piggyBac轉(zhuǎn)座子AgoPLE1.1在黑腹果蠅種系轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用

張浩淼, 王曉芳, 羅光華, 韓湘豫, 王秋霞, 韓召軍, 吳 敏,*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 南京 210095; 2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 南京210014)

在轉(zhuǎn)基因研究中發(fā)揮重要作用的DNA轉(zhuǎn)座子有果蠅Drosophila的P因子、Tc1/Mariner家族的Minos、hAT家族的Hermes、Mariner家族的Mos1和piggyBac轉(zhuǎn)座子(PB)家族的IFP2。研究表明，果蠅P因子在天然宿主以外的生物中沒有活性(O′Brochta and Atkinson,1996)；Tc1/Mariner家族轉(zhuǎn)座子不僅轉(zhuǎn)座頻率較低(Drabeketal., 2003)，并且其攜帶外源基因的能力有限(Dingetal., 2005)；Hermes因子轉(zhuǎn)化整合完整基因的精確度和可靠性有問題(Sarkaretal., 1997)。只有PB家族的IFP2因子，不但能夠在生物染色體中精確地剪切和轉(zhuǎn)座，能夠攜帶較大的外源基因，而且具有廣泛的適用范圍。事實(shí)證明，PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)不僅在半翅目、鞘翅目、鱗翅目、雙翅目和膜翅目的幾十種昆蟲中實(shí)現(xiàn)了種系轉(zhuǎn)化，而且在真渦蟲、瘧原蟲、斑馬魚、大鼠、豬、人和小鼠等哺乳動物細(xì)胞體內(nèi)也實(shí)現(xiàn)了高效轉(zhuǎn)化(Handleretal., 1998; Horn and Wimmer, 2000; Loboetal., 2006; Carotietal., 2015)。由于PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的安全高效，該系統(tǒng)在細(xì)胞免疫療法中顯示出巨大的潛力，正在開發(fā)針對多種人類疾病的相關(guān)細(xì)胞，如人體誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)和人T細(xì)胞等的修飾(Kajietal., 2009; Nakazawaetal., 2009; Wangetal., 2018)；此外PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)可以與靶向基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9結(jié)合，提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)所敲入基因的持續(xù)表達(dá)能力(Chenetal., 2015; Chengetal., 2016)。綜上所述，PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)是一個非常具有應(yīng)用潛力的轉(zhuǎn)基因工具。

PB轉(zhuǎn)座子最初是從粉紋夜蛾Trichoplusiani中分離得到的真核生物DNA轉(zhuǎn)座子。經(jīng)基因組序列分析和同源基因克隆發(fā)現(xiàn)，PB轉(zhuǎn)座子廣泛分布于真菌、植物、尾索動物、甲殼動物、昆蟲、魚類、兩棲動物以及哺乳動物等生物的基因組中(Sarkaretal., 2003)。由于受宿主選擇壓的作用，PB轉(zhuǎn)座子大部分已經(jīng)發(fā)生了不同程度的變異，但仍有部分保留著完整結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)座酶活性，甚至轉(zhuǎn)座活性。Hikosaka等(2007)在爪蟾Xenopustropicalis中發(fā)現(xiàn)了一個具有天然剪切活性的TxpB_Uribo2因子；我們在棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、銀錠夜蛾Macdunoughiacrassisigna、小地老虎Agrotisypsilon和棉蚜Aphisgossypii中也發(fā)現(xiàn)了大量的PB類似因子，其中有些因子，例如棉蚜的AgoPLE1.1，不僅結(jié)構(gòu)完整，而且可以在果蠅S2細(xì)胞中進(jìn)行精確的剪切(Sunetal., 2008; Wuetal., 2008, 2011; Luoetal., 2011)。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，擬通過系列試驗(yàn)闡明AgoPLE1.1因子在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中的轉(zhuǎn)化活性及其轉(zhuǎn)座特點(diǎn)，探討該P(yáng)B類似因子AgoPLE1.1開發(fā)為新型昆蟲轉(zhuǎn)基因載體的可能性。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

黑腹果蠅W1118品系由東南大學(xué)發(fā)育與疾病相關(guān)基因?qū)嶒?yàn)室提供。黑腹果蠅用由玉米粉 50 g/L、酵母粉25 g/L、蔗糖110 g/L和瓊脂4 g/L做成的人工飼料飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)條件為溫度25±2℃，相對濕度60%～70%，光周期16L∶8D。

1.2 供試試劑

LA Taq DNA聚合酶, dNTP, DNA Marker和Genome Walking試劑盒都購自寶生物工程(大連)有限公司；凝膠純化試劑盒購自Axygen公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)mega公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自Qiagen公司；pEASY-T3 Cloning Kit和感受態(tài)細(xì)胞Trans5α購自北京全式金公司；限制性內(nèi)切酶購自Thermo公司; T4連接酶購自Promega公司；地高辛雜交檢測試劑盒Ⅱ(化學(xué)發(fā)光法)購自Roche公司。

1.3 轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建

將質(zhì)粒pBacHsp(由美國加州大學(xué)河邊分校T.A.Miller教授惠贈)用ApaⅠ和Pf123Ⅱ進(jìn)行雙酶切去除IFP2轉(zhuǎn)座酶序列，在AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座酶序列兩端加上ApaⅠ和Pf123Ⅱ酶切位點(diǎn)后與去除IFP2轉(zhuǎn)座酶的pBacHsp載體骨架相連接，構(gòu)成輔助質(zhì)粒pAgoHsp。 通過PCR擴(kuò)增將載體pXLBacII-PubDsRed(由美國農(nóng)業(yè)部Alfred M.Handler惠贈)上的IFP2的末端反向重復(fù)序列(ITR)替換成AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子的ITR序列，構(gòu)建供體質(zhì)粒pXLAgo-PUbDsRed。PCR反應(yīng)體系: 10×LA Taq Buffer 5 μL, 上下游引物(10 pmoL)各2.5 μL, dNTP Mixture 8 μL, 模板DNA 200 ng, TaKaRa LA Taq DNA聚合酶0.5 μL, 無菌水補(bǔ)足50 μL。PCR程序: 94℃預(yù)變性1 min; 98℃變性 10 s, 68℃退火 15 s, 72℃延伸2 min, 共30個循環(huán); 72℃ 10 min, 12℃保持。載體構(gòu)建引物見表1。分別提取無內(nèi)毒素的輔助質(zhì)粒和供體質(zhì)粒DNA，置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 黑腹果蠅的顯微注射

顯微注射的方法參考Spradling和Rubin(1982)。 用1.3節(jié)構(gòu)建好的輔助質(zhì)粒pAgoHsp和供體質(zhì)粒pXLAgo-PubDsRed DNA分別以170 ng/μL∶400 ng/μL, 90 ng/μL∶200 ng/μL和90 ng/μL∶100 ng/μL的濃度進(jìn)行混合，分別注射1 083, 1 000和1 023粒新鮮的W1118黑腹果蠅胚胎。將注射完成的胚胎放入培養(yǎng)箱。經(jīng)6～24 h培養(yǎng)后，把孵化出的幼蟲轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中飼養(yǎng)。每頭羽化出的成蟲分別與W1118黑腹果蠅回交，挑取后代中發(fā)出紅色熒光的個體即為轉(zhuǎn)基因黑腹果蠅。

1.5 Southern雜交

以供體質(zhì)粒pXLAgo-PubDsRed DNA為模板，在其3′端設(shè)計上游引物和下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系: 2×PrimeSTAR Max Premix 12.5 μL, 上下游引物(10 pmoL)各1 μL, 模板DNA 200 ng, 無菌水補(bǔ)足25 μL。PCR程序: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性 30 s, 52℃退火 30 s, 72℃延伸40 s, 共35個循環(huán); 72℃ 10 min, 12℃保持。獲得573 bp DNA片段的純化PCR產(chǎn)物。以純化后的573 bp DNA片段為模板，根據(jù)地高辛探針合成試劑盒步驟合成DNA探針。提取黑腹果蠅3個轉(zhuǎn)基因株系F1, F2和F3的基因組DNA，將10 μg基因組DNA用限制性內(nèi)切酶EcoRV完全酶切后用等體積酚∶氯仿抽提純化，進(jìn)行Southern雜交檢測，以供體質(zhì)粒pXLAgo-PubDsRed DNA作為陽性對照。用化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)掃描發(fā)光信號，曝光時間為3 h，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.6 轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)旁側(cè)序列的PCR擴(kuò)增

為了獲得AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子在黑腹果蠅基因組中插入位點(diǎn)的旁側(cè)序列，采用染色體步移技術(shù)根據(jù)供體質(zhì)粒pXLAgo-PubDsRed序列設(shè)計特異引物(表1)。以轉(zhuǎn)基因果蠅基因組DNA為模板，以Genome Walking試劑盒中提供的兼并引物與特異引物進(jìn)行熱不對稱PCR反應(yīng)，通過3次巢式 PCR 擴(kuò)增即可獲取AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的序列，將克隆的旁側(cè)DNA序列送至公司進(jìn)行序列測定后利用Genedoc軟件與供體質(zhì)粒pXLAgo-PubDsRed序列進(jìn)行比對分析，去除載體序列后在Flybase數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，明確AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)所在的黑腹果蠅的染色體。

表1 本研究所用引物

2 結(jié)果

2.1 AgoPLE1.1在黑腹果蠅中的轉(zhuǎn)化

將供體質(zhì)粒pXLAgo-PubDsRed和輔助質(zhì)粒pAgoHsp以400 ng/μL∶170 ng/μL, 200 ng/μL∶90 ng/μL和100 ng/μL∶90 ng/μL 3種不同的濃度混合，分別注射了1 083, 1 000和1 023粒新鮮W1118黑腹果蠅胚胎，3組胚胎分別孵化并羽化出成蟲(G0)155, 151和234頭；將羽化的每一頭成蟲分別單獨(dú)與W1118黑腹果蠅回交，3組中分別有138, 130和146對回交產(chǎn)生了后代(G1)，可育率分別是89.03%, 86.09%和62.39%。；3組可育后代中各篩選到1株轉(zhuǎn)基因果蠅，它們分別被命名為F1(2♂+1♀), F2(1♂+1♀)和F3(1♂+3♀)。這3個株系(F1, F2和F3)及其后代果蠅可在激發(fā)光波長下產(chǎn)生紅色熒光(圖1)。因此，AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子可以在黑腹果蠅中進(jìn)行種系的轉(zhuǎn)化，3次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因頻率分別為1.94%, 1.32%和1.71%。

圖1 AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因黑腹果蠅

2.2 AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子在黑腹果蠅染色體中的插入

Southern雜交結(jié)果表明，探針在陽性對照樣品中雜交獲得一條大小為7 kb左右的條帶，與供體質(zhì)粒pXLAgo-PubDsRedDNA 7 155 bp的大小相符；3個轉(zhuǎn)基因株系(F1, F2和F3)的果蠅各檢測到3個清晰的雜交條帶，F(xiàn)1和F2有一條大小一致的4.3 kb條帶，F(xiàn)2和F3有兩條大小一致的6.5和8.5 kb雜交條帶(圖2)。因此，3個株系的雜交條帶一共有6個，大小分別為3.9, 4.3, 6.5, 7.2, 8.5和9.4 kb，說明AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子在每個轉(zhuǎn)基因株系的黑腹果蠅中至少有3個插入位點(diǎn)。

圖2 AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因黑腹果蠅的Southern雜交分析

2.3 AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)旁側(cè)序列

為了進(jìn)一步驗(yàn)證AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子在黑腹果蠅染色體中的插入特性，我們利用染色體步移技術(shù)克隆獲得了轉(zhuǎn)基因果蠅中AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的旁側(cè)序列。通過與供體質(zhì)粒pXLAgo-PUbDsRed序列的比對，把轉(zhuǎn)座子供體序列與果蠅染色體序列進(jìn)行區(qū)分，并將染色體序列在Flybase數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對。結(jié)果表明，F(xiàn)1株系中AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子插入黑腹果蠅3R和2L染色體，F(xiàn)2株系中AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子插入3L和2L染色體，F(xiàn)3株系中AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子插入3L和X染色體。其次，插入位點(diǎn)的旁側(cè)序列表明，AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子在黑腹果蠅中的剪切和轉(zhuǎn)座是非精確的，與精確剪切相比，3個轉(zhuǎn)基因株系的AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子插入果蠅染色體時5′端缺失了256～612 bp不等，3′端整合了210～800 bp不等的供體質(zhì)粒序列(圖3)。

圖3 AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子插入黑腹果蠅染色體位點(diǎn)序列分析

3 討論

AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子是在棉蚜基因組中克隆的PB類似因子，AgoPLE1.1編碼完整的轉(zhuǎn)座酶并具有17 bp的末端反向重復(fù)序列(Luoetal., 2011)。前期的研究表明AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子具有開發(fā)為昆蟲轉(zhuǎn)基因載體的潛力，本研究率先在黑腹果蠅中檢測其轉(zhuǎn)化活性。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室顯微注射果蠅胚胎的經(jīng)驗(yàn)：輔助質(zhì)粒和供體質(zhì)粒不同的比例和濃度會影響DNA轉(zhuǎn)座子在宿主體內(nèi)的轉(zhuǎn)化頻率。因此，本研究將輔助質(zhì)粒pAgoHsp和供體質(zhì)粒pXLAgo-PubDsRed的DNA以170 ng/μL∶400 ng/μL, 90 ng/μL∶200 ng/μL和90 ng/μL∶100 ng/μL 3個不同的濃度比例進(jìn)行混合，并分別注射黑腹果蠅胚胎。結(jié)果表明，AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子在黑腹果蠅中具有種系轉(zhuǎn)化的活性，轉(zhuǎn)化頻率為1.32%～1.94%；AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子在黑腹果蠅染色體中的插入拷貝數(shù)大于等于3個；插入位點(diǎn)旁側(cè)序列揭示AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子在黑腹果蠅中的剪切和轉(zhuǎn)座是非精確的，不僅整合了供體質(zhì)粒的部分骨架，還缺失了AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子5′端部分的序列。該結(jié)果與AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子在果蠅S2細(xì)胞中精確剪切的試驗(yàn)結(jié)果(Luoetal., 2011)不一致。原因可能是AgoPLE1.1 轉(zhuǎn)座子在不同的細(xì)胞環(huán)境和活體環(huán)境中時，AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座酶活性產(chǎn)生差異，轉(zhuǎn)座酶對靶位點(diǎn)的識別作用會有不同，以及酶的剪切活性也會發(fā)生變化，從而導(dǎo)致AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座行為發(fā)生改變。據(jù)此推測，AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子可能具有較強(qiáng)的宿主因子的依賴性。

因此，與普遍應(yīng)用的PB轉(zhuǎn)基因載體IFP2相比，AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子不能夠像IFP2那樣在活體昆蟲中進(jìn)行“無縫切除”(Handleretal., 1998)，它不僅會攜帶有供體質(zhì)粒DNA序列，而且轉(zhuǎn)座子自身序列會產(chǎn)生不確定的缺失；其次，AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子在黑腹果蠅中的轉(zhuǎn)化頻率遠(yuǎn)低于IFP2在黑腹果蠅中的26%(Handler and Harrell, 1999)，AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子可能有較強(qiáng)的宿主因子依賴性?；谏鲜鎏卣鞯谋容^得出結(jié)論：AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座子不具有進(jìn)一步開發(fā)為高效的昆蟲轉(zhuǎn)基因載體的潛力，但是其在棉蚜體內(nèi)仍然保留有轉(zhuǎn)座活性的特點(diǎn)引起對PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的穩(wěn)定性和安全性的思考。已有文獻(xiàn)報道：hAT家族的hobo轉(zhuǎn)座子能夠與類似因子Hermes和Homer產(chǎn)生交互作用，引起轉(zhuǎn)基因的不穩(wěn)定現(xiàn)象(Sundararajanetal., 1999; Raphaeletal., 2004)。由于PB轉(zhuǎn)座子及其類似因子廣泛地存在于諸多生物體中，除了本研究已報道的活性因子AgoPLE1.1，Hikosaka等(2007)報道的爪蟾Xenopus中的一個具有天然剪切活性的TxpB_Uribo2因子外，Wu等(2011)還報道了一個IFP2高度類似因子McrPLE也具有剪切活性。這些報道只是眾多活性PB類似因子的冰山一角，盡管這些內(nèi)源PB轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活性較低，但是在應(yīng)用PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)進(jìn)行基因操作時，這些具有活性的內(nèi)源性PB類似因子也有可能對PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)介導(dǎo)的外源基因進(jìn)行切除或轉(zhuǎn)移，使轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生不確定的變異。因此，PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)和PB活性類似因子之間的交互識別作用是急需研究和解決的一個科學(xué)問題。