(MA)抗性藻株,獲得了高脂產(chǎn)率柵藻誘變株,其總脂含量比對照組高114.99%。本文28株微擬球藻ARTP誘變藻株中,有15株中性脂相對含量有顯著提升,最高增加了105.8%,有5株生物量有顯著提升,最高提升了60.9%,這說明ARTP誘變不僅可以提升藻株油脂含量也可以提升藻株生長。

甲基磺酸乙酯(EMS)和亞硝基胍(NTG)均屬于烷化劑,其誘變機(jī)理為其活潑烷基與DNA分子中的氫原子發(fā)生烷化反應(yīng),引起堿基錯配從而導(dǎo)致微藻的相關(guān)基因發(fā)生改變。Anandarajah等[6]使用EMS處理微擬球藻,與野生型相比,誘變藻株的總脂生產(chǎn)能力提高了25.7%。本實驗的7株EMS誘變藻株,其中性脂相對含量均有顯著提升,但僅有1株生物量有明顯改變。Chou等[25]利用NTG誘變獲得了一批耐熱小球藻誘變株,其不僅可在40 ℃高溫下生長還顯示出比野生型更高的糖類和脂類含量。本實驗18株NTG誘變藻株中,其中11株藻的中性脂相對含量有明顯的改變,但所有誘變藻株生物量未發(fā)生顯著改變,如誘變藻株231,盡管其油脂產(chǎn)率為原始藻株的323.8%,是實驗藻株中油脂產(chǎn)率最高的,這主要是該藻株油脂積累能力比原始藻株高147.3%,而生物量僅提升了29.0%。這說明這類誘變劑可能更適用于微藻油脂含量的提升。

博萊霉素是一種來自放線菌的糖肽類抗腫瘤抗生素,其可與鐵的復(fù)合物嵌入 DNA 中,導(dǎo)致 DNA 單鏈和雙鏈斷裂。張琳等[26]選取了5種抗生素對微擬球藻的抗生素抗性進(jìn)行了比較,結(jié)果顯示,微擬球藻對博萊霉素表現(xiàn)出高度敏感性。在固體培養(yǎng)中, 0.5 μg/mL的博來霉素即可完全抑制微擬球藻的生長。博萊霉素用于誘變微藻目前報道不多,本研究博來霉素誘變藻株中,藻株212號,生物量比原始藻株提高了49.8%,中性脂含量提高了65.5%,最終油脂產(chǎn)率提高了147.8%,說明博萊霉素不僅可以提高微擬球藻的油脂生產(chǎn),也可以提高生物量的積累能力。

4 結(jié)語

本研究利用尼羅紅染色結(jié)合流式細(xì)胞儀對75株微擬球藻進(jìn)行了高通量篩選,結(jié)果顯示該方法是一種方便快速的篩選方式?；谟椭a(chǎn)率是原始藻株250%這一選擇指標(biāo),本實驗75株藻株中,有3株表現(xiàn)突出,有望應(yīng)用于生物柴油的生產(chǎn)。