田琳，王鑫，李明陽，劉冬云

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與旅游學(xué)院，河北 保定 071000)

野生鐵線蓮為毛茛科(Ranunculaceae)鐵線蓮屬(Clematis)多年生草本或木質(zhì)藤本，少數(shù)為直立灌木，分布于世界各地，以熱帶及亞熱帶地區(qū)居多，全世界約有300余種，我國有140種[1]。鐵線蓮花期長，花色豐富且花型新穎，素有“藤本皇后”的美稱，具有較高的園林應(yīng)用前景，可做垂直綠化和地被用[2]。

我國野生鐵線蓮植物資源豐富，河北省鐵線蓮屬植物有15種2變種，但目前國內(nèi)市場上多為來自歐洲的栽培品種[3]。該屬植物以種子繁殖為主，但多需要經(jīng)過春化作用才能萌發(fā)，種子在自然狀態(tài)下萌發(fā)困難，有些雜交種的種子甚至需要3 a才能萌發(fā)[4]。同時，國內(nèi)有關(guān)野生鐵線蓮屬植物繁殖技術(shù)的研究較少，主要集中在種質(zhì)資源調(diào)查與分類等方面，不利于該屬植物在園林中的應(yīng)用[5]。黃花鐵線蓮(ClematisintricataBunge)、灌木鐵線蓮(ClematisfruticosaTurcz.)短尾鐵線蓮、(ClematisbrevicaudataDC.)和粗齒鐵線蓮[Clematisargentilucida(Lévl. et Vant.) W. T. Wang]，較其他鐵線蓮萌發(fā)困難、種子萌發(fā)時間長，園林觀賞價值高。因此，以4種野生鐵線蓮屬植物種子為材料，研究不同激素、浸種溫度及貯藏方式處理對種子萌發(fā)的影響，初步確定提高其種子發(fā)芽率的方法，以期為野生鐵線蓮屬植物引種栽培、資源保存及推廣應(yīng)用等提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試種子均為野生狀態(tài)下采集，供試材料及采集信息見表1。

表1 試驗材料來源Table 1 Source of test materials

1.2 方法

1.2.1 種子形態(tài)觀察參考 《中國植物志》[6]及《中國植物種子形態(tài)學(xué)研究方法和術(shù)語》[7]中的描述方法對種子形態(tài)進行觀察描述。隨機選取4種鐵線蓮屬植物成熟種子各30粒，觀察其外形特征，使用游標(biāo)卡尺測量種子長、寬及厚度。

1.2.2 不同激素處理對種子萌發(fā)的影響 試驗前種子用30%的H2O2消毒30 min，用蒸餾水沖洗3次，再將種子分別置于10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L的GA3溶液和10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L、160 mg/L的6-BA溶液中浸種24 h，清水作為對照。取出種子后均勻播種至比例為3∶1的細(xì)草炭和珍珠巖的基質(zhì)中。播種后每天澆水，定期觀察種子發(fā)芽情況，待第1顆種子發(fā)芽后，每天記錄種子發(fā)芽數(shù)直至發(fā)芽結(jié)束，以連續(xù)5 d沒有種子發(fā)芽作為發(fā)芽結(jié)束標(biāo)志。每處理30粒種子，每種處理3次重復(fù)。

1.2.3 不同浸種溫度對種子萌發(fā)的影響 試驗前種子用30%的H2O2消毒30 min，用蒸餾水沖洗3次，再將種子分別置于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃的恒溫水浸種24 h。取出種子后均勻播種至比例為3∶1的細(xì)草炭和珍珠巖的基質(zhì)中。培養(yǎng)條件同1.2.3。每試驗組處理30粒種子，每種處理3次重復(fù)。

1.2.4 不同貯藏方式對種子萌發(fā)的影響 試驗前種子用30%的H2O2消毒30 min，用蒸餾水沖洗3次，再將種子分別置于常溫貯藏、4 ℃冷藏、-20 ℃冷凍、4 ℃層積沙藏、地窖層積沙藏各60 d。將處理后的種子均勻播種至比例為3∶1的細(xì)草炭和珍珠巖的基質(zhì)中。培養(yǎng)條件同1.2.3。每試驗組處理30粒種子，每種處理3次重復(fù)。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

種子千粒重和相對含水量測定。隨機選取顆粒飽滿的健康種子各100粒，重復(fù)8次，取平均值后擴大10倍得千粒重。

每種種子隨機稱取2 g，均勻置于鋁盒中，于105 ℃烘箱烘2 h，冷卻干燥后稱量，重復(fù)3次，計算種子的相對含水量。

"現(xiàn)代觀賞石審美標(biāo)準(zhǔn)被界定為：形、質(zhì)、色、紋、韻及命名、配座、傳承八大要素，極大地擴展了觀賞石的現(xiàn)代審美范疇。"

種子相對含水量=(W2-W3)/(W2-W1)×100%

(1)

式中，W1為鋁盒和盒蓋重量，W2為鋁盒和盒蓋及樣品的烘前重量，W3為鋁盒和盒蓋及樣品的烘后重量。

發(fā)芽率=種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100%

(2)

發(fā)芽勢=規(guī)定時間內(nèi)種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100%

(3)

發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt

(4)

式中，Gt為在時間t日的發(fā)芽種子個數(shù);Dt為相應(yīng)的發(fā)芽日數(shù)，試驗結(jié)果用Excel和SPSS 22軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種鐵線蓮屬植物種子外觀形態(tài)

掌握種子外觀形態(tài)有助于種質(zhì)鑒別和野外采集。4種鐵線蓮種子外形特征見表2。

表2 種子外觀形態(tài)Table 2 Seed appearance morphology

由表2可見，4種鐵線蓮種子外形相似，均為瘦果，宿存花柱。但大小各不相同，灌木鐵線蓮種子較大，長、寬均大于其他種子。粗齒鐵線蓮與黃花鐵線蓮長度無顯著差異，但寬、厚均顯著高于黃花鐵線蓮(P<0.05)。短尾鐵線蓮種子較小，長、寬均顯著小于其他3種鐵線蓮，厚度較小，呈凸起狀(P<0.05)。

2.2 4種鐵線蓮屬植物種子千粒重和含水量測定

種子千粒重是體現(xiàn)種子質(zhì)量的一個主要指標(biāo)，用以說明種子飽滿程度。一般種子質(zhì)量大的種子具有豐富的貯藏物質(zhì)，為種子萌發(fā)提供充足的營養(yǎng)和能量。4種鐵線蓮種子千粒重均差異顯著(P<0.05)，灌木鐵線蓮、粗齒鐵線蓮種子較大，分別為4.264 6 g和4.355 9 g，黃花鐵線蓮次之，平均1.518 8 g，短尾鐵線蓮最小，平均僅有1.145 1 g。種子含水量是影響種子萌發(fā)和種子壽命的重要因素。黃花鐵線蓮相對含水量最高，為7.88%，短尾鐵線蓮次之，為7.45%，粗齒鐵線蓮和灌木鐵線蓮含水量較低，分別為5.00%和4.62%。

表3 種子千粒重和含水量Table 3 Kilograin weight and water content of seeds

2.3 激素對4種鐵線蓮種子萌發(fā)的影響

不同激素處理對4種鐵線蓮屬植物種子萌發(fā)的影響見表4。

表4 不同激素處理對4種鐵線蓮屬植物種子萌發(fā)的影響Table 4 Effects of different hormone treatments on the germination characteristics of four species of Clematis

由表4可知，不同濃度的激素處理對4種鐵線蓮種子萌發(fā)影響不同。GA3溶液在0～400 mg/L范圍內(nèi)，黃花鐵線蓮種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均呈下降趨勢。隨6-BA濃度的增加，黃花鐵線蓮種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)變化無明顯規(guī)律，但均高于對照。各處理中， 10 mg/L GA3溶液為黃花鐵線蓮最適激素濃度，發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均最高，與對照相比差異顯著(P<0.05)。

灌木鐵線蓮隨GA3及6-BA濃度逐漸增加，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)基本呈先上升后下降趨勢。GA3濃度達(dá)50 mg/L或6-BA濃度達(dá)80 mg/L時，灌木鐵線蓮種子發(fā)芽率達(dá)64.45%和53.33%。由此可見，50 mg/L GA3處理下發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)最高。

當(dāng)GA3濃度逐漸提高，短尾鐵線蓮種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)呈下降趨勢。而隨6-BA濃度增加，短尾鐵線蓮發(fā)芽率及發(fā)芽勢呈上升趨勢。低濃度GA3和高濃度6-BA處理的促進效果明顯。GA3濃度為10 mg/L時，短尾鐵線蓮種子發(fā)芽率達(dá)最大值55.56%，同時，該處理下種子發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)顯著高于其他處理(P<0.05)。

粗齒鐵線蓮在自然條件下發(fā)芽困難，發(fā)芽率極低，僅2.22%。低濃度GA3溶液處理對粗齒鐵線蓮的促進效果明顯，GA3濃度為10 mg/L時，發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)分別是對照的10.01倍、13.01倍和2.04倍。各濃度6-BA對粗齒鐵線蓮種子的萌發(fā)促進作用不明顯，6-BA濃度為80 mg/L時，粗齒鐵線蓮種子發(fā)芽率較高，是對照的7.51倍。由此可見，粗齒鐵線蓮種子萌發(fā)的最適處理是10 mg/L GA3溶液。

2.4 浸種溫度對4種鐵線蓮種子萌發(fā)的影響

不同浸種溫度對4種鐵線蓮屬植物種子萌發(fā)的影響見表5。

表5 不同浸種溫度對4種鐵線蓮屬植物種子萌發(fā)的影響Table 5 Effects of soaking seeds under different water temperatures on the germination characteristics of four species of Clematis

由表5可知，隨著浸種溫度的升高，黃花鐵線蓮種子發(fā)芽率呈先增后降的趨勢。在25 ℃溫水浸種處理下，種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)最高，分別為55.55%、2.94。15～30 ℃溫水處理下，黃花鐵線蓮種子的發(fā)芽勢無顯著差異(P>0.05)。各處理中，25 ℃為黃花鐵線蓮種子浸泡的適宜水溫。

對于灌木鐵線蓮而言，種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢在15～30 ℃之間出現(xiàn)波動變化，但變化不明顯。30 ℃時發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均最高，分別為41.11%、23.33%和2.30。故灌木鐵線蓮浸種的適宜水溫為30 ℃。

短尾鐵線蓮種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢隨著浸種溫度的升高呈先上升后下降的趨勢。20 ℃溫水浸種處理時短尾鐵線蓮種子發(fā)芽率為45.55%、發(fā)芽勢為38.89%、發(fā)芽指數(shù)為3.50，各項指標(biāo)都最高。較低的浸種溫度可以提高短尾鐵線蓮種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢，以20 ℃處理下種子發(fā)芽率情況最好。

水溫過高不利于粗齒鐵線蓮種子萌發(fā)，隨著浸種溫度的升高，種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均呈下降的趨勢。15 ℃浸種處理下粗齒鐵線蓮種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)最高，分別為25.56%、13.33%和1.58?？梢?，粗齒鐵線蓮浸種溫度以15 ℃最佳。

2.5 貯藏方式對4種鐵線蓮種子萌發(fā)的影響

不同貯藏方式對4種鐵線蓮屬植物種子萌發(fā)的影響見表6。

表6 不同貯藏方式對4種鐵線蓮屬植物種子萌發(fā)的影響Table 6 Effects of different storage methods on the germination characteristics of four species of Clematis

由表6可知，黃花鐵線蓮種子在不同貯藏方式處理下，各發(fā)芽指標(biāo)均表現(xiàn)出較大差異，經(jīng)過地窖層積沙藏處理的種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)最高，分別為51.11%、37.78%和4.29。常溫貯藏、4 ℃冷藏，-20 ℃冷凍和4 ℃層積沙藏的種子發(fā)芽率分別為37.78%、33.33%、26.67%和36.67%，差異均未達(dá)顯著水平(P>0.05)。可見，黃花鐵線蓮最佳貯藏方式為地窖層積沙藏。

灌木鐵線蓮種子經(jīng)4 ℃層積沙藏60 d后，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)最高，分別為78.89%、70.00%和7.10， 與常溫貯藏相比差異顯著(P<0.05)。常溫貯藏、4 ℃冷藏和-20 ℃冷凍對該種子發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)無顯著影響(P>0.05)?？梢?，4℃層積沙藏可有效打破灌木鐵線蓮種子休眠。

5種貯藏方式對短尾種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)影響不同。短尾鐵線蓮種子經(jīng)地窖層積沙藏60 d發(fā)芽率最高，達(dá)38.89%，經(jīng)-20 ℃冷凍和4 ℃層積沙藏后，發(fā)芽率分別為32.22%、28.89%，常溫貯藏及4 ℃冷藏時，發(fā)芽率僅17.78%、14.44%。故短尾鐵線蓮種子收獲后可采用地窖層積沙藏處理，提高發(fā)芽率。該處理下，短尾鐵線蓮種子發(fā)芽率(38.89%)、發(fā)芽勢(35.56%)和發(fā)芽指數(shù)(3.84)均顯著高于常溫貯藏(P<0.05)。

粗齒鐵線蓮種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢經(jīng)過4 ℃層積沙藏(51.11%、34.44%)和地窖層積沙藏(53.33%、28.89%)明顯大于常溫貯藏(40.00%、3.33%)、4 ℃冷藏(38.89%、5.56%)和-20 ℃冷凍(31.11%、4.44%)。經(jīng)地窖層積沙藏后的種子發(fā)芽指數(shù)為2.69，顯著高于4 ℃層積沙藏(2.05)(P<0.05)。說明地窖層積沙藏處理下粗齒鐵線蓮種子發(fā)芽情況最好。

3 結(jié)果與討論

試驗結(jié)果表明，10 mg/L的GA3可以有效提高黃花鐵線蓮、短尾鐵線蓮及粗齒鐵線蓮種子的發(fā)芽率，發(fā)芽率分別為55.89%、55.56%和22.22%，50 mg/L GA3是灌木鐵線蓮種子發(fā)芽的最適濃度，發(fā)芽率為64.45%。黃花鐵線蓮適宜浸種水溫為25 ℃，灌木鐵線蓮最適浸種水溫為30 ℃，短尾鐵線蓮最適浸種水溫為20 ℃，粗齒鐵線蓮種子萌發(fā)適宜水溫為15 ℃，發(fā)芽率分別為55.55%、45.55%、25.56%和41.11%。沙藏對4種鐵線蓮種子萌發(fā)有明顯促進作用，黃花鐵線蓮、短尾鐵線蓮和粗齒鐵線蓮的最適貯藏條件為地窖層積沙藏，發(fā)芽率分別為51.11%、38.89%和51.11%，灌木鐵線蓮的最適貯藏條件為4 ℃層積沙藏，發(fā)芽率為78.89%。從試驗結(jié)果來看，激素處理、溫水浸種和層積沙藏均能顯著提高黃花鐵線蓮種子發(fā)芽率，因此在種子萌發(fā)過程中可以3種方式結(jié)合使用。經(jīng)激素浸種后短尾鐵線蓮種子發(fā)芽率顯著高于溫水浸種和層積沙藏處理，在種子萌發(fā)過程中可使用激素處理。對于灌木鐵線蓮及粗齒鐵線蓮，層積沙藏較溫水浸種和激素處理效果顯著，在實際育種過程中種子收獲后可以采用層積沙藏提高種子發(fā)芽率。

影響種子萌發(fā)的因素較多，其中大多數(shù)是由于種子的自身原因?qū)е滦菝?，通過人工打破休眠可以有效解除休眠并促進種子萌發(fā)[8-9]。植物外源激素通過影響種子生理代謝過程，解除種子休眠從而促進種子快速萌發(fā)，GA3可誘導(dǎo)水解酶的產(chǎn)生，降解種子內(nèi)部的貯藏物質(zhì)，促進種子萌發(fā)[10]。毛蕊鐵線蓮最適宜的GA3濃度為200 mg/L[11]，短柱鐵線蓮的最適濃度為50 mg/L[12]，霧靈香花芥種子在赤霉素濃度為400～500 mg/L時發(fā)芽率最高[13]。山木通最適宜的6-BA濃度為30 mg/L[14]，大花銀蓮花種子在6-BA濃度為300 mg/L時發(fā)芽率最高[15]。低濃度赤霉素對促進4種野生鐵線蓮種子發(fā)芽率的效果更為顯著，GA3較6-BA更適宜4種野生鐵線蓮種子萌發(fā)，這與大葉鐵線蓮、齒葉鐵線蓮[15]及粉綠鐵線蓮[16]研究結(jié)果相似。溫水浸種可以軟化種皮增強吸水能力，稀釋降低發(fā)芽抑制物，有效提高種子發(fā)芽率[17]。黎彩霞對毛蕊鐵線蓮種子萌發(fā)的研究結(jié)果表明，20 ℃溫水浸種后種子發(fā)芽率顯著提高[11]，大葉鐵線蓮在25 ℃溫水浸種后發(fā)芽率最高[15]。因此，溫水浸種起到與激素相似的促進效果，但溫度過低不利于種子萌發(fā)所需營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，溫度過高可能會破壞種胚營養(yǎng)物質(zhì)活性，降低發(fā)芽率[18]。本試驗中，溫度達(dá)35 ℃時，4種種子發(fā)芽率下降明顯。室溫貯藏嚴(yán)重影響種子發(fā)芽率，主要原因是由于空氣的干燥，種子呼吸作用促使種子營養(yǎng)物質(zhì)消耗增加，剩余的營養(yǎng)物質(zhì)不能支持種子的萌發(fā)[19]。王澤等對梭梭種子的研究表明，4 ℃貯藏方式可延緩種子活力的降低幅度，這是由于自然溫度條件中的濕度變化較大，而冰箱中的濕度比較穩(wěn)定[20]。陳文認(rèn)為，層積沙藏可以增加種皮透性，加速種子內(nèi)部新陳代謝、促進赤霉素和細(xì)胞分裂素等激素的合成，降解或轉(zhuǎn)化脫落酸等抑制激素，同時促進胚的代謝、生長過程所利用的物質(zhì)如蔗糖、可溶性總糖和蛋白質(zhì)等合成，加速種子萌發(fā)[21]。本研究可為之后鐵線蓮屬植物提供最適種子發(fā)芽處理的方法，為提高鐵線蓮種子發(fā)芽率提供了參考。此外，鐵線蓮種子萌發(fā)也會在一定程度上受種子原產(chǎn)地、光照及其他生長調(diào)節(jié)劑的影響，具體影響有待進一步試驗探討。