何宇寧 黃和 顏韶波 鐘賽意 劉海 秦小明

摘 ?要：為了提升菠蘿蜜的產(chǎn)品附加值，進(jìn)一步豐富市場(chǎng)中果醋種類，本研究以菠蘿蜜為原料，對(duì)菠蘿蜜果醋發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化并分析其香氣成分。通過(guò)單因素試驗(yàn)探討醋酸菌接種量、發(fā)酵溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、初始pH 4個(gè)因素對(duì)菠蘿蜜果醋產(chǎn)酸量的影響，然后采用4因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化得到最佳發(fā)酵工藝。結(jié)果表明，菠蘿蜜果醋的最佳發(fā)酵工藝條件為醋酸菌接種量11%、發(fā)酵溫度32 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)5%、初始pH 3.3，在此條件下菠蘿蜜果醋的醋酸含量達(dá)（44.20±0.41）g/L。采用頂空固相微萃取法（head space-solid phase microextraction， HS-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography-mass spectrometry， GC-MS），對(duì)菠蘿蜜果醋的香氣成分進(jìn)行分析，檢測(cè)出香氣成分67種，主要成分是乙酸（26.15%）、乙酸異戊酯（12.78%）、異戊醇（11.01%）、乙酸乙酯（10.99%）、苯乙醇（4.72%）、正癸酸（3.61%）、苯甲醛（3.34%）、乙酸苯乙酯（3.12%）、辛酸（3.08%）、異戊酸（1.31%）、月桂酸乙酯（1.07%）。通過(guò)菠蘿蜜果醋發(fā)酵工藝的優(yōu)化和香氣成分分析，制備出符合相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的新型果醋，初步探明了果醋中香氣成分的種類。

關(guān)鍵詞：菠蘿蜜果醋;發(fā)酵工藝;響應(yīng)面法;香氣成分;頂空固相微萃取法（HS-SPME）;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）

中圖分類號(hào)：S667.8; TS255.47 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： To enhance the added value of jackfruit and enrich the varieties of fruit vinegar in the market， the fermenta-tion process of jackfruit vinegar was optimized， and the aroma components in the finished products were analyzed. The effects of inoculation volume， fermentation temperature， ethanol concentration， and pH on the acetic acid production in jackfruit vinegar were firstly studied through single factor tests， and the optimal fermentation process was obtained by the response surface methodology with four factors and three levels. The results showed that the optimum fermentation parameters were determined as acetic acid bacteria inoculation volume of 11%， fermentation temperature of 32 ℃， ethanol concentration 5%， and initial pH 3.3. Under the conditions， the acetic acid content in the vinegar reached （44.20±0.41）g/L. The aroma components of jackfruit vinegar were determined by head space solid-phase microextraction （HS-SPME） combined with gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. A total of 67 aroma substances were identified from the jackfruit vinegar. The major aroma compounds were acetic acid （26.15%）， isoamyl acetate （12.78%）， isoamylol （11.01%）， ethyl 2-phenylacetate （10.99%）， phenylethyl alcohol （4.72%）， decanoic acid （3.61%）， benzaldehyde （3.34%）， phenethyl acetate （3.12%）， octanoic acid （3.08%）， 3-methylbutanoic acid （1.31%）， ethyl laurate （1.07%）. Through the optimization of the fermentation process of jackfruit vinegar and the analysis of aroma components， a new type of fruit vinegar which conforms to the relevant national and industrial standards was prepared， and the aroma components in fruit vinegar were preliminarily identified.

Keywords： jackfruit vinegar; fermentation process; response surface method; aroma components; head space solid- phase microextraction （HS-SPME）; gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.036

菠蘿蜜（Artocarpus heterophyllus Lam.），屬于?？?、菠蘿蜜屬的常青喬木，其果實(shí)柔軟可口，是熱帶地區(qū)的一種珍貴水果，主要分布在我國(guó)華南及西南地區(qū)，在國(guó)內(nèi)外具有廣泛的市場(chǎng)[1]。研究表明，菠蘿蜜果肉中含有大量的維生素C、有機(jī)酸、酚類物質(zhì)、可溶性蛋白，以及Ca、Mg、Cu等微量元素，可作為一些重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的優(yōu)質(zhì)來(lái)源[2-4]。多項(xiàng)營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究表明，菠蘿蜜具有多種生物活性，其中包括抗氧化、抗炎、抗菌、防齲、抗腫瘤和降血糖等[5-7]，可治療由于營(yíng)養(yǎng)不良引起的水腫和低血[8]。菠蘿蜜果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，但采摘期短、不耐貯藏，鮮果貨架期短，嚴(yán)重制約菠蘿蜜種植業(yè)的發(fā)展，近幾年，關(guān)于菠蘿蜜精深加工的研究備受關(guān)注。目前報(bào)道的菠蘿蜜精深加工產(chǎn)品主要有果脯、果干以及果酒，而菠蘿蜜果醋的產(chǎn)品極少見(jiàn)。

果醋是一類以水果為主要原料，通過(guò)微生物發(fā)酵而成的一種具有抑菌、促進(jìn)消化、增強(qiáng)免疫等生理功能的健康發(fā)酵食品[9]。同時(shí)，果醋中含有豐富的有機(jī)酸和生物活性物質(zhì)，具有改善脂類代謝、減輕肥胖、預(yù)防動(dòng)脈硬化等保健功能[10]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外有不少關(guān)于葡萄[11]、香梨[12]、蘋果[13]、枇杷[14]等果醋發(fā)酵工藝研究，也有針對(duì)椪柑果[15]、草莓[16]、黑加侖[17]等果醋的香氣成分分析，但對(duì)于菠蘿蜜果醋香氣成分分析的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究以菠蘿蜜為原料，通過(guò)單因素試驗(yàn)研究醋酸菌接種量、發(fā)酵溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、初始pH等因素對(duì)菠蘿蜜果醋產(chǎn)酸量的影響，再通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化得到最佳發(fā)酵工藝，并采用頂空固相微萃取法（HS-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析其香氣成分，以期為菠蘿蜜果醋的發(fā)酵生產(chǎn)及其特征香氣成分研究提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?材料與試劑 ?菠蘿蜜品種為‘興隆本地1號(hào)（xlbd1），采購(gòu)于廣東湛江市麻章區(qū)菠蘿蜜種植基地。

安琪葡萄酒高活性干酵母（SY），湖北安琪酵母股份有限公司;巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）Aa941，實(shí)驗(yàn)室自行篩選培養(yǎng)[18]。

葡萄糖、酵母膏、瓊脂，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;無(wú)水乙醇、酚酞指示劑、氫氧化鈉、檸檬酸、抗壞血酸，均為分析純，廣東光華科技股份有限公司;果膠酶（30 000 U/g），上海麥克林生化科技有限公司;焦亞硫酸鈉（分析純），成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司。

活化培養(yǎng)基：葡萄糖1.0%，酵母膏1.0%，121 ℃滅菌20 min，冷卻至70 ℃，加入4.0% （V/V）無(wú)水乙醇。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%，酵母膏1.0%，121 ℃滅菌20 min，冷卻至70 ℃，加入4.0% （V/V）無(wú)水乙醇。

1.1.2 ?儀器與設(shè)備 ?SW-CJ凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司;GDC/GCMS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、AUY120電子天平，日本島津公司;65 μm PDMS/DVB SPME萃取頭，美國(guó)Supelco公司;S22-2恒溫磁力攪拌器，上海司樂(lè)儀器有限公司;722s紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精科公司;3-18K高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司;SPX-250B-2生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司;VBR90A型手持糖度計(jì)，杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司;JYL-C19V榨汁機(jī)，九陽(yáng)股份有限公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?工藝流程 ?菠蘿蜜→切碎→榨汁→酶解處理（果膠酶）→調(diào)節(jié)糖度（蔗糖）→巴氏滅菌→酒精發(fā)酵（酵母菌）→過(guò)濾→醋酸發(fā)酵（醋酸菌）→過(guò)濾→巴氏滅菌→成品。

（1）菠蘿蜜發(fā)酵液預(yù)處理。選取新鮮菠蘿蜜果肉，清洗干凈后切碎，在護(hù)色劑（0.01%抗壞血酸、0.8%檸檬酸）中浸泡20 min，取出果肉，按1∶1.5（W/V）加入蒸餾水打漿，根據(jù)菠蘿蜜果漿體積加入0.5 g/L的固體果膠酶，在30 ℃下酶解3 h。酶解后的菠蘿蜜果漿用蔗糖調(diào)節(jié)糖度至17%（W/V），65 ℃巴氏滅菌30 min。

（2）酵母菌活化。將10 g安琪活性干酵母溶于100 mL濃度5%的葡萄糖溶液中，在30 ℃下連續(xù)攪拌活化30 min，直至溶液產(chǎn)生小氣泡為止[19]。

（3）酒精發(fā)酵。將活化后酵母菌按7%（V/V）接種于處理好的菠蘿蜜果漿中，于25 ℃發(fā)酵6 d后結(jié)束酒精發(fā)酵，得到菠蘿蜜果酒，其乙醇體積分?jǐn)?shù)為6.8%。

（4）醋酸菌活化與擴(kuò)培。醋酸菌活化：將斜面保藏菌株取一環(huán)接入100 mL活化培養(yǎng)基，30 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。

一級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)：將活化后的醋酸菌取1 mL接種于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。

二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)：將一級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的醋酸菌取1 mL接種于100 mL已滅菌的菠蘿蜜果酒中，30 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。

（5）醋酸發(fā)酵。將二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的醋酸菌接種于菠蘿蜜果酒中，120 r/min振蕩培養(yǎng)8 d直至醋酸含量不再上升，結(jié)束醋酸發(fā)酵。

1.2.2 ?發(fā)酵時(shí)間對(duì)醋酸菌生長(zhǎng)量和產(chǎn)酸量的影響 ?調(diào)節(jié)菠蘿蜜果酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%，pH 4.0，接入二級(jí)擴(kuò)培后的醋酸菌8%（V/V），置于31 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)12 d，每天取樣測(cè)定產(chǎn)酸量和OD600。

1.2.3 ?單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) ?（1）醋酸菌接種量對(duì)產(chǎn)酸量的影響。調(diào)節(jié)菠蘿蜜果酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%，pH 4.0，分別接入擴(kuò)培后的醋酸菌6%、8%、10%、12%、14%（V/V），置于31 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)8 d，每天取樣測(cè)定產(chǎn)酸量。

（2）發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酸量的影響。調(diào)節(jié)菠蘿蜜果酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%，pH 4.0，醋酸菌接種量為8%（V/V），分別置于25、28、31、34、37 ℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)8 d，每天取樣測(cè)定產(chǎn)酸量。

（3）乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)產(chǎn)酸量的影響。調(diào)節(jié)菠蘿蜜果酒pH 4.0，醋酸菌接種量為8%（V/V），乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為2%、4%、6%、8%、10%，置于31 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)8 d，每天取樣測(cè)定產(chǎn)酸量。

（4）初始pH值對(duì)產(chǎn)酸量的影響。調(diào)節(jié)菠蘿蜜果酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%，醋酸菌接種量為8%（V/V），pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，置于31 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)8 d，每天取樣測(cè)定產(chǎn)酸量。

1.2.4 ?響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) ?在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以產(chǎn)酸量為指標(biāo)，選擇醋酸菌接種量、發(fā)酵溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、初始pH等4個(gè)因素為自變量，采用Design Expert 10.0軟件，設(shè)計(jì)4因素3水平共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，優(yōu)化發(fā)酵工藝條件。試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

1.2.5 ?菠蘿蜜果醋的香氣成分分析 ?（1）樣品前處理。取5 mL果醋樣品于20 mL頂空瓶，加入磁力攪拌子（2 mm×5 mm），并用襯有PTFE硅膠墊的瓶蓋密封，放入45 ℃的水浴磁力攪拌器中，使用65 μm PDMS/DVB SPME萃取頭插入頂空瓶中，于溶液上方5 mm處頂空萃取30 min，立即轉(zhuǎn)移至色譜進(jìn)樣口，于250 ℃下解吸附2 min[20-21]。

（2）氣相色譜-質(zhì)譜條件。色譜柱為SH-Rxi- SSil毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;載氣為高純度氦氣，載氣流速1 mL/min。程序升溫：初始溫度45 ℃（保持3.5 min），以5 ℃/min升溫至90 ℃，然后12 ℃/min升溫至230 ℃（保持10 min）。進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：采用質(zhì)譜選擇離子掃描模式（SIM）;電離方式為電子轟擊（EI）;電離電壓70 eV;離子源溫度250 ℃，傳輸線溫度250 ℃;質(zhì)量掃描范圍為33～450 amu（m/z）。

1.2.6 ?菠蘿蜜果醋指標(biāo)測(cè)定 ?乙醇體積分?jǐn)?shù)：參考GB 5009.225—2016 蒸餾法。總酸：參考GB/T 12456—2008酸堿滴定法，以乙酸計(jì)。感官評(píng)價(jià)：參考NY/T 2987—2016?？扇苄怨绦挝铮赫酃庥?jì)法。總砷：參考GB5009.11—2014，以As計(jì)。致病菌：參考GB 29921—2013，沙門氏菌、金黃色葡萄球菌。霉菌和酵母菌：參考GB 4789.15—2016 平板計(jì)數(shù)法。菌落總數(shù)：參考GB 4789.2—2016 平板計(jì)數(shù)法。大腸菌群：參考GB 4789.3—2016 MPN計(jì)數(shù)法。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。采用SPSS 10.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Design Expert 10.0和Origin 2017軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)處理，使用NIST 05a.L檢索譜庫(kù)對(duì)香氣成分進(jìn)行初步檢索和分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?發(fā)酵時(shí)間對(duì)醋酸菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酸量的影響

如圖1所示，醋酸發(fā)酵時(shí)間小于4 d，醋酸菌生物量較小產(chǎn)酸較慢，發(fā)酵4 d的產(chǎn)酸量?jī)H為8.57 g/L;從發(fā)酵時(shí)間大于4 d，隨著醋酸菌含量的增加，產(chǎn)酸量迅速上升，發(fā)酵8 d產(chǎn)酸量達(dá)到最大值：36.24 g/L;在發(fā)酵9～12 d，產(chǎn)酸量穩(wěn)定在35.18～36.15 g/L之間，略低于發(fā)酵8 d的產(chǎn)酸量，可能與醋酸菌繁殖消耗大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等因素有關(guān)[22]。最終確定醋酸發(fā)酵時(shí)間為8 d。

2.2 ?單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 ?醋酸菌接種量對(duì)產(chǎn)酸量的影響 ?醋酸菌接種量影響果醋發(fā)酵過(guò)程中的醋酸產(chǎn)量，由圖2可知，接種量為6%～10%時(shí)，產(chǎn)酸量隨著接種量增加而增加，當(dāng)接種量達(dá)10%，產(chǎn)酸量為35.20 g/L;接種量為10%～14%時(shí)，產(chǎn)酸量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。結(jié)果表明，醋酸菌接種量越大，果醋發(fā)酵速率越快，但接入過(guò)量的醋酸菌，并不能提升醋酸產(chǎn)量，因?yàn)檫^(guò)多的醋酸菌生長(zhǎng)繁殖所消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也相應(yīng)增加，使醋酸發(fā)酵過(guò)程被抑制，進(jìn)而導(dǎo)致醋酸產(chǎn)量下降[23]。因此選擇接種量8%、10%、12%作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)水平。

2.2.2 ?發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酸量的影響 ?溫度對(duì)醋酸菌產(chǎn)酸量的影響如圖3所示，在25～31 ℃時(shí)，醋酸菌產(chǎn)酸量隨著溫度的升高而上升，在31 ℃時(shí)達(dá)到最大值（29.72 g/L）;在31～37 ℃時(shí)，產(chǎn)酸量逐漸下降，在37 ℃時(shí)產(chǎn)酸量為27.44 g/L，可能是由于高溫抑制了乙醇脫氫酶與乙醛脫氫酶活性，從而降低了乙醇氧化成醋酸的速率[22]。因此選擇溫度28、31、34 ℃作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)水平。

2.2.3 ?乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)產(chǎn)酸量的影響 ?乙醇含量對(duì)醋酸菌產(chǎn)酸量的影響如圖4所示，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為2%～4%時(shí)，醋酸菌產(chǎn)酸量隨著乙醇含量的增加而增加，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為4%時(shí)，產(chǎn)酸量達(dá)到最大值35.72 g/L;隨著乙醇含量繼續(xù)上升，產(chǎn)酸量則不斷下降，乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)發(fā)酵液產(chǎn)酸量為25.00 g/L。其原因可能與低乙醇含量導(dǎo)致的底物不足和高乙醇含量抑制細(xì)胞生長(zhǎng)速率有關(guān)[24]。因此選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)2%、4%、6%作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)水平。

2.2.4 ?初始pH對(duì)產(chǎn)酸量的影響 ?初始pH對(duì)產(chǎn)酸量的影響見(jiàn)圖5。在pH 3.0～4.0時(shí)，醋酸菌產(chǎn)酸量隨著pH升高而增加，在pH 4.0時(shí)，產(chǎn)酸量達(dá)到最大值38.37 g/L;隨著發(fā)酵液初始pH的進(jìn)一步提高，產(chǎn)酸量降低，在pH 7.0時(shí)產(chǎn)酸量?jī)H為3.38 g/L。因此選擇初始pH 3.0、4.0、5.0作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)水平。

2.3 ?響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 ?響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 ?以產(chǎn)酸量為指標(biāo)，選擇醋酸菌接種量、發(fā)酵溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、初始pH 4個(gè)因素為自變量，用Design Expert 10.0軟件，設(shè)計(jì)4因素3水平共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，優(yōu)化菠蘿蜜果醋發(fā)酵工藝條件，結(jié)果見(jiàn)表2。

29個(gè)響應(yīng)面試驗(yàn)點(diǎn)中，其中24個(gè)析因點(diǎn)由A、B、C、D等4個(gè)自變量所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，另外5個(gè)重復(fù)零點(diǎn)試驗(yàn)為區(qū)域中心點(diǎn)，主要估計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)的誤差。

2.3.2 ?回歸方程分析 ?采用Design Expert 10.0軟件對(duì)表2的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行最小二乘法回歸擬合后，得到回歸方程：Y=41.35+1.68A+7.16B+ 2.87C–2.25D–4.19AB+2.81AC–1.98AD+2.41BC+0.10BD–0.47CD–3.31A2–8.84B2–6.78C2–2.18D2，R2=0.9896。對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，模型F值為95.31，有極顯著性差異（P<0.0001），回歸方程的失擬項(xiàng)不顯著（P= 0.8742，P>0.05），回歸方程的線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9896，說(shuō)明回歸方程的擬合程度較高，可以用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)菠蘿蜜果醋最優(yōu)發(fā)酵工藝。接種量、發(fā)酵溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)和初始pH對(duì)醋酸菌發(fā)酵菠蘿蜜果醋產(chǎn)酸量的影響均極顯著（P<0.01），且由各因素的F值可知，各因素對(duì)產(chǎn)酸量的影響由大至小為發(fā)酵溫度>乙醇體積分?jǐn)?shù)>初始pH>接種量;在各因素的交互項(xiàng)與二次項(xiàng)中，接種量與發(fā)酵溫度、接種量與乙醇體積分?jǐn)?shù)、接種量與初始pH、發(fā)酵溫度與乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用對(duì)產(chǎn)酸量的影響極顯著（P<0.01），發(fā)酵溫度與初始pH、乙醇體積分?jǐn)?shù)與初始pH的交互作用影響不顯著（P>0.05）。

2.3.3 ?各因素交互作用影響 ?通過(guò)Box-Behnken模型，將各因素與響應(yīng)值構(gòu)成三維表面響應(yīng)圖，能夠較直觀地反映各因素間交互作用對(duì)產(chǎn)酸量的影響[25]。由響應(yīng)面可知2個(gè)因素交互作用對(duì)產(chǎn)酸量的影響，響應(yīng)面曲線較陡則作用顯著，曲線平緩則作用不顯著;由等高線可知2個(gè)因素間交互作用的顯著性，呈橢圓形則作用顯著，呈圓形則作用不顯著[26]。

從圖6的響應(yīng)面圖分析可知，醋酸菌接種量、發(fā)酵溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、初始pH間交互作用對(duì)菠蘿蜜果醋產(chǎn)酸量的影響顯著，表現(xiàn)為響應(yīng)面曲線較陡，產(chǎn)酸量隨著交互因素的增減變化較大;從圖6的等高線圖分析可知，各因素中除了乙醇體積分?jǐn)?shù)與初始pH的交互作用較弱，等高線呈圓形，影響不顯著，其他因素間均有一定的交互作用。

2.3.4 ?優(yōu)化工藝條件的驗(yàn)證 ?用Design Expert 10.0軟件對(duì)菠蘿蜜果醋發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)工藝條件為醋酸菌接種量10.82%、發(fā)酵溫度32.07 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)4.77%、初始pH 3.27，該條件下發(fā)酵，預(yù)測(cè)模型的發(fā)酵液產(chǎn)酸量為44.34 g/L。在驗(yàn)證試驗(yàn)中，根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整工藝條件為接種量11%，發(fā)酵溫度32 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)5%，初始pH 3.3，最終得到的菠蘿蜜果醋產(chǎn)酸量為（44.20±0.41）g/L，與理論預(yù)測(cè)值基本吻合，表明預(yù)測(cè)模型與實(shí)際發(fā)酵條件擬合較好。

2.4 ?菠蘿蜜果醋的香氣成分分析結(jié)果

菠蘿蜜果醋香氣成分的GC-MS總離子流色譜圖如圖7。各香氣成分經(jīng)過(guò)NIST05a.L譜庫(kù)檢索和分析，將其中與NIST05a.L譜庫(kù)匹配度≥85%的香氣成分，定義為該樣本的高匹配揮發(fā)物，鑒定結(jié)果見(jiàn)表4，從菠蘿蜜果醋中共鑒定出67種香氣成分，占總香氣成分的97.50%，共有酸類、酯類、醇類、醛類、酚類、酮類、萜烯類、烷烴類等8大類香氣成分。其中，酸類14種（37.00%）、酯類22種（32.72%）、醇類11種（17.70%）、醛類6種（5.46%）、酚類1種（0.46%）、酮類3種（1.06%）、萜烯類6種（1.93%）、烷烴類1種（0.17%）。其中主要的香氣成分為乙酸（26.15%）、乙酸異戊酯（12.78%）、異戊醇（11.01%）、乙酸乙酯（10.99%）、苯乙醇（4.72%）、正癸酸（3.61%）、苯甲醛（3.34%）、乙酸苯乙酯（3.12%）、辛酸（3.08%）、異戊酸（1.31%）、月桂酸乙酯（1.07%）。

2.5 ?菠蘿蜜果醋產(chǎn)品質(zhì)量分析

由表5可知，最終發(fā)酵的菠蘿蜜果醋各項(xiàng)理化及微生物指標(biāo)均符合NY/T 2987—2016《綠色食品果醋飲料》、GB 29921—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中致病菌限量》的要求，同時(shí)感官評(píng)價(jià)為優(yōu)。感官指標(biāo)測(cè)試結(jié)果顯示，菠蘿蜜果醋外觀呈金黃色、富有光澤、質(zhì)地均勻;帶有菠蘿蜜特有的濃郁滋味和香氣，酸味較純正，無(wú)異味;有少量果肉沉淀。

3 ?討論

目前，關(guān)于傳統(tǒng)果醋的發(fā)酵工藝研究較多，但對(duì)菠蘿蜜果醋的工藝研究鮮見(jiàn)報(bào)道。邢志利[27]對(duì)多種果醋的發(fā)酵工藝進(jìn)行了比較研究，結(jié)果表明，液態(tài)發(fā)酵法得到的果醋質(zhì)量最佳且最穩(wěn)定。本研究采用液態(tài)發(fā)酵法釀造菠蘿蜜果醋。與傳統(tǒng)的葡萄醋[11]和蘋果醋[13]相比，本研究以菠蘿蜜為原料開(kāi)發(fā)新型飲料果醋，將飲料醋的保健功能與菠蘿蜜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值結(jié)合，使菠蘿蜜果醋具有獨(dú)特的果香和營(yíng)養(yǎng)。

醋酸產(chǎn)量一般作為衡量醋酸菌發(fā)酵性能的重要指標(biāo)，產(chǎn)酸量的大小影響著發(fā)酵型果醋的品質(zhì)[28]。發(fā)酵是醋酸菌生產(chǎn)醋酸的基礎(chǔ)，醋酸的產(chǎn)量與菌種接種量、發(fā)酵溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、pH等聯(lián)系密切[24-25]。醋酸菌接種量對(duì)產(chǎn)酸量的影響，在一定范圍內(nèi)，醋酸產(chǎn)量隨著接種量的增加，呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，本研究與李文等[29]研究結(jié)果相一致;陳洋等[30]研究發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)產(chǎn)酸量的影響主要表現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞代謝速率、乙醇脫氫酶與乙醛脫氫酶的影響;韓曉青等[31]研究表明，乙醇是醋酸菌氧化產(chǎn)酸的重要底物，提升乙醇含量可提高產(chǎn)酸量，但高濃度的酒乙醇會(huì)抑制醋酸菌生長(zhǎng)速率，降低產(chǎn)酸速率;Sainz等[32]研究發(fā)現(xiàn)醋酸菌的適宜生長(zhǎng)pH 為3.5～6.5，pH過(guò)高抑制生長(zhǎng)，pH過(guò)低則會(huì)加快衰老，降低醋酸菌產(chǎn)酸速率，同時(shí)破壞細(xì)胞壁，導(dǎo)致醋酸菌發(fā)生自溶。

傳統(tǒng)的正交試驗(yàn)與全因子試驗(yàn)的優(yōu)化方法，不僅實(shí)驗(yàn)量大而且結(jié)果不全面，采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)可以通過(guò)擬合模型對(duì)影響發(fā)酵的因素進(jìn)行很好地優(yōu)化[33]。本研究采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化菠蘿蜜果醋發(fā)酵工藝，得到的最佳發(fā)酵工藝為醋酸菌接種量11%、發(fā)酵溫度32 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)5%、初始pH 3.3，在該條件下產(chǎn)酸量為（44.20±0.41）g/L。制得的菠蘿蜜果醋各項(xiàng)理化及微生物指標(biāo)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及綠色食品標(biāo)準(zhǔn)，具有獨(dú)特而濃厚的菠蘿蜜果香和醋香，口感較柔和，兼具菠蘿蜜水果醋和發(fā)酵醋的典型特征，得出的最優(yōu)菠蘿蜜果醋發(fā)酵工藝具有較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，對(duì)推動(dòng)菠蘿蜜產(chǎn)業(yè)發(fā)展和豐富果醋品種具有重要意義。

果醋具有獨(dú)特的果香和醋香，這些獨(dú)特的香氣成分不僅是區(qū)分不同果醋的重要依據(jù)，也是果醋感官評(píng)價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo)，對(duì)于果醋發(fā)酵研究具有重要意義。近年來(lái)，頂空固相微萃取法（HS- SPME）在果醋香氣成分研究中發(fā)揮著越來(lái)越大的作用，其主要優(yōu)點(diǎn)是避免使用溶劑與復(fù)雜的前處理，直接采集樣品中的揮發(fā)性成分，可以很好地體現(xiàn)樣品香氣成分中的真實(shí)構(gòu)成[34]。本研究結(jié)果表明，使用頂空固相微萃取法（HS-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）進(jìn)行菠蘿蜜果醋香氣成分的提取和檢測(cè)，共鑒定出67種香氣成分，占到總香氣成分的97.50%，其中高匹配高含量的物質(zhì)達(dá)到了60%以上。

本研究對(duì)菠蘿蜜果醋香氣成分進(jìn)行鑒定分析，共有酸類、酯類、醇類、醛類、酚類、酮類、萜烯類、烷烴類等8大類香氣成分，其中酸類物質(zhì)14種，占香氣成分的37.00%，主要有乙酸、正癸酸、辛酸等，除了菠蘿蜜本身具有的各類有機(jī)酸，大部分酸類物質(zhì)（如乙酸）由醋酸菌發(fā)酵產(chǎn)生[35];酯類物質(zhì)22種，占香氣成分的32.72%，主要有乙酸異戊酯、乙酸乙酯、乙酸苯乙酯等，菠蘿蜜果醋的酯類物質(zhì)主要由酒精發(fā)酵過(guò)程中酵母菌和細(xì)菌的代謝活動(dòng)會(huì)產(chǎn)生[36]，其中乙酸異戊酯、乙酸乙酯分別呈現(xiàn)梨和香蕉等果香，乙酸苯乙酯帶有橘子香味，月桂酸乙酯具有花香[15， 37];醇類物質(zhì)11種，占總香氣成分的17.70%，醇類物質(zhì)主要來(lái)自于氨基酸轉(zhuǎn)化和酒精發(fā)酵[38]，相對(duì)含量較高的醇類物質(zhì)為異戊醇、苯乙醇，分別帶有雜醇油氣味和玫瑰花香[39];醛類物質(zhì)共有6種，占總香氣成分的5.46%，其中苯甲醛的含量較高，醛類物質(zhì)帶有明顯的脂香味，可以一定程度反映脂質(zhì)的氧化程度，與果醋發(fā)酵酯化程度存在明顯關(guān)聯(lián)性[40]，這些香氣成分雖然含量不高，但是對(duì)果醋的提香和豐富香氣的層次感具有重要作用[41]。本研究檢出的菠蘿蜜果醋的香氣成分，對(duì)照相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，具有以下作用：（1）用作食用香精和添加劑：乙酸異戊酯可用作調(diào)制菠蘿、蘋果、香蕉等果香型食用香精[42];（2）消炎抑菌：芳樟醇具有抗焦慮、鎮(zhèn)痛、抗炎、抑菌、抗腫瘤等藥理功效[43];（3）預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化：亞油酸屬于必需脂肪酸，可以有效降低血液膽固醇，預(yù)防人體動(dòng)脈粥樣硬化[44]。

目前關(guān)于菠蘿蜜果醋的香氣成分的研究還未有詳細(xì)報(bào)道，不同揮發(fā)性成分對(duì)總香氣特征形成的作用需要更進(jìn)一步的研究。香氣成分種類與含量在菠蘿蜜果醋發(fā)酵過(guò)程中的變化，以及香氣成分的具體生物活性將是下一步研究的方向。

參考文獻(xiàn)

[1] 葉春海， 吳 ?鈿， 豐 ?鋒， 等. 菠蘿蜜種質(zhì)資源調(diào)查及果實(shí)性狀的相關(guān)分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2006， 27（1）： 28-32.

[2] 呂慶芳， 王俊寧， 謝麗芳， 等. 不同菠蘿蜜株系果實(shí)品質(zhì)分析[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)， 2013， 33（3）： 84-88.

[3] Sharma H K， Kaushal P， Singh A P， et al. Rheological measurements of composite flour containing Jackfruit （Ar-tocarpus heterophyllus Lam.） flesh flour and its identifica-tion by pattern recognition methods[J]. Journal of Food Measurement and Characterization， 2019， 13（1）： 404- 420.

[4] Swami S B， Thakor N J， Haldankar P M， et al. Jackfruit and its many functional components as related to human health： A review[J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety， 2012， 11（6）： 565-576.

[5] Fang S C， Hsu C L， Yen G C， et al. Anti-inflammatory ef-fects of phenolic compounds isolated from the fruits of Ar-tocarpus heterophyllus[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2008， 56（12）： 4463-4468.

[6] Jagtap U B， Bapat V A. Artocarpus： A review of its tradi-tional uses， phytochemistry and pharmacology[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2010， 129（2）： 142-166.

[7] Omar H S， El-Beshbishy H A， Moussa Z， et al. Antioxidant activity of Artocarpus heterophyllus Lam. （jack fruit） leaf extracts： remarkable attenuations of hyperglycemia and hyperlipidemia in streptozotocin-diabetic rats[J]. The Science World Journal， 2011， 11： 788-800.

[8] Zhang Y J， Zhang Y T， Xu F， et al. Structural characteriza-tion of starches from Chinese jackfruit seeds （Artocarpus heterophyllus Lam.）[J]. Food Hydrocolloids， 2018， 80： 141-148.

[9] Ho C W， Lazim A M， Fazry S， et al. Varieties， production， composition and health benefits of vinegars： A review[J]. Food Chemistry， 2017， 221： 1621-1630.

[10] Coelho E， Genisheva Z， Oliveira J M， et al. Vinegar produc-tion from fruit concentrates： effect on volatile composition and antioxidant activity[J]. Journal of Food Science and Technology-Mysore， 2017， 54（12）： 4112-4122.

[11] Budak H N， Guzel-Seydim Z B. Antioxidant activity and phenolic content of wine vinegars produced by two different techniques[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2010， 90（12）： 2021-2026.

[12] 韓曉青， 王 ?然， 吳 ?昊， 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化黃金梨果醋發(fā)酵條件[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)， 2011， 11（7）： 124-132.

[13] 李 ?歡， 毛 ?健， 劉雙平， 等. 醋酸高產(chǎn)菌株的篩選及高酸度蘋果醋的釀造[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2019， 38（5）： 7-14.

[14] 常 ?榮， 袁 ?敏， 段珍珍， 等. 枇杷醋醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化及醋酸味品質(zhì)特征研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2017， 43（10）： 102-110.

[15] 曹雪丹， 方修貴， 趙 ?凱. 椪柑果醋液態(tài)發(fā)酵工藝及香氣成分的GC-MS分析[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)， 2015， 15（5）： 105-112.

[16] Ubeda C， Callejon R M， Troncoso A M， et al. A comparative study on aromatic profiles of strawberry vinegars obtained using different conditions in the production process[J]. Food Chemistry， 2016， 192（1）： 1051-1059.

[17] 嚴(yán)寶冬， 朱 ?丹， 牛廣財(cái)， 等. 黑加侖果醋香氣成分的GC/MS分析[J]. 中國(guó)調(diào)味品， 2012， 37（6）： 92-94， 105.

[18] 何宇寧， 黃 ?和， 鐘賽意， 等. 菠蘿蜜果醋發(fā)酵菌種的選育及發(fā)酵特性[J]. 食品科學(xué)， 2020， 41（14）： 183-189.

[19] 繆 ?靜， 殷曰彩， 馮志彬， 等. 無(wú)花果果醋發(fā)酵工藝優(yōu)化[J]. 食品與機(jī)械， 2014， 30（3）： 218-221， 271.

[20] Al-Dalali S， Zheng F P， Sun B G， et al. Comparison of aro-ma profiles of traditional and modern zhenjiang aromatic vinegars and their changes during the vinegar aging by SPME-GC-MS and GC-O[J]. Food Analytical Methods， 2019， 12（1）： 544-557.

[21] Jo D， Kim G R， Yeo S H， et al. Analysis of aroma com-pounds of commercial cider vinegars with different acidities using SPME/GC-MS， electronic nose， and sensory evaluation[J]. Food Science And Biotechnology， 2013， 22（6）： 1559-1565.

[22] 姜春悅. 醋酸對(duì)巴氏醋桿菌AC2005生長(zhǎng)和發(fā)酵的影響[D]. 天津： 天津科技大學(xué)， 2014.

[23] 張海玲， 程倩倩， 尹新雅， 等. 山藥-梨復(fù)合型果醋發(fā)酵工藝[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2019， 45（19）： 188-193， 199.

[24] Yin X Y， Zhong W K， Huo J， et al. Production of vinegar using edible alcohol as feedstock through high efficient bio-transformation by acetic acid bacteria[J]. Food Science and Biotechnology， 2018， 27（2）： 519-524.

[25] Mugwagwa L R， Chimphango A F A. Box-Behnken design based multi-objective optimisation of sequential extraction of pectin and anthocyanins from mango peels[J]. Carbohydrate Polymers， 2019， 219： 29-38.

[26] 付敬敬， 王 ?磊， 張 ?凱， 等. 響應(yīng)面優(yōu)化大腸桿菌生物膜的培養(yǎng)條件[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2019， 28（8）： 1365-1372.

[27] 邢志利. 果醋的保健功效及加工工藝研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)調(diào)味品， 2005（4）： 42-44.

[28] 吳婧婧， 梁貴秋， 陸春霞， 等. 不同發(fā)酵條件對(duì)桑果醋產(chǎn)酸量的影響[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技， 2012（23）： 284-285.

[29] 李 ?文， 王 ?陶， 秦 ?杰， 等. 紫薯黃冠梨復(fù)合果醋醋酸發(fā)酵工藝研究[J]. 食品工業(yè)， 2018， 39（3）： 148-152.

[30] 陳 ?洋. 耐乙醇醋酸菌特性研究及應(yīng)用[D]. 湖北： 湖北工業(yè)大學(xué)， 2016.

[31] 韓曉青， 王 ?然， 吳 ?昊， 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化黃金梨果醋發(fā)酵條件[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)， 2011， 11（7）： 124-132.

[32] Sainz F， Mas A， Torija M J， et al. Effect of ammonium and amino acids on the growth of selected strains of Glucono-bacter and Acetobacter[J]. International Journal of Food Microbiology， 2017， 242： 45-52.

[33] 袁輝林， 康麗華， 馬海濱. 響應(yīng)曲面法及其在微生物發(fā)酵工藝優(yōu)化中的應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011， 39（16）： 9498-9500， 9502.

[34] 盧金清， 梁 ?歡， 戴 ?藝， 等. 固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析白蘇子揮發(fā)性化學(xué)成分[J]. 中國(guó)藥業(yè)， 2013， 22（1）： 9-10.

[35] 劉彩云， 趙軍霞， 魏晉梅. 啤特果醋香氣成分分析[J]. 中國(guó)調(diào)味品， 2018， 43（1）： 160-163.

[36] Fan G， Xu X Y， Qiao Y， et al. Volatiles of orange juice and orange wines using spontaneous and inoculated fermenta-tions[J]. European Food Research and Technology， 2009， 228（6）： 849-856.

[37] 賈 ?娟， 王婷婷， 楊雯雯， 等. 香梨發(fā)酵酒發(fā)酵工藝的優(yōu)化及其香氣成分研究[J]. 中國(guó)釀造， 2019， 38（5）： 101-107.

[38] 李記明， 賀普超， 劉 ?玲. 優(yōu)良品種葡萄酒的香氣成分研究[J]. 西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 1998： 9-12.

[39] 張文靜， 鄭福平， 孫寶國(guó)， 等. 同時(shí)蒸餾萃取/氣-質(zhì)聯(lián)用分析紫丁香花精油[J]. 食品科學(xué)， 2008， 29（9）： 523-525.

[40] 李云龍， 趙 ?琳， 何永吉， 等. 5種不同品種苦蕎的易揮發(fā)性成分比較分析[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)， 2020， 35（2）： 18-23， 30.

[41] Solis-Solis H M， Calderon-Santoyo M， Schorr-Galindo S， et al. Characterization of aroma potential of apricot varieties using different extraction techniques[J]. Food Chemistry， 2007， 105（2）： 829-837.

[42] 姜冬梅， 朱 ?源， 余江南， 等. 芳樟醇藥理作用及制劑研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2015， 40（18）： 3530-3533.

[43] 姜顯光. 植物油脂中脂肪酸的分析研究[D]. 大連： 遼寧師范大學(xué)， 2008.

[44] 俞善信， 趙宗保. 乙酸異戊酯[J]. 精細(xì)石油化工， 1995（1）： 68-69.

責(zé)任編輯：崔麗虹