杜麗娜 陳春帆 蘇睿 譚春艷 賴彪

摘 ?要：為分析荔枝LcMYB1的功能，以白色‘W115矮牽牛和‘Micro-Tom番茄為材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將LcMYB1在矮牽牛和番茄中異源表達(dá)，觀測(cè)轉(zhuǎn)基因植株表型。結(jié)果表明：與‘W115相比，轉(zhuǎn)基因矮牽牛的葉片和花瓣中積累了花色苷，且矮牽?；ㄉ丈锖铣山Y(jié)構(gòu)基因PhCHS和PhDFR、調(diào)控基因PhAN1的表達(dá)顯著上調(diào);與野生型‘Micro-Tom番茄相比，轉(zhuǎn)基因番茄的葉片和花藥中積累了花色苷，且相應(yīng)組織花色苷生物合成結(jié)構(gòu)基因SlDFR、調(diào)控基因SlAN1和SlJAF13的表達(dá)顯著上調(diào)，雖然果實(shí)中沒有積累花色苷，但SlAN1和SlJAF13表達(dá)也顯著上調(diào)。LcMYB1在矮牽牛和番茄中異源表達(dá)時(shí)通過上調(diào)花色苷生物合成關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因bHLH的表達(dá)誘導(dǎo)花色苷積累。因此，荔枝LcMYB1是花色苷生物合成中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，具備異源轉(zhuǎn)化利用的潛力。

關(guān)鍵詞：LcMYB1;矮牽牛;番茄;花色苷

中圖分類號(hào)：S667.1 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： In order to better understand the function of LcMYB1 and provide theoretical support for further utilization， LcMYB1 was transformed into both petunia and tomato. White flower ‘W115 petunia and ‘Micro-Tom tomato were used as materials in LcMYB1 ectopic expressed assays. Anthocyanin contents and related gene expressions were ana-lyzed in transgenic plants. Ectopic expression of LcMYB1 in ‘W115 resulted in anthocyanin production in vegetative and floral tissues such as leaves and petals， probably by transcriptional activation of anthocyanin biosynthetic genes such as PhCHS and PhDFR and endogenous anthocyanin regulatory gene PhAN1. However， the transgenic tomato only produced anthocyanin in anthers and leaves but not in tomato fruits and petals. The results suggested that LcMYB1 could enhance anthocyanin production in vegetative and floral tissues of both petunia and tomato by activating anthocyanin biosynthesis and regulatory genes. LcMYB1 is an important transcriptional regulatory factor in anthocyanin biosynthesis of plants and is potentially used in ectopic transformation.

Keywords： LcMYB1; petunia; tomato; anthocyanin

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.013

色澤是花卉和果蔬的重要品質(zhì)組成之一?；ㄉ帐侵参锝M織或器官呈現(xiàn)出粉色、紅色、紫色甚至黑色的重要次生代謝成分之一?；ㄉ粘四芙o蔬菜、花卉、水果帶來鮮艷的顏色，還具有對(duì)生物和非生物脅迫給植物帶來傷害的保護(hù)作用，比如：紫外線照射、冷脅迫、干旱脅迫等[1-3]。大量研究表明，花色苷合成代謝的調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上[4]。轉(zhuǎn)錄因子R2R3-MYB、bHLH（basic Hlix-Loop-Hlix）和WD40相互作用形成MBW蛋白復(fù)合體，通過調(diào)控花色苷合成代謝的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)來調(diào)控植物花色苷的生物合成[5]。

蘋果（Malus domestica）中有2個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控果實(shí)花色苷的生物合成，其中MdMYB1主要調(diào)控光依賴的果皮著色[6]，而MdMYB10主要調(diào)控果肉的花色苷積累[7]。此外，在梨（Pyrus pyrifolia）[8]、山竹（Garcinia mangostana）[9]、楊梅（Myrica rubra）[10]等水果中也克隆到了調(diào)控果實(shí)花色苷生物合成的關(guān)鍵MYB類轉(zhuǎn)錄因子。這些花色苷生物合成的關(guān)鍵調(diào)控基因的發(fā)現(xiàn)為果實(shí)的遺傳改良提供重要的基因資源。

荔枝（Litchi chinensis）是我國南方重要的熱帶亞熱帶果樹，種質(zhì)資源豐富，果實(shí)色澤類型多樣。荔枝果皮的紅色是花色苷積累的結(jié)果，前期利用同源序列方法克隆了荔枝LcMYB1，并在煙草中超表達(dá)LcMYB1誘導(dǎo)了葉片和花瓣花色苷的積累[11]。本文將該基因在‘W115矮牽牛和‘Micro-tom番茄中超表達(dá)，進(jìn)一步研究LcMYB1的功能，為該基因作為基因工程育種的候選基因提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

實(shí)驗(yàn)所用的‘Micro-Tom番茄、‘W115矮牽牛（MYB轉(zhuǎn)錄因子PhAN2和PhAN4雙突變體）和根癌農(nóng)桿菌菌株AGL0由阿姆斯特丹大學(xué)Francesca M Quattrocchio和Ronald Koes研究小組饋贈(zèng)。pBI121-LcMYB1（圖1）質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 ?‘W115矮牽牛的遺傳轉(zhuǎn)化

取溫室生長狀態(tài)良好的‘W115植株葉片，表面消毒（70%酒精清洗30 s，10%次氯酸清洗10 min，然后用無菌水清洗4～5次），用無菌手術(shù)刀在超凈工作臺(tái)內(nèi)將準(zhǔn)備好的葉片切成1 cm× 1 cm的小方塊，放入準(zhǔn)備好的OD600為0.1的農(nóng)桿菌中侵染10 min。將侵染后的外植體取出，用滅菌濾紙吸收多余的農(nóng)桿菌后放入共培養(yǎng)培養(yǎng)基（1/2 MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L玉米素+2.0%蔗糖+1%葡萄糖）中。于25 ℃共培養(yǎng)2 d后將外植體轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基（1/2 MS+ 2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L玉米素+ 2%蔗糖+1%葡萄糖+250 mg/L頭孢霉素+100 mg/L卡那霉素）中，待出芽后將芽切下轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基（1/2 MS+2%蔗糖+1%葡萄糖+250 mg/L頭孢霉素+100 mg/L卡那霉素）中培養(yǎng)生根。

1.3 ?‘Micro-Tom番茄的遺傳轉(zhuǎn)化

取適量的‘Micro-Tom種子進(jìn)行表面消毒（70%酒精清洗2 min，10%次氯酸清洗10 min，然后用無菌水清洗4～5次），將消毒的種子播種于MS培養(yǎng)基中，待種子發(fā)芽長出葉子備用（大約10 d左右）。將一片子葉切成2段后轉(zhuǎn)移到準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌中侵染10 min，將侵染后的外植體取出，用滅菌濾紙吸收多余的農(nóng)桿菌后放入共培養(yǎng)培養(yǎng)基（1/2 MS+0.1 mg/L IAA+0.4 mg/L玉米素+2%葡萄糖+1.0 mmol/L MES）中。于25 ℃共培養(yǎng)2 d后將外植體轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基（1/2 MS+0.1 mg/L IAA+0.4 mg/L玉米素+2%葡萄糖+1.0 mmol/L MES+250 mg/L頭孢霉素+100 mg/L卡那霉素）中，待出芽后將芽切下轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基（1/2 MS+2%葡萄糖+1.0 mmol/L MES+250 mg/L頭孢霉素+100 mg/L卡那霉素）中培養(yǎng)生根。

1.4 ?花色苷含量測(cè)定

參照Wrolstad等[12]的方法，采用pH示差法測(cè)定矮牽牛和番茄各組織器官的花色苷含量，具體步驟為：分別取各組織0.1 g樣品于3 mL浸提液（甲醇∶水∶濃鹽酸=85∶12∶3）中，室溫避光充分浸提（約5～6 h）。Buffer 1：0.2 mol/L KCl-0.2 mol/L HCl（25∶67），pH=1;Buffer 2：1 mol/L NaAc-0.4 mol/L HCl（100∶150），pH 5。取0.5 mL浸提液分別加入2支試管中，然后分別加入2 mL的Buffer 1和Buffer 2，用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定530 nm吸光值。

根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算結(jié)果，花色苷含量（mg/g）= ?;其中5為稀釋倍數(shù)，3為提取液體積（mL），445.2為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量，29600為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾比吸收系數(shù)，0.1表示樣品質(zhì)量（g）。

1.5 ?RNA的提取與cDNA合成

使用Magen公司的Hipure Plant RNA Mini Kit試劑盒（具體方法參照說明書）進(jìn)行矮牽牛和番茄各組織器官樣品RNA的提取。使用DNase I（TaKaRa）消化RNA中殘留的DNA（具體方法參照說明書）。RNA的濃度測(cè)定和純度分析：取1 L RNA溶液稀釋至100 L，置于紫外核酸蛋白檢測(cè)儀上分別測(cè)定260、280和320 nm吸光值并計(jì)算OD260/OD280值。當(dāng)OD260/OD280值介于1.80～2.00之間時(shí)，RNA樣品用于下一步試驗(yàn)。總RNA樣品濃度按下列公式計(jì)算：RNA（ng/L）=OD260× 40 ng/L×100。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)總RNA的完整性，取2～3 L總RNA進(jìn)行1.2%（W/V）的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。以總RNA作為模板合成第一鏈cDNA，反轉(zhuǎn)錄采用TaKaRa的SuperScript One- Step RT-PCR System試劑盒，引物為Oligo（dT）15（Ta?KaRa）。cDNA的合成參照反轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行。

1.6 ?熒光定量PCR

Real-time PCR反應(yīng)在ABI QuantStudio 3 Real-time PCR System上進(jìn)行，引物見表1。反應(yīng)條件如下：95 ℃ 15 s;56 ℃ 15 s;72 ℃ 35 s;40個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析參考Wei等[13]的方法。運(yùn)用2?ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理[14]，計(jì)算出花色苷生物合成相關(guān)基因在不同樣品中的表達(dá)水平。以上所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)，每次實(shí)驗(yàn)以ddH2O為陰性對(duì)照。矮牽牛和番茄的內(nèi)參基因分別為PhEF1Α和Sl18SrRNA。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?轉(zhuǎn)LcMYB1基因矮牽牛表型觀測(cè)

研究中使用的白色‘W115矮牽牛是花色苷合成調(diào)控的關(guān)鍵MYB轉(zhuǎn)錄因子PhAN2和PhAN4的雙突變體，可避免矮牽牛自身MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)顏色形成的干擾。將重組質(zhì)粒pBI121-LcMYB1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌AGL0中后，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將LcMYB1轉(zhuǎn)入白色‘W115矮牽牛中。與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因矮牽牛的葉片變紅，花瓣變?yōu)闇\紫色（圖2A～圖2D）。LcMYB1超表達(dá)的葉子和花瓣均顯著積累花色苷，葉片中花色苷含量為0.02 mg/g，花瓣中花色苷含量為0.12 mg/g（圖2E）。說明LcMYB1異源表達(dá)可以誘導(dǎo)矮牽牛葉片和花瓣花色苷積累，一定程度上彌補(bǔ)了PhAN2和PhAN4的缺失。

2.2 ?轉(zhuǎn)LcMYB1基因矮牽牛花色苷生物合成相關(guān)基因的表達(dá)

為進(jìn)一步分析LcMYB誘導(dǎo)矮牽?；ㄉ盏姆e累機(jī)理，利用熒光定量PCR檢測(cè)了LcMYB1、花色苷生物合成關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因PhCHS、PhDFR和bHLH調(diào)控基因PhAN1在對(duì)照和轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，LcMYB1在對(duì)照植株花瓣和葉片中均無表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因的矮牽?；ò旰腿~片中均表達(dá)，且在葉片中的表達(dá)量更高，說明LcMYB1已成功轉(zhuǎn)入到‘W115中（圖3）。PhCHS在轉(zhuǎn)基因矮牽牛葉片中的表達(dá)水平比對(duì)照增加1倍，在花瓣中的表達(dá)明顯被激活。PhDFR在對(duì)照的葉片和花瓣中均無表達(dá)，而轉(zhuǎn)基因植株中其表達(dá)顯著被激活，且在葉片中的表達(dá)高于花瓣。在對(duì)照中，PhAN1在葉片中無表達(dá)，在花瓣中有一定的表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因植株葉片中PhAN1的表達(dá)顯著被激活，花瓣中PhAN1有一定提高，但不顯著。

因此，LcMYB1可能通過上調(diào)矮牽牛PhCHS、PhDFR和PhAN1的表達(dá)誘導(dǎo)花色苷的積累。

2.3 ?轉(zhuǎn)LcMYB1基因番茄表型觀察

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將LcMYB1轉(zhuǎn)入‘Micro-Tom番茄中。與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因番茄的葉片變紅，花藥也由黃色變成了紅色（圖4A～圖4D）。通過測(cè)定分析花色苷含量發(fā)現(xiàn)，對(duì)照植株除葉片有少量花色苷積累外，果實(shí)、花藥、花瓣均無花色苷積累，而轉(zhuǎn)基因植株的葉片和花藥中積累了花色苷，含量分別為0.24 mg/g和0.10 mg/g，其花瓣和果實(shí)中均未檢測(cè)到花色苷（圖4E）。

2.4 ?轉(zhuǎn)LcMYB1基因番茄花色苷生物合成相關(guān)基因的表達(dá)

同樣，利用熒光定量PCR檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因番茄中LcMYB1、SlDFR和花色苷生物合成關(guān)鍵bHLH調(diào)控基因SlAN1和SlJAF13的表達(dá)情況。由圖5分析發(fā)現(xiàn)，LcMYB1在轉(zhuǎn)基因番茄的葉片和花藥中表達(dá)較高，果實(shí)中表達(dá)相對(duì)較低，而在對(duì)照植株的各個(gè)器官均無表達(dá)，說明LcMYB1已成功轉(zhuǎn)入到‘Micro-Tom番茄中。與在矮牽牛中LcMYB1的表達(dá)模式類似，LcMYB1在各個(gè)組織中的表達(dá)有較大差異。SlDFR和SlAN1的表達(dá)模式相似，SlDFR和SlAN1在對(duì)照植株的葉片、果實(shí)和花藥中均有較低或無表達(dá)，而在轉(zhuǎn)基因植株的葉片和花藥中其表達(dá)顯著被激活，在果實(shí)中的表達(dá)量均較低。SlDFR和SlAN1的基因表達(dá)水平與番茄的花色苷含量一致。SlJAF13在對(duì)照植株葉片、果實(shí)和花藥中均有一定表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因植株中該基因在各組織的表達(dá)水平均提高了約1倍。

3 ?討論

本研究組前期研究發(fā)現(xiàn)荔枝LcMYB1在各個(gè)組織器官中的表達(dá)水平與花色苷含量呈正相關(guān)，并通過煙草異源表達(dá)確定LcMYB1是調(diào)控荔枝中花色苷生物合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[11]。本研究分別在白色‘W115矮牽牛和‘Micro-Tom番茄中超表達(dá)LcMYB1，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因矮牽?？梢栽谌~片和花瓣中積累花色苷，轉(zhuǎn)基因番茄的葉片和花藥積累了大量花色苷?！甒115為矮牽?；ㄉ丈锖铣申P(guān)鍵MYB調(diào)控基因PhAN2和PhAN4雙突變植株，花瓣為白色[15]，因此，利用‘W115研究LcMYB1的功能可以避免內(nèi)源MYB基因的影響。此外，荔枝LcMYB1無論是通過瞬時(shí)表達(dá)還是穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化均可誘導(dǎo)煙草花色苷積累[11]，這表明荔枝LcMYB1在煙草、番茄和矮牽牛中均有較強(qiáng)的誘導(dǎo)花色苷生物合成的能力。

MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控花色苷生物合成的機(jī)理是MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到花色苷生物合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子上，調(diào)節(jié)這些結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)[4]。在植物積累花色苷的過程中，MYB轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)模式和花色苷的積累量一致。在楊梅果實(shí)發(fā)育過程中，MrF3H、MrF3H、MrDFR1、MrUFGT和MrMYB1的表達(dá)水平與楊梅果實(shí)的花色苷含量正相關(guān)[10]。在蘋果不同著色程度的果皮中，MdANS、MdUFGT和MdMYB1的表達(dá)水平也與果實(shí)的著色程度高度一致[6]。與對(duì)照相比，矮牽?；ㄉ丈锖铣申P(guān)鍵調(diào)控基因PhAN1、結(jié)構(gòu)基因PhCHS和PhDFR在轉(zhuǎn)基因植株中均表達(dá)上調(diào)，而轉(zhuǎn)基因番茄的葉片、果實(shí)和花藥中花色苷生物合成的關(guān)鍵調(diào)控基因SlAN1、SlJAF13、結(jié)構(gòu)基因SlDFR的表達(dá)上調(diào)。綜合前期研究發(fā)現(xiàn)，LcMYB1轉(zhuǎn)錄因子可以在不同植物中（包括煙草、矮牽牛和番茄）通過調(diào)控花色苷生物合成的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因來促進(jìn)或誘導(dǎo)花色苷的積累。

近期研究發(fā)現(xiàn)，番茄SlMYB75可以誘導(dǎo)‘Micro-Tom番茄葉片、花藥和果實(shí)積累大量花色苷，與SlMYB75相比，LcMYB1可以誘導(dǎo)番茄葉片和花藥的花色苷生物合成，但并不能誘導(dǎo)番茄果實(shí)積累花色苷，推測(cè)可能是由于番茄果實(shí)中抑制花色苷生物合成的R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子SlMYBATV的表達(dá)與LcMYB1競(jìng)爭bHLH，從而抑制花色苷的合成，導(dǎo)致無法啟動(dòng)果實(shí)中花色苷生物合成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因[16-17]。前人將調(diào)控玉米花色苷生物合成的Lc（MYB）和C1（bHLH）同時(shí)轉(zhuǎn)化到番茄中，無法誘導(dǎo)番茄果實(shí)花色苷的合成[17]。而在番茄中同時(shí)超表達(dá)來自金魚草的Del（bHLH）和Ros1（MYB），則可以誘導(dǎo)番茄果實(shí)合成大量的花色苷[18]。這表明，不同植物來源的MYB轉(zhuǎn)錄因子在同一植物異源表達(dá)時(shí)會(huì)出現(xiàn)不同表型。

綜上所述，本研究證實(shí)了在矮牽牛和番茄中LcMYB1通過上調(diào)花色苷生物合成關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因和bHLH調(diào)控基因的表達(dá)來調(diào)控花色苷生物合成的功能，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)LcMYB1轉(zhuǎn)錄因子在不同植物上異源表達(dá)的表型有一定的差異，不能誘導(dǎo)植物的所有器官積累花色苷，這些結(jié)果可為利用基因工程育種在基因選擇上提供參考。

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責(zé)任編輯：謝龍蓮