盧錦斌，張利敏

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西華秦農(nóng)牧科技有限公司，陜西 楊凌 712100)

飼料原料蛋白質(zhì)含量測定是飼料生產(chǎn)過程中的重要環(huán)節(jié)。目前測定飼料原料及產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量的方法主要有凱氏定氮法和近紅外光譜法[1-2]。盡管近紅外光譜分析技術(shù)具有檢測速度快、無損、不消耗試劑、前處理簡單以及可同時檢測多種成分等多方面的優(yōu)勢，但凱氏定氮法仍然是檢測飼料蛋白質(zhì)含量的重要方法。傳統(tǒng)的凱氏定氮法存在一個明顯的弊端，即耗時過長，僅消煮樣品就需3～3.5 h，既影響工作效率又消耗能量。因此，通過改良縮短凱氏定氮法的消煮時間具有較大的應(yīng)用價值。

消化環(huán)節(jié)的改良通常從催化劑和消化液兩個方面入手。傳統(tǒng)凱氏定氮法的催化劑為CuSO4·5H2O與K2SO4(1:15)混合催化劑。濃H2SO4與混合催化劑組合法消化充分，但由于消泡問題未得到解決，無法實現(xiàn)快速分解。早期有不少研究報道，利用H2O2與濃硫酸發(fā)生的劇烈反應(yīng)消化樣品可極大地縮短消化時間，原因是H2O2有助于消泡，且適當(dāng)加大H2O2的量可促樣品快速分解，且減少電能消耗[3-5]，這種改良的凱氏定氮法也被稱為雙氧水測定法。但不同研究報道中H2O2添加量以及消煮時間并不統(tǒng)一，且該方法測定值與凱氏定氮法測定值并不相等，各報道也沒有驗證不同飼料原料用該方法與用凱氏定氮法測定的蛋白質(zhì)含量值的比值是否相同，以及同一類型原料不同來源的樣品該比值是否相同。這些問題沒有解決導(dǎo)致該方法不能得到推廣應(yīng)用。鑒于該方法對原料的快速消化特點，有必要對其進一步研究，以便在實際生產(chǎn)中能夠利用其優(yōu)勢。本研究通過系列試驗，確定H2O2的添加比例以及消煮時間，并分析討論該方法的穩(wěn)定性。在此基礎(chǔ)上，通過比較和分析不同飼料原料凱氏定氮法(即國標(biāo)法)和改良凱氏定氮法蛋白質(zhì)含量測定值的比值，探討將該方法應(yīng)用于飼料原料蛋白質(zhì)含量測定的可行性。

1 材料與方法

1.1 飼料原料

玉米、麩皮、豆粕、棉粕、DDGS、玉米蛋白粉、魚粉均由本地企業(yè)提供。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理和試驗設(shè)計 以四分法采集所需樣品，置于65 ℃風(fēng)干后，經(jīng)粉碎機粉碎，過40目篩后保存。每次試驗所有樣品都同時采用改良方法和傳統(tǒng)凱氏定氮法同時進行測定，每個樣品每種方法均設(shè)計3個重復(fù)。

1.2.2 試驗方法 首先利用H2O2完全替代凱氏定氮法中的混合催化劑(即H2O2直接催化法)進行消化。設(shè)定H2O2與濃硫酸的比例為1:1，選取常規(guī)凱氏定氮法中常用的濃硫酸添加量12 mL，因此 H2O2的添加量也為12 mL。由于H2O2只對焦化后的有機物進行氧化，因此，測定時先稱取0.5 g樣品于消化管中，再加入12 mL濃硫酸，靜置幾分鐘待樣品焦化后，緩慢加入等體積的H2O2，樣品在濃硫酸與H2O2的作用下被分解消化，然后再進行蒸餾定氮和滴定。

H2O2替代部分混合催化劑測定法(即H2O2-混合催化劑法)具體操作如下：0.5 g樣品添加7.5 mL H2O2，H2O2與濃硫酸比例仍為1:1，同時添加4 g混合催化劑(為凱氏定氮法添加量的1/2)。測定時，先稱取0.5 g樣品和4 g混合催化劑于消化管中，再加入7.5 mL濃硫酸，置于已預(yù)熱好的消化爐中消化約5 min待樣品焦化后緩慢加入7.5 mL的H2O2，然后置于消化爐消化20 min左右，最后再進行蒸餾定氮和滴定。

1.2.3 統(tǒng)計分析 采用SPSS 18.0軟件中的單因素方差分析，其余數(shù)據(jù)使用SPSS軟件中的成對樣本t檢驗進行差異顯著性檢驗，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 H2O2直接催化法測定結(jié)果

首先選取低蛋白含量的玉米和高蛋白含量的豆粕進行測定。凱氏定氮法在消化階段耗時3～3.5 h，而利用H2O2直接催化法可以看到在H2O2與濃硫酸的劇烈反應(yīng)下，樣品迅速消化，隨著反應(yīng)的進行，消化液顏色逐漸變淡直至透明，5 min內(nèi)溶液基本澄清，10 min內(nèi)反應(yīng)趨于平靜,但為充分消化，共消化20 min。將凱氏定氮法所測值與12 mL H2O2直接催化法所測值進行比較分析，結(jié)果如表1所示。用H2O2完全替代催化劑配合濃硫酸對樣品進行消化，測定的樣品蛋白質(zhì)含量低于凱氏定氮法測定的蛋白質(zhì)含量。其中，玉米凱氏定氮法所測值與H2O2直接催化法所測值的比值均值為1.240，而豆粕凱氏定氮法所測值與H2O2直接催化法測值的比值均值為1.189，比值差異極顯著(P=0.005)。但兩種原料測定值比值組內(nèi)RSD (relative standard deviation, RSD)均小于3%。

為了檢測不同原料兩種方法蛋白質(zhì)測定值比值是否都不相等，又選取4種不同蛋白含量原料的樣品進行驗證。結(jié)果如表2所示，每種原料不同重復(fù)比值RSD<1%，但不同原料兩種方法測定值的比值都不相同，蛋白質(zhì)含量越高的樣品，兩種測定值的比值越大，顯示該方法消化并不充分。不同原料H2O2直接催化法測定值與凱氏定氮法測定值的比值存在極顯著的差異(P<0.01)。

表 1 玉米和豆粕蛋白質(zhì)含量凱氏定氮法與H2O2直接催化法測定值比值Table 1 The ratios of protein content in corn and soybean mealdetermined by Kjeldah method and H2O2 direct catalysis method

表2 凱氏定氮法與H2O2直接催化法測定不同原料的蛋白質(zhì)含量Table 2 Determination of protein content in different samplesby Kjeldah method and H2O2 direct catalysis method

2.2 H2O2-混合催化劑法測定結(jié)果

上述結(jié)果顯示單獨使用H2O2原料消化不充分。為使原料成分充分消化，試驗調(diào)整了催化劑的配方，采用H2O2-混合催化劑法進行測定，結(jié)果見表3。

表3 樣品蛋白質(zhì)含量H2O2-混合催化劑法測定值與凱氏定氮法測定值及其比值Table 3 Protein content of samples determined by H2O2-mixed catalyst method and Kjeldah method and their ratio

由表3可知，各組樣品H2O2-混合催化劑法與凱氏定氮法測定值的比值RSD均<3%，顯示比值大小穩(wěn)定，但不同原料該比值仍然不相等，不同原料比值大小與其蛋白質(zhì)含量無關(guān)。其中DGGS該比值最低，接近1；豆粕和魚粉該比值相近(P>0.05)，分別為1.062和1.056，而玉米和玉米蛋白粉比值最高，且兩種原料的該比值接近(P>0.05)，分別為1.129和1.126。

在凱氏定氮法中，樣品的消化溫度在360～410

℃之間，低于360 ℃樣品中的氮消化不完全，高于410 ℃則容易造成氮的損失，因此在該法中設(shè)定的溫度為360 ℃，符合要求范圍。消化時間是影響消化效果的另一關(guān)鍵因素，為探究在H2O2-混合催化劑法中消化時間對于測定結(jié)果的影響，本試驗接下來選取蛋白質(zhì)含量適中、在上述兩類方法中表現(xiàn)都較為穩(wěn)定的豆粕作為樣品，以H2O2-混合催化劑法進行試驗，消化時間分別設(shè)定為5、10、15、20、25、30 min。由圖1可以看出，消化時間在5～20 min內(nèi)，豆粕中蛋白質(zhì)含量隨著消化時間的延長而提高，但從20 min至30 min，蛋白質(zhì)含量測定值沒有變化。因此可以推測在H2O2-混合催化劑法中，當(dāng)消化溫度為360 ℃、總消化時間為20 min時，樣品蛋白質(zhì)含量的測定值可以達到最高值，說明不同原料兩種方法測定結(jié)果比值不相等的原因并非消化時間不充分所致。

圖1 不同消化時間對混合催化劑法測定結(jié)果的影響Fig. 1 Effects of different digestion time on thedetermination results of mixed catalyst method

為了檢測不同來源同種原料H2O2-混合催化劑法與凱氏定氮法測定值比值是否穩(wěn)定，在前述結(jié)果的基礎(chǔ)上，又測定了3種來源玉米和3種來源DDGS，其結(jié)果見表4，不同來源玉米H2O2-混合催化劑法與凱氏定氮法測定值比值接近(RSD=0.22%)。同樣，不同來源DDGS的H2O2-混合催化劑法與凱氏定氮法測定值比值也很接近(RSD=0.30%)。

表4 不同來源同種飼料蛋白質(zhì)含量H2O2-混合催化劑法與凱氏定氮法測定值及其比值Table 4 Protein content of the same feed with different sources determined by Kjeldah method and H2O2-mixedcatalyst method(HMC)and their ratio

3 討 論

本試驗結(jié)果表明，H2O2直接催化法雖然比凱氏定氮法節(jié)省了大量的時間和能源，但其測定值與凱氏定氮法測定值相差較大，蛋白質(zhì)含量越高的原料，兩種方法的比值相差越大，顯示H2O2直接催化法消化不充分。H2O2完全替代催化劑的H2O2直接催化法所測值雖然小于凱氏定氮法測定值，但對于同一樣品而言，每種原料不同重復(fù)比值RSD<2%，說明該方法測定值的比值是穩(wěn)定的，因為統(tǒng)計學(xué)上認(rèn)為某組數(shù)據(jù)RSD<3%時即可認(rèn)為該組各數(shù)值穩(wěn)定。與趙德志等[5]報道的結(jié)果不一致的是，玉米兩種測定方法比值與豆粕兩種方法測定比值差異極顯著，說明不能根據(jù)H2O2直接催化法測定結(jié)果、再根據(jù)同一比值去推算其他檢測樣品的凱氏定氮法測定值。

由于使用H2O2直接催化法測定蛋白含量時原料消化不充分，參考苗雪原[6]報道，本試驗又采用H2O2-混合催化劑法進行測定，所測CP含量與凱氏定氮法所測CP含量仍然存在差異，但與H2O2直接催化法測定值相比，該方法測定值更接近凱氏定氮法所測值，而且每種原料兩種測定方法的比值大小與原料蛋白質(zhì)含量沒有相關(guān)性。蛋白質(zhì)含量最低的玉米凱氏定氮法與H2O2-混合催化劑法測定值比值反而高于魚粉和豆粕，而玉米蛋白粉該比值與玉米該比值相等。這些結(jié)果說明，該比值與蛋白質(zhì)含量無關(guān)，而與原料種類有關(guān)。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能是因為不同原料細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)等不同，使得蛋白質(zhì)消化程度不同。

本試驗最后檢測了不同來源的玉米與DDGS樣品H2O2-混合催化劑法與凱氏定氮法測定的蛋白質(zhì)含量，結(jié)果顯示，不同來源的玉米和不同來源的DDGS，兩種測定方法的比值都非常穩(wěn)定，再次證實H2O2-混合催化劑法與凱氏定氮法測定值的比值大小與原料種類有關(guān)。本結(jié)果為利用H2O2-混合催化劑法測定單一原料蛋白質(zhì)含量的可靠性提供了證據(jù)。

4 小 結(jié)

同一種原料蛋白質(zhì)含量用H2O2直接法和H2O2-混合催化劑法測定時，均極大地縮短消化時間，但其測定值均低于凱氏定氮法測定值，H2O2-混合催化劑法測定結(jié)果更接近凱氏定氮法，且消化20 min可獲得穩(wěn)定的測定值。不同原料H2O2-混合催化劑法與凱氏定氮法測定值的比值不相等，但不同來源同種原料樣品該比值穩(wěn)定，說明不同原料未充分消化或氮損失部分與原料蛋白質(zhì)含量無關(guān)，而與原料種類有關(guān)。因此，不能根據(jù)某種原料的H2O2-混合催化劑法與凱氏定氮法蛋白質(zhì)測定值的比值來推測其他原料的該比值，但可以通過建立不同單一原料凱氏定氮法蛋白質(zhì)測定值與H2O2-混合催化劑法蛋白質(zhì)測定值的比值數(shù)據(jù)庫，利用H2O2-混合催化劑法快速測定單一飼料原料的蛋白質(zhì)含量。