劉 偉，王曉江，王健超，鐘禮花，朱偉峰，林麗燕，陳 剛

2011年國際肺腺癌新分類提出了原位腺癌(adenocarcinoma in situ, AIS)、微小浸潤性腺癌(minimally invasive adenocarcinoma, MIA)的概念[1-2]。WHO(2015)肺腫瘤分類[3]亦采用了此概念，目前國內(nèi)病理學(xué)界已廣泛采用該分類標(biāo)準(zhǔn)，但目前國內(nèi)對于肺非黏液型MIA的臨床、影像學(xué)特征，最佳手術(shù)治療方式以及患者預(yù)后等情況尚缺乏大樣本回顧性分析。本文回顧性分析309例肺非黏液型MIA的臨床特征、影像學(xué)特點、病理學(xué)改變、手術(shù)方式及預(yù)后情況；并行CD34和TUBB3免疫組化染色，以了解兩者在輔助判斷早期浸潤中的價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集福建省腫瘤醫(yī)院2011年11月～2020年4月經(jīng)病理確診且臨床資料完整的肺非黏液型MIA 309例。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2011年國際肺腺癌新分類及WHO(2015)肺腫瘤分類中肺非黏液型MIA標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤以貼壁生長方式為主，最大浸潤灶<5 mm，且無淋巴管、血管侵犯、肺泡腔內(nèi)播散(spread through air spaces, STAS)、胸膜侵犯以及腫瘤壞死[1-8]。

1.2 方法手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，HE染色，鏡下觀察形態(tài)學(xué)特征。免疫組化染色采用EnVision兩步法，DAB顯色。所用一抗CD34(鼠單抗，克隆號QBEnd/10)、TUBB3(鼠單抗，克隆號TUJ1)均購自福州邁新公司。EnVision試劑盒購自福州邁新公司。具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 臨床特點309例肺非黏液型MIA中，男女比為1 ∶2，中位年齡54歲(25～75歲)，≥60歲者111例(35.9%)，<60歲者198例(64.1%)。因咳嗽、咳痰、胸悶等癥狀就診而發(fā)現(xiàn)腫瘤者48例(15.5%)，余261例患者(84.5%)因體檢或其他原因行肺部CT檢查時發(fā)現(xiàn)；僅8例(2.6%)患者CEA輕度升高(均<10 ng/mL，參考值<5 ng/mL)。有吸煙史者25例(8.1%)，非吸煙患者284例(91.9%)。

2.2 影像學(xué)特征在309例肺非黏液型MIA中，CT均表現(xiàn)為周圍型腫物，腫瘤位于左肺者124例(40.1%)，右肺者168例(54.4%)，雙肺者17例(5.5%)；單發(fā)病變者212例(68.6%)，多發(fā)病變97例(31.4%)；腫瘤最大徑0.5～3.0 cm，中位直徑1.0 cm，均為磨玻璃病變(ground-glass opacity, GGO)，其中單純型169例(54.7%)，混合型140例(45.3%，其中138例病變中的實性成分直徑<5 mm，僅2例>5 mm)；有毛刺或胸膜牽拉影像學(xué)表現(xiàn)者48例(15.5%)。

2.3 病理特征本組309例肺MIA均為非黏液型，腫瘤最大徑均<3.0 cm，大體表現(xiàn)為灰紅色腫物，質(zhì)地較周圍肺組織稍韌，部分可見灰白色質(zhì)韌區(qū)域(基本對應(yīng)微小浸潤灶)，邊界欠清。鏡下均存在AIS病變基礎(chǔ)，微小浸潤灶可以為單個，也可為多個，最大浸潤灶均<5 mm(圖1)。浸潤性成分中腺泡狀結(jié)構(gòu)最常見，小部分病例含有乳頭狀結(jié)構(gòu)(圖2)及纖維間質(zhì)中出現(xiàn)單個、條索狀、巢狀排列的腫瘤細(xì)胞(圖3)，無微乳頭狀癌、實性腺癌、膠樣癌、黏液癌、腸型腺癌以及胎兒型腺癌成分。所有病例均無淋巴管、血管、STAS、胸膜侵犯及腫瘤壞死。

圖1 MIA低倍鏡下，AIS成分肺泡結(jié)構(gòu)存在，浸潤灶中結(jié)構(gòu)紊亂，密度增加 圖2 高倍鏡下浸潤灶中腺體結(jié)構(gòu)紊亂，癌細(xì)胞呈復(fù)層、假復(fù)層排列，細(xì)胞核染色質(zhì)深，核質(zhì)比大，異型明顯，可見核仁、核分裂 圖3 纖維間質(zhì)中可見癌細(xì)胞巢，伴周圍纖維反應(yīng) 圖4 浸潤灶中癌巢周CD34染色明顯減少，間質(zhì)中的血管陽性，EnVision兩步法 圖5 浸潤灶癌巢周圍CD34染色大部分消失，間質(zhì)中血管陽性，EnVision兩步法 圖6 浸潤灶的癌細(xì)胞TUBB3陽性，而腫瘤中的AIS成分陰性，EnVision兩步法 圖7 浸潤灶的癌細(xì)胞TUBB3胞質(zhì)陽性，EnVision兩步法

2.4 肺非黏液型MIA中CD34和TUBB3的表達(dá)本組309例肺非黏液型MIA中，88例行CD34和TUBB3免疫組化檢測。CD34免疫組化結(jié)果顯示：正常肺組織及非浸潤成分[非典型腺瘤樣增生(atypical adenomatous hyperplasia, AAH)、AIS]中，肺泡壁中的毛細(xì)血管及基膜呈陽性，勾勒出肺泡壁的基本結(jié)構(gòu)，肺泡壁完整；而肺非黏液型MIA浸潤灶中的癌巢周染色明顯減少，呈間斷性分布，部分癌巢周陰性(圖4、5)。TUBB3免疫組化結(jié)果顯示：正常肺組織中肺泡上皮細(xì)胞及非浸潤成分(AAH、AIS)腫瘤細(xì)胞均陰性，58例(65.9%)肺非黏液型MIA浸潤灶癌細(xì)胞胞質(zhì)呈陽性(圖6、7)。

2.5 治療及預(yù)后309例肺非黏液型MIA中，196例(63.4%)行肺楔形切除術(shù)(其中118例合并淋巴結(jié)清掃)，113例(36.6%)行肺葉切除術(shù)+淋巴結(jié)清掃，所有病例的清掃淋巴結(jié)經(jīng)病理檢查均未見轉(zhuǎn)移癌。所有患者術(shù)后均未行放、化療。隨訪時間3～101個月，中位隨訪時間33個月，平均36個月，僅1例患者術(shù)后24個月同側(cè)肺葉復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)病灶再次行手術(shù)切除，病理示浸潤性腺癌，其余病例均無復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。復(fù)發(fā)病例首次手術(shù)中的微小浸潤灶中可見腺泡結(jié)構(gòu)及乳頭結(jié)構(gòu)，部分癌細(xì)胞核質(zhì)比較大，染色質(zhì)粗，可見明顯核仁。

3 討論

2011年國際多學(xué)科肺腺癌分類與WHO(2015)肺腫瘤分類基本一致，最主要的亮點是廢除了細(xì)支氣管肺泡癌(bronchioloalveolar carcinoma, BAC)的概念，提出了AIS和MIA的概念，并進(jìn)行了詳細(xì)的定義。將腫瘤細(xì)胞以貼壁方式沿肺泡壁生長，取代了原有肺泡上皮，且沒有間質(zhì)、胸膜及淋巴脈管浸潤的BAC定義為AIS[1-8]。AIS通常為單發(fā)、局限性病灶，肺泡間隔可能會因纖維增生而增寬，但無腫瘤細(xì)胞浸潤。MIA的定義是當(dāng)AIS病變的基礎(chǔ)上出現(xiàn)浸潤灶，任何浸潤灶范圍均≤5 mm，則稱之為MIA。由于穿刺活檢標(biāo)本局限，無法評價腫瘤的整體情況，因此在穿刺活檢中不可以作出MIA的病理診斷。

在臨床方面，傳統(tǒng)觀點認(rèn)為肺腺癌男性多于女性，且與吸煙密切相關(guān)。本組309例肺非黏液型MIA中，女性患者顯著多于男性(男女比為1 ∶2)，非吸煙患者顯著高于吸煙患者(91.9%vs8.1%，P<0.01)，這與以往情況顯著不同；且在103例男性患者中，非吸煙者亦顯著多于吸煙者(75.7%vs24.3%，P<0.01)。其次，患者發(fā)病年齡相對較年輕，60歲以下患者顯著多于60歲以上者(約2 ∶1)。臨床表現(xiàn)方面，因咳嗽、咳痰、胸悶等臨床癥狀就診發(fā)現(xiàn)病變者僅占15.5%；僅有2.6%患者CEA輕度升高(均<10 ng/mL)。以上研究提示，與傳統(tǒng)肺浸潤性腺癌不同，肺非黏液型MIA更常發(fā)生于60歲以下的較年輕人群，女性多于男性，發(fā)病更為隱匿，多數(shù)患者無相關(guān)臨床癥狀，肺部CT檢查是發(fā)現(xiàn)肺非黏液型MIA的最佳手段，而CEA檢測敏感性低，并不能作為提示肺部早癌的可靠指標(biāo)。

影像學(xué)方面，所有病例CT均表現(xiàn)為周圍型腫物，位于右肺者多于左肺，少量患者(5.5%)為雙肺多發(fā)病變；31.4%患者為多發(fā)性病變；腫瘤最大徑0.5～3.0 cm，單純型GGO占54.7%，混合型GGO占45.3%，伴有毛刺或胸膜牽影像學(xué)表現(xiàn)者15.5%。以上研究顯示，腫瘤直徑超過3 cm的GGO病變提示可能已達(dá)到浸潤性腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)；混合型GGO中的實性成分，提示為浸潤灶的可能性大，且一般直徑<5 mm，出現(xiàn)毛刺或胸膜牽拉亦提示有浸潤灶存在。另外，若腫瘤CT表現(xiàn)為完全性高密度實性結(jié)節(jié)而非GGO表現(xiàn)，則基本可以排除MIA、AIS等病變。CT檢查不但是發(fā)現(xiàn)肺部早癌的重要檢查方法，而且其影像學(xué)表現(xiàn)與病理學(xué)診斷有很好的相關(guān)性和一致性，可為臨床術(shù)前決定手術(shù)方式提供依據(jù)。另外，在冷凍病理診斷中，由于肺部早癌標(biāo)本含有氣體，質(zhì)地偏軟，尤其是純GGO，加之部分新鮮標(biāo)本可能還存在術(shù)中人工擠壓、燒灼等現(xiàn)象，導(dǎo)致冷凍制片的質(zhì)量往往會受到影響，切片質(zhì)量不佳，鏡下組織學(xué)形態(tài)“失真”，容易導(dǎo)致術(shù)中冷凍診斷不足或過度診斷等情況。冷凍診斷中病理醫(yī)師可以結(jié)合CT影像學(xué)表現(xiàn)，有助于提高術(shù)中冷凍診斷的準(zhǔn)確性。

在病理學(xué)方面，標(biāo)本大體表現(xiàn)為灰紅色腫物，質(zhì)地較周圍肺組織稍韌，部分病例可見灰白色質(zhì)地韌區(qū)域(基本對應(yīng)微小浸潤灶)，邊界欠清，這與普通浸潤性腺癌灰白色質(zhì)地韌、放射狀瘢痕樣的切面表現(xiàn)明顯不同。鏡下均存在AIS病變基礎(chǔ)，微小浸潤灶可以為單個，也可為多個，最大浸潤灶均<5 mm。當(dāng)有多個浸潤灶或浸潤灶大小不好估算時，有學(xué)者提出可以采用將浸潤成分所占比例乘以腫瘤最大徑，若結(jié)果<5 mm，則仍然歸為MIA。目前對于MIA定義中，除最大浸潤灶直徑<5 mm外，必須無淋巴管、血管、STAS、胸膜侵犯以及腫瘤壞死。在臨床病理實踐中發(fā)現(xiàn)，微乳頭狀癌、實性腺癌中，腫瘤與正常肺組織交界處，往往會出現(xiàn)STAS；膠樣癌、黏液癌、腸型腺癌中，產(chǎn)生的黏液成分及游離的腺癌上皮成分也極易進(jìn)入肺泡腔而出現(xiàn)STAS；另外胎兒型腺癌形態(tài)學(xué)上與MIA的形態(tài)截然不同，臨床上尚未發(fā)現(xiàn)其與AIS共存的情況，本組亦未見到胎兒型腺癌的浸潤成分。雖然目前AAH、AIS、MIA被認(rèn)定為浸潤性腺癌的特定發(fā)展路徑，但本實驗結(jié)果顯示，MIA中的浸潤成分為腺泡狀結(jié)構(gòu)和乳頭狀結(jié)構(gòu)或腫瘤細(xì)胞巢浸潤纖維性間質(zhì)，但并未見到微乳頭狀癌、實性腺癌、膠樣癌、黏液癌、腸型腺癌以及胎兒型腺癌等腫瘤成分，該類肺腺癌是否有新的發(fā)病機(jī)制，需待進(jìn)一步研究。另外文獻(xiàn)報道不同肺腺癌類型的分子學(xué)改變亦有較明顯的差別[9-11]。

對于肺非黏液型MIA的病理診斷，微小浸潤灶的確診至關(guān)重要。在臨床病理實踐中，當(dāng)AIS伴有間質(zhì)纖維性增寬及慢性炎癥細(xì)胞浸潤時，因間質(zhì)增寬而形成不規(guī)則的腺泡樣結(jié)構(gòu)，這與肺非黏液型MIA中真正的早期浸潤性病灶相比，形態(tài)學(xué)上有相似之處，判讀結(jié)果可能會存在差異。CD34最常表達(dá)于血管內(nèi)皮及血管源性腫瘤，肺泡壁中的氣-血屏障由Ⅰ型肺泡上皮、基膜及毛細(xì)血管內(nèi)皮構(gòu)成。按照AIS的定義，肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，未被腫瘤細(xì)胞浸潤和破壞，因此構(gòu)成氣-血屏障的毛細(xì)血管和基膜應(yīng)該存在，可以通過CD34染色顯示出肺泡壁的輪廓，以輔助判斷有無腫瘤細(xì)胞侵犯肺泡壁結(jié)構(gòu)。本實驗顯示，CD34在正常肺泡及非浸潤成分(AAH、AIS)的肺泡壁中毛細(xì)血管及基膜呈陽性，勾勒出肺泡壁的基本結(jié)構(gòu)，提示肺泡壁完整，未受破壞，而在浸潤灶的癌巢周染色明顯減少，呈間斷性分布，甚至陰性，提示肺泡壁受到癌細(xì)胞浸潤破壞，為浸潤性表現(xiàn)，提示CD34染色有助于微小浸潤灶的判斷。TUBB3作為微管蛋白家族成員之一，是神經(jīng)元特異性標(biāo)志物之一，在非小細(xì)胞肺癌中過表達(dá)同抗微管蛋白靶向藥物療效有關(guān)，其高表達(dá)同肺腺癌的5年復(fù)發(fā)率以及低生存率相關(guān)[12-13]。但TUBB3與肺腺癌早期浸潤的相關(guān)研究甚少。本組在前期臨床病理實踐中發(fā)現(xiàn)，TUBB3在浸潤前病變(AAH和AIS)腫瘤細(xì)胞中均為陰性，而在浸潤性腺癌中呈陽性。本實驗結(jié)果顯示，TUBB3在正常肺泡上皮及非浸潤成分(AAH、AIS)中均陰性，而在浸潤灶中陽性率高達(dá)65.9%，與非浸潤性成分及正常肺泡相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這與文獻(xiàn)報道[14-15]基本一致。上述結(jié)果提示CD34和TUBB3染色有助于判斷肺腺癌的早期浸潤。

在治療方面，臨床上對于肺非黏液型MIA是否需要術(shù)中清掃淋巴結(jié)尚有爭議[16-22]。本組中無論行肺楔形切除術(shù)還是肺葉切除術(shù)+淋巴結(jié)清掃，所有病例手術(shù)清掃淋巴結(jié)經(jīng)病理檢查均未見轉(zhuǎn)移癌。隨訪發(fā)現(xiàn)僅1例患者術(shù)后24個月同側(cè)肺葉復(fù)發(fā)，其余患者均無復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，預(yù)后極好，與文獻(xiàn)報道相符。復(fù)發(fā)病例首次手術(shù)中的微小浸潤灶較大(0.4 cm)，浸潤灶中可見腺泡結(jié)構(gòu)及乳頭結(jié)構(gòu)，伴周圍纖維間質(zhì)反應(yīng)，部分癌細(xì)胞核質(zhì)比例較大，染色質(zhì)粗，可見明顯核仁，呈高級別核的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，浸潤灶較大和高級別核可能是影響本例患者預(yù)后的因素。本實驗結(jié)果顯示，對于肺非黏液型MIA患者，楔形切除與肺葉切除術(shù)患者的預(yù)后差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示肺非黏液型MIA術(shù)中預(yù)防性清掃淋巴結(jié)可能無太多臨床意義。后續(xù)本組也將繼續(xù)隨訪下去，在更長的隨訪周期進(jìn)一步觀察患者的預(yù)后情況。