李津津，劉凱，王芳，王紅霞，張志華

(1河北農業(yè)大學 山區(qū)研究所，河北省山區(qū)農業(yè)工程技術研究中心，國家北方山區(qū)農業(yè)工程技術研究中心，河北 保定 071001；2 河北農業(yè)大學 園藝學院，河北 保定 071001)

低溫脅迫對植物的地理分布和生長發(fā)育有著重要影響。當植物受到低溫脅迫時，轉錄因子通過結合基因啟動子上的順式作用元件激活低溫響應基因COR(Cold-Related)的表達[1]。bHLH(Basic/helix-loop-helix)因含有大約60個氨基酸組成高度保守的bHLH結構域而得名，包含basic和HLH區(qū)域，而且是轉錄因子大家族成員之一，廣泛存在于植物中，在植物生長、脅迫應答、信號轉導和次生代謝調控中有重要作用[2-3]。ICE屬于一種類似MYC的bHLH轉錄因子，可與CBF3啟動子中MYC作用元件特異性結合，并誘導CBF/DREB1下游基因的轉錄表達[4]。目前，在模式植物擬南芥中ICE1(Inducer of CBF Expression1)-CBF(C-Repeat-Binding-Factor)-COR(Cold-Related)低溫信號途徑已經(jīng)基本清晰，為其他植物研究抗寒分子機制的發(fā)展提供了理論依據(jù)[5]。自2003年Chinnudamy等[6]首次發(fā)現(xiàn)擬南芥突變體ice1中CBF3及CBFs下游基因的表達出現(xiàn)了下降，而且抗寒能力下降。研究人員陸續(xù)在黑枸杞[7]、棗[8]桑樹[9]、桃[10]、苦蕎[11]鑒定出了bHLH基因家族轉錄因子，并且在忍冬[12]、獼猴桃[13]、油菜[14]、茶樹[15]、赤桉[4]等植物中鑒定了ICE1同源基因，但未發(fā)現(xiàn)在核桃中有報道。ICE是ICE-CBF-COR冷響途徑最上游調控因子[5]。在響應低溫應答過程中，ICE1轉錄因子被激活，其下游基因CBFs及COR被誘導表達，以提高自身抵御低溫脅迫的能力[16]。已有研究表明，將油菜ICE1基因轉化煙草后，在低溫脅迫下轉基因煙草明顯比野生型對照有較高的承受能力[14]。過表達ICE1基因水稻在4 ℃低溫脅迫后，轉基因株系存活率和脯氨酸含量明顯增加，相對電導率和丙二醛含量積累速率明顯下降，提高了抗低溫脅迫能力[17]。已有多項研究證實ICE1基因通過不同作用方式參與植物自身提高耐寒性能力的過程[18，21]。因此，抗寒機制研究對促進培育抗寒核桃新品種有重要意義。

核桃(JuglansregiaL.)，為胡桃科胡桃屬的落葉喬木，分布和栽培遍及世界多個國家和地區(qū)，是重要的木材樹種、生態(tài)樹種、經(jīng)濟樹種和生物能源樹種。核桃是喜溫樹種，適宜生長的溫度范圍是年均溫 9～16 ℃，極端最低氣溫-25 ℃[22]。由于核桃自身特性，低溫脅迫對核桃的生長發(fā)育是一個限制因子。特別是晚霜，使核桃的組織器官受凍，影響產(chǎn)量，甚至使核桃絕收。目前為止，關于核桃的研究主要集中在栽培、物理防寒等方面，用分子水平來提高核桃抗寒性還未見報道。本研究通過核桃低溫脅迫下高通量轉錄組測序及RT-PCR技術分析并克隆得到核桃中ICE同源基因，并對其進行了理化性質、蛋白性質、種間同源基因比對及系統(tǒng)進化等生物信息學分析及轉錄表達分析，旨在為培育核桃耐低溫新品種，為研究ICE基因在核桃中的低溫響應機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料是種植于河北農業(yè)大學標本園的2 a生盆栽核桃(JuglansregiaL.)，為同一株砧木上嫁接“遼寧8號”(耐低溫)和“清香”(不耐低溫)[23]的共計20株嫁接苗。試驗材料分為正常組(冷處理0 h)和0.5 ℃(冷處理48 h)，正常組和冷處理組各處理10株嫁接苗。低溫處理48 h后采集每株第1片復葉上第2片單葉送至北京諾禾致源科技股份有限公司用于RNA-Seq測序，3次重復。其中，研究JrICE1在不同組織表達的供試材料為河北農業(yè)大學標本園“清香”核桃，分別采集其根、嫩莖(4月26日)、嫩葉(4月26日)、雄花、雌花、老葉(7月15日)組織，采集后液氮速凍，送至北京諾禾致源科技股份有限公司用于RNA-Seq測序，3次重復。

1.2 核桃ICE1基因的分子克隆

該研究通過轉錄組測序[padj<0.05 and log2(golden change>0)]及利用RT-PCR技術結合分析并克隆得到核桃中1個ICE1同源基因。核桃JrICE1全長克隆引物序列,見表1。

由表1可知，找到其全長序列并設計引物，以核桃葉片cDNA為模板擴增出基因的編碼序列。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，將符合預期片段大小的片段回收連接pMD18-T載體上由上海生工公司完成DNA測序。

1.3 核桃ICE基因的生物信息學分析

采用NCBI中Blast進行序列的查找與分析，利用ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov /orffnder/)查找ICE基因的ORF并完成核苷酸的翻譯。利用NCBI中的Conserved Domain(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預測該基因的保守區(qū)域；利用在線分析工具Gene Structure Display Server預測基因結構；利用蛋白質的理化性質使用ExPASy (https://web.expasy.org/ protparam/)在線網(wǎng)站分析；利用PSIPRED(http://bioinf.cs. ucl.ac.uk /psipred)分析蛋白的二級結構，利用NetPhos 3.1 Server和Net NGlyc 1.0 Server分別預測蛋白的糖基化和磷酸化位點；利用 SignalP 3.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)在線工具對信號肽預測；利用TMHMM 法分析蛋白質的跨膜區(qū)：基于 HMM 方法(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)的蛋白質跨膜區(qū)預測工具；利用ngLOC與Nuc-PLoc在線軟件預測亞細胞定位。利用DNAMAN8.0對其氨基酸進行多序列同源比對；利用MEGA 7.0構建ML系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 核桃JrICE1基因克隆

根據(jù)設計的引物，以核桃葉片總RNA反轉錄的cDNA為模板，進行PCR擴增后，產(chǎn)物經(jīng)1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示1條1 000～2 000 bp 的特異性條帶(圖1)，與預期一致。測序結果見圖2，經(jīng) NCBI 數(shù)據(jù)庫檢索分析(表2)，比對得到1條全長基因序列。經(jīng)NCBI的ORF進行開放閱讀框分析1 659 bp 全長序列，編碼552個氨基酸，命名為JrICE1。

表2 核桃JrICE1基本信息Table 2 Basic information of the JrICE1 in walnut

圖1 核桃JrICE1基因的PCR擴增Figure 1 PCR amplification of the JrICE1 gene in walnut注: 泳道1是DL 2 000 DNA Marker; 泳道2是JrICE1 全長。

將上述回收基因片段送至生工生物工程股份有限公司測序，測序結果見圖2。

2.2 核桃JrICE1的生物信息分析

利用ExPasy對基因的等電點(pI)、蛋白大小(kDa)等蛋白理化性質進行預測，見表3。

注: *終止密碼子。圖2 核桃JrICE1基因的 cDNA序列及其預測的氨基酸序列Figure 2 The cDNA sequence and its predicted amino acid sequence of walnut JrICE1 gene

表3 核桃JrICE1蛋白質理化性質和一級結構分析Table 3 Analysis of physicochemical properties and primary structure of protein of the walnut JrICE1

由表3可知，JrICE1等電點為5.73，偏酸性；蛋白的分子量為60.51 kDa；不穩(wěn)定系數(shù)為57.26，為不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為72.30，親水系數(shù)為-0.530，為親水性蛋白。

根據(jù)JrICE1測序獲得實際序列，利用NCBI在線分析軟件CD-SEARCH對核桃JrICE1蛋白質結構域預測分析見圖3。

圖3 核桃JrICE1保守結構域及位置Figure 3 Conserved domains and locations of the JrICE1

由圖3可知，發(fā)現(xiàn)該蛋白均包含bHLH結構，并且包含3個功能位點：DNA結合區(qū)域、E-box的特異性結合位點以及ACT結構位點，可以看出符合bHLH家族類型特點。此外，該蛋白還有1個與磷酸絲氨酸磷酸化酶相關基因結合的位點。

利用Net NGlyc 1.01.0預測蛋白的糖基化見圖4。

由圖4可知，發(fā)現(xiàn)JrICE1蛋白有2個糖基化位點(位置分別為：131和335)；在JrICE1蛋白發(fā)現(xiàn)60個磷酸化位點(絲氨酸45個、蘇氨酸12個、酪氨酸3個)；該蛋白存在多個蛋白激酶結合位點(細胞周期蛋白依賴性激酶I(CKI)、細胞周期蛋白依賴性激酶II(CKII)、胰島素受體(INSR)、蛋白激酶A (PKA)、蛋白激酶C (PKC)、蛋白激酶G (PKG)、ATM激酶、細胞周期素依賴蛋白激酶5 (CDK5)、細胞分裂周期激酶2 (CDC2)、DNA依賴性蛋白激酶(DNAPK)、促分裂素原活化蛋白激酶(6p38 MAPK)、糖原合成酶激酶3 (GSK3)等12個。

利用SignalP 3.0 Server在線工具對JrICE1蛋白的信號肽進行分析，發(fā)現(xiàn)JrICE1蛋白沒有信號肽(圖4-c)，推測該蛋白為非分泌蛋白；基于HMM方法的蛋白質跨膜區(qū)預測(參見圖4-d)，預測JrICE1蛋白均不存在跨膜結構域；利用蛋白質二級結構預測在線工具PSIPRED對JrICE1蛋白二級結構預測(圖4-e)，發(fā)現(xiàn)JrICE1有9處螺旋結構。利用Nuc-PLoc在線軟件分析得出，JrICE1蛋白位于細胞核。分析JrICE1蛋白的三級結構，結果顯示存在螺旋、折疊等結構(圖4-e)。

2.3 核桃JrICE1蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析

利用DNAMAN 8軟件對核桃JrICE1蛋白序列與其他15種植物進行比對，見圖5。

如圖5可知，核桃和其他植物一樣具有bHLH基因家族的典型功能區(qū)域，包括富S區(qū)(A)、NLS區(qū)(B)、bHLH結構域(B+C)，下游含轉膜區(qū)(E)，且在bHLH結構域高度保守，其他區(qū)域還有部分變異，但是僅有JrICE1含有類泛素化(SUMO)結合位點(D)。

利用MEGA7.0軟件，建立16種植物ICE蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，并通過MEME在線分析軟件分析15種植物的保守基序，結果見圖6。

由圖6可知，核桃JrICE1與毛果楊(Populustrichocarpa)、甜楊(Populussuaveolens)關系最近。

注: PtICE1(毛果楊，Populus trichocarpa，ABN58427.1)；HvICE2(大麥，Hordeum vulgare，ABA25897.1)；AtiICE1(節(jié)節(jié)麥，Aegilops tauschii，EMT15292.1)；AtICE1(擬南芥，Arabidopsis thaliana，AAP14668.1)；TaICE87(小麥，Triticum aestivum，ACB69502.1)，TuICE1(烏拉圖小麥，Triticum urartu，EMS66007.1)；OSICE1(水稻，Oryza sativa，NP_001045272.1)；BrsICE1(大白菜，Brassica rapa subsp. Chinensis，ACB70963.1)ZmICE2(玉米，Zea mays，ACG46593.1)；GmICE1(大豆，Glycine max，NP_001238560.1)；SlICE1(番茄，Solanum lycopersicum，AGG38826.1)；MdbHLH1(蘋果，Malus domestica, ABS50251.1)。

注: A是系統(tǒng)進化樹和基序；B是10個保守基序。

2.4 基于RNA-Seq核桃JrICE1基因轉錄表達分析

基于RNA-Seq核桃JrICE1基因轉錄表達分析，見圖7。

注: QCK是清香對照；Q48是清香48 h低溫；LCK是遼寧8號對照；L48是遼寧8號48 h低溫。

由圖7可知，利用轉錄組分析JrICE1在“遼寧8號”(耐低溫)和“清香”(不耐低溫)低溫脅迫48 h后中的表達模式表明，JrICE1在“遼寧8號”葉片呈現(xiàn)顯著上升，比對照上升0.53倍；JrICE1在“清香”葉片呈現(xiàn)顯著上升，比對照上升4.5倍。

利用轉錄組分析JrICE1在“清香”核桃不同組織中的表達情況，結果見圖8。

注: Y是芽；NY是嫩葉；NJ是嫩莖；XH是雄花；CH是雌花；G是根；LY是老葉。

由圖8可知，JrICE1在“清香”核桃的芽、嫩葉、嫩莖、雄花、雌花、根、老葉中都有表達，其中表達量最高的是雌花，表達量最低的是雄花，其次是老葉、芽、嫩莖、嫩葉和根，暗示了JrICE1可能在雄花器官中起到更加重要的作用。

3 討論

植物在生長的過程中，往往會受到生物脅迫或者非生物脅迫，嚴重影響植物的生長發(fā)育，植物需要自身抗逆的調節(jié)來應對脅迫維持自身正常生長。有研究表明，ICE1基因可以調控冷反應基因，使植物抵御寒冷的逆境環(huán)境[6]。本研究通過同源克隆與RNA-Seq結合的方式，在核桃葉片中分離出ICE基因，通過進化分析表明核桃JrICE1與毛果楊(Populustrichocarpa)、甜楊(Populussuaveolens)關系最近。JrICE1在蛋白序列比對表明含有GAQPTLFQKRA這11個保守的氨基酸序列(圖5)，這與Mohamed[24]等人研究一致。JrICE1具有1 659 bp的完整開放閱讀框，且蛋白是一種偏酸性的不穩(wěn)定親水蛋白，亞細胞定位于細胞核，這和已研究的其他植物相似[12-13,24]。利用NCBI中的Conserved Domian-Search預測保守結構域，發(fā)現(xiàn)該基因包含bHLH結構，并且包含3個功能位點：DNA結合區(qū)域、E-box的特異性結合位點以及ACT結構位點，結果表明符合bHLH家族類型特點，并屬于核桃ICE基因，證明了基因克隆的準確性。核桃JrICE1與已報道其他典型植物的ICE序列比對，發(fā)現(xiàn)JrICE1上游含有富含二硫鍵的S區(qū)(圖5-A)，主要是維持基因的穩(wěn)定性[25]。通過NLS區(qū)(圖5-B)和轉膜區(qū)(圖5-E)保證蛋白轉運到細胞核，而且JrICE1含有一個類泛素化(SUMO)結合位點，這與已報道的甜楊[3]、忍冬[12]、火龍果[24]結構相似，研究表明符合核桃ICE1作為轉錄因子特性。

已有研究報道，在擬南芥[6]、煙草[26]、水稻[27]、番茄[28]中證實了ICE可以正調控植物的抗寒性。在本研究中，將“遼寧8號”(耐低溫)和“清香”(不耐低溫)低溫(0.5 ℃)脅迫48 h后通過葉片轉錄組測序表明，JrICE1表達呈現(xiàn)顯著上升，說明JrICE1在核桃中主要起正調控作用；不同組織轉錄表達分析表明，JrICE1在葉與花器官中轉錄表達較高，而且在不同組織中均有表達，說明JrICE1在核桃生長發(fā)育中具有重要功能，但具體的調控機制還有待于進一步研究。

4 結論

本研究利用同源克隆與轉錄組測序技術結合的方法，克隆了核桃中ICE同源基因，并進一步對其進行生物信息分析及轉錄表達分析。結果表明：JrICE1的 CDS序列全長為1 659 bp，最大開放閱讀框1 659 bp，編碼552個氨基酸。JrICE1蛋白為不穩(wěn)定親水性蛋白，理論等電點5.73。同源比對發(fā)現(xiàn)JrICE1蛋白具有bHLH基因家族的典型功能區(qū)域，且在bHLH結構域高度保守。通過進化分析表明核桃JrICE1與毛果楊(Populustrichocarpa)、甜楊(Populussuaveolens)關系最近?！斑|寧8號”(耐低溫)和“清香”(不耐低溫)低溫脅迫48 h后葉片轉錄組測序結果分析表明，JrICE1在“遼寧8號”和“清香”葉片中表達均顯著上升，說明JrICE1在核桃響應低溫脅迫的過程中主要發(fā)揮正調控作用。不同組織轉錄表達分析表明，JrICE1在不同組織中均有表達，在葉與花器官中轉錄表達水平較高，說明JrICE1在核桃生長發(fā)育過程具有重要功能。以上研究說明ICE基因可能在核桃的生長發(fā)育特別是應對低溫脅迫中起著重要作用。本研究為揭示JrICE1在核桃低溫脅迫響應過程中的功能提供參考，為解析核桃低溫響應機制，培育核桃耐低溫品種奠定基礎。