自加吉，李 彬，楊 娜，普元倩，李素芬，王唯斯，張 態(tài)，熊 偉

惡性胸膜間皮瘤(malignant pleural mesothelioma, MPM)具有高度侵襲性，其發(fā)病率和病死率在全球范圍內(nèi)仍呈上升趨勢。MPM的發(fā)病主要與石棉暴露有關(guān)，且患者預后較差，5年生存率僅為5%[1-2]。不同國家MPM的發(fā)病率差異較大，國外以澳大利亞最高，發(fā)病率約為3.54/10萬，國內(nèi)每年發(fā)病率為0.3～0.5/10萬，以云南省最高(8.5～17.75/10萬)[3-4]。目前，MPM的診斷標準主要為胸腔鏡活檢，缺乏準確的早期診斷標志物[5]。因此，發(fā)掘新的腫瘤標志物能有效提高早期MPM的檢出率，從而為患者提供及時的治療。

賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase, LOX)是一類銅依賴性胺氧化酶，其活性在膠原蛋白和彈性蛋白交聯(lián)中發(fā)揮作用[6]。LOX蛋白家族共有5個成員，分別為LOX、賴氨酰氧化酶樣蛋白1～4(lysyl oxidase like 1-4, LOXL1-4)[7]。LOX蛋白具有催化細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)交聯(lián)的作用，維持ECM的結(jié)構(gòu)和功能[7]。近年研究表明，LOX基因異常表達與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，尤其是在促進腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮重要作用[8]。然而，LOX基因在MPM中的表達及其發(fā)生、發(fā)展中的作用機制尚不明確。本實驗旨在闡明LOX基因在MPM中的表達情況，分析其對患者預后的影響，探索其臨床價值。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)人胸膜間皮細胞系MeT-5A和3種人MPM細胞系NCI-H28(上皮樣型)、NCI-H2052(肉瘤樣型)和NCI-H2452(雙相混合型)均購自美國典型菌種保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)。將3種MPM細胞系用含10%(v/v)胎牛血清(FBS)和1%(v/v)抗生素(100 U/mL青霉素，100 mg/L鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco, Thermo Scientific公司, USA)進行體外培養(yǎng)。將MeT-5A在含有厄爾平衡鹽溶液(BSS)，0.75 mmol/L的L-谷氨酰胺和1.25 g/L的碳酸氫鈉的培養(yǎng)基199(Nissui公司，Janpan)中培養(yǎng)，并補充3.3 nmol/L的表皮生長因子，400 nmol/L氫化可的松，870 nmol/L胰島素，20 mmol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液(HEPES)和10%(v/v)FBS。所有細胞置于37 ℃5%CO2的培養(yǎng)箱中。所有細胞系均通過短串聯(lián)重復序列(short tandem repeat, STR)分析進行鑒定，并使用TransDetect熒光素酶支原體檢測試劑盒檢查有無支原體的污染。

1.2 臨床資料收集2018年1月～2018年12月大理大學第一附屬醫(yī)院胸外科診治的9例MPM癌組織和配對相鄰正常胸膜組織(距癌組織5 cm)。其中男性6例，女性3例，平均年齡55.5歲(45.0～73.0歲)。將所有新鮮組織保存于-80 ℃冰箱。本實驗得到大理大學醫(yī)學院倫理委員會批準，所有參與者均已簽署知情同意書。

1.3 Western blot采用RIPA細胞裂解液收集蛋白質(zhì)樣品，BCA試劑盒(Thermo Scientific, USA)測定總蛋白質(zhì)濃度。用10%SDS-PAGE凝膠分離50 mg總蛋白樣品，然后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將PVDF膜在含5%脫脂牛奶的Tris緩沖液(TBS)中室溫封閉1 h，然后與兔抗LOX單克隆抗體(1 ∶1 000，GeneTex, USA)4 ℃孵育過夜。用TBST洗滌后，將PVDF膜用辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的山羊抗兔IgG(1 ∶5 000，美國Abcam公司)在4 ℃下孵育2 h。最后，用Pierce ECL Plus Western blot發(fā)光液(美國Thermo Scientific公司)檢測蛋白質(zhì)信號，并用Image Lab 5.2.1軟件(Bio-Rad Inc., USA)進行半定量分析。LOX蛋白的相對表達水平用目的條帶與內(nèi)參條帶之間的累積光密度(accumulated optical density, AOD)之比表示。實驗重復3次。

1.4 RT-qPCR使用TRIzol試劑(Invitrogen公司)從人正常胸膜組織和MPM組織中提取總RNA。采用qPCR RT Master Mix(Toyobo)將總RNA(1 μg)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。LOX正向引物:5′-TCTGGCCAG TACAGCATACAG-3′，反向引物:5′-CTTGGTCGGCT GGGTAAGAA-3′；GAPDH正向引物:5′-ACAACTTT GGTATCGTGGAAGG-3′，反向引物:5′-GCCATCAC GCCACAGTTTC-3′。使用SYBR Premix Ex Taq(Takara公司)進行qPCR分析。PCR產(chǎn)物用Mx3000P QPCR系統(tǒng)進行監(jiān)控。熱循環(huán)條件：95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，合計40個循環(huán)。LOX基因mRNA相對表達量采用2-△△Ct法計算。實驗重復3次。

1.5 Oncomine數(shù)據(jù)庫分析LOX基因在MPM組織與正常組織中的表達差異在Oncomine數(shù)據(jù)庫(http://www.oncomine.org)中設(shè)置搜索條件：(1)“Gene: LOX”；(2)“Analysis type: cancer vs. normal analysis”；(3)“Cancer type: other cancer-mesothelioma-pleural malignant mesothelioma ”；(4)“ Data type: mRNA” ，獲取正常肺組織、正常胸膜組織與MPM組織中的LOX基因mRNA表達差異[9]。

1.6 TCGA數(shù)據(jù)庫中下載MPM數(shù)據(jù)集使用R 3.6.3軟件的Cgdsr函數(shù)包從TCGA(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaHome2.jsp)下載并預處理MPM數(shù)據(jù)集的LOX基因mRNA表達RNA SeqV2數(shù)據(jù)meso_tcga_pan_can_atlas_2018_rna_seq_v2_mrna及其患者對應的病理資料meso_tcga，兩組數(shù)據(jù)通過TCGA病例ID進行合并。

1.7 TCGA MPM數(shù)據(jù)集篩選和分組MPM數(shù)據(jù)集共包含87例樣本，通過對應臨床數(shù)據(jù)資料進行對比篩選分析，剔除缺失及無效數(shù)據(jù)，僅保留TCGA數(shù)據(jù)庫中完整有效的82例MPM樣本。根據(jù)測序結(jié)果分析，MPM組織樣本中LOX基因的表達量為253.682～35 832.9，中位數(shù)為2 905.56，以該基因表達量中位數(shù)為界限分為LOX低表達和高表達。根據(jù)這個定義，MPM組織中LOX高表達組41例，低表達組41例。MPM病理分型：上皮型57例，肉瘤樣型2例，雙相混合型23例。

1.8 LOX基因mRNA表達與MPM患者預后的相關(guān)性采用基因表達譜動態(tài)分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis, GEPIA)(http://gepia2.cancer-pku.cn)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建Kaplan-Meier模型并進行Log-rank法檢驗，探究LOX基因mRNA表達量與MPM患者預后的關(guān)系。

1.9 MPM中LOX基因表達的相關(guān)基因分析根據(jù)文獻報道[10]選擇MPM的6種腫瘤標志物基因，分別是人類表皮生長因子含腓骨樣胞外基質(zhì)蛋白1(epidermal growth factor containing fibulin like extracellular matrix protein 1, EFEMP1)、間皮素(mesothelin, MSLN)、鈣結(jié)合蛋白2(calbindin 2, CALB2)、硫酸酯酶1(sulfatase 1, SULF1)、血小板反應蛋白2(thrombospondin 2, THBS2)和鈣黏蛋白11(cadherin 11, CDH11)。同時，選取LOX基因家族其它4個基因LOXL1～4。通過GEPIA數(shù)據(jù)庫在線檢索基因相關(guān)性分析(correlation analysis)，分別得出LOX基因表達與其它基因表達的相關(guān)性可視化分析圖。

1.10 統(tǒng)計學分析建立MPM臨床病理數(shù)據(jù)集，將患者年齡、性別、AJCC病理分期、T分期、M分期、N分期、腫瘤類型和LOX基因mRNA表達量進行量化賦值。采用R 3.6.3的Epicale函數(shù)包進行統(tǒng)計學分析及繪圖，使用Shapiro-Wilk法檢測MPM組織中LOX基因表達正態(tài)分布情況，結(jié)果顯示LOX基因表達水平不符合正態(tài)分布。因此，正常組織和MPM組織中LOX基因表達水平組間比較采用t檢驗。臨床病理參數(shù)組間比較采用χ2檢驗及Fisher精確概率法，生存分析采用Kaplan-Meier模型和Log-rank法檢驗，單因素和多因素分析采用Cox風險比例回歸模型，采用Pearson法進行基因表達的相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 人正常胸膜間皮細胞和MPM細胞中LOX基因的表達差異分別采用Western blot和RT-qPCR分析人MPM細胞系NCI-H28、NCI-H2052、NCI-H2452和人正常胸膜間皮細胞MeT-5A中LOX蛋白和mRNA的表達水平。Western blot結(jié)果表明，與MeT-5A細胞相比，3種人MPM細胞中LOX蛋白的表達水平均提高(P<0.05，圖1A)；RT-qPCR結(jié)果表明，與MeT-5A細胞相比，NCI-H28、NCI-H2052和NCI-H2452細胞中LOX基因mRNA的表達水平分別增加了1.451、1.986和2.041倍(P<0.05，圖1B)。

2.2 人正常胸膜間皮組織和MPM組織中LOX mRNA的表達差異通過RT-qPCR對9例MPM組織及其配對正常胸膜組織中LOX mRNA的相對表達量進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常胸膜組織相比，MPM組織中LOX mRNA表達量增加(P<0.05，圖2)。

圖2 RT-qPCR分析正常胸膜間皮組織和惡性胸膜間皮瘤組織中LOX mRNA表達水平

2.3 Oncomine數(shù)據(jù)庫分析LOX mRNA表達通過Oncomine數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)篩選分析，正常組織及MPM組織共49個樣本，其中，正常肺組織4例，正常胸膜組織5例，MPM組織40例。結(jié)果顯示，與正常肺組織和正常胸膜組織相比，MPM中LOX mRNA表達量顯著增加，相比正常組織升高3.320倍(P<0.01，圖3)。

圖3 Oncomine數(shù)據(jù)庫分析正常肺組織、正常胸膜組織與惡性胸膜間皮瘤組織中LOX mRNA的表達水平

2.4 MPM組織中LOX mRNA表達與臨床病理特征的關(guān)系在TCGA數(shù)據(jù)庫下載并整理得到臨床病理參數(shù)完整82例MPM，其中女性16例，男性66例，年齡28.0～81.0歲，中位年齡64.0歲。通過統(tǒng)計學分析得知，LOX mRNA表達與MPM患者T分期有顯著相關(guān)性(P<0.01)，而與患者年齡、性別、N分期、M分期、AJCC病理分期、腫瘤類型等均無相關(guān)性(P均>0.05，表1)。

表1 LOX mRNA表達與惡性胸膜間皮瘤臨床病理特征的關(guān)系

2.5 LOX mRNA表達與MPM患者預后的關(guān)系使用GEPIA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建Kaplan-Meier模型并進行Log-rank法檢驗，結(jié)果表明，LOX mRNA表達對MPM患者總生存率有顯著影響(Log-rankP<0.001)，高表達組的中位生存時間比低表達組顯著縮短(13.61個月vs24.07個月)，高表達組的HR為2.7。同時，MPM患者的LOX mRNA的表達量對無瘤生存率也具有顯著影響(Log-rankP=0.038)，高表達組的中位生存時間比低表達組顯著縮短(12.72個月vs24.07個月)，高表達組的HR為1.8。上述結(jié)果提示，MPM組織中LOX mRNA表達量越高，患者預后越差(圖4)。

圖4 LOX mRNA表達量與惡性胸膜間皮瘤患者預后的關(guān)系：A.總生存率；B.無瘤生存率

2.6 影響MPM患者預后的單因素和多因素分析對82例MPM患者預后的影響因素進行Cox比例風險回歸分析，結(jié)果顯示，LOX基因表達、腫瘤類型與MPM患者預后之間具有顯著相關(guān)性(P<0.05)。將上述有統(tǒng)計學意義的因素納入Cox多因素回歸分析，結(jié)果提示，非上皮型腫瘤與LOX基因高表達均是導致MPM患者預后不良的獨立危險因素(P<0.05，表2)。

表2 影響惡性胸膜間皮瘤患者預后的臨床病理特征的單因素和多因素分析

2.7 LOX基因表達與MPM腫瘤標志物基因和LOXL1～4基因表達的相關(guān)性通過GEPIA分析MPM的腫瘤標志物基因EFEMP1、MSLN、CALB2、SULF1、THBS2、CDH11與LOX基因的相關(guān)性。結(jié)果表明，MSLN與LOX基因表達呈負相關(guān)(P<0.01)；CALB2與LOX基因表達呈負相關(guān)(P<0.05)；THBS2基因與LOX基因表達呈正相關(guān)(P<0.01)；而LOX基因與EFEMP1、SULF1和CDH11基因表達無相關(guān)性(P>0.05，圖5)。

圖5 惡性胸膜間皮瘤組織中LOX基因與其他腫瘤標志物基因表達的相關(guān)性：A.LOX和EFEMP1；B.LOX和MSLN；C.LOX和CALB2；D.LOX和SULF1；E.LOX和THBS2；F.LOX和CDH11

本組還進一步分析了LOX基因與LOX家族其它成員基因表達的相關(guān)性，結(jié)果顯示LOXL2和LOXL4基因表達與LOX基因表達呈顯著正相關(guān)(P<0.01)，而LOXL1和LOXL3基因表達與LOX基因表達無相關(guān)性(P>0.05，圖6)。

圖6 MPM組織中LOX基因與LOXL1～4基因表達的相關(guān)性：A. LOX和LOXL1；B. LOX和LOXL2；C. LOX和LOXL3；D. LOX和LOXL4

3 討論

MPM患者生存期短、預后較差，臨床診斷對其治療及預后具有重要意義[11]。盡管如今醫(yī)療技術(shù)上取得了進步，但MPM患者的預后仍然較差，中位總生存時間約為1年[12]。MPM預后不良的主要原因是缺乏有效治療方案[13]。LOX基因定位于5q23.1，有8個外顯子，其編碼的LOX蛋白主要由平滑肌細胞和成纖維細胞生成，在人體子宮、胎盤、骨骼肌、腎臟、肺、胰腺、皮膚、血管及心肌細胞中均有表達[14]。此外，LOX蛋白還具有許多重要的生物功能，包括細胞的分化、運動、遷移以及基因調(diào)控等[15]。近期研究表明，LOX蛋白高表達通常預示結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌和肺癌患者的預后不良[16-18]。LOX蛋白在不同惡性腫瘤中表達的差異性成為近年的研究熱點，但其具體的作用機制仍未明確，目前認為表達差異是由LOX前肽(LOX pro-peptide, LOX-PP)的活性作用結(jié)果導致的。一項關(guān)于LOX-PP的研究發(fā)現(xiàn)，H1299肺癌細胞中異位LOX蛋白LOX-PP呈顯著高表達，認為LOX-PP有抑制腫瘤的作用，且LOX-PP是通過降低ERK和Akt的活性來發(fā)揮抑制腫瘤的作用[19]。另一項研究提示，乳腺癌組織中LOX-PP有抑制HER-2/neu信號通路的作用，而該通路正是LOX蛋白促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的重要通路[20]。因此認為LOX和LOX-PP是相互抑制的，在各種惡性腫瘤中LOX表達水平由LOX-PP和LOX表達的優(yōu)勢方所決定。

本實驗首先通過Western blot和RT-qPCR分析人MPM細胞系NCI-H28、NCI-H2052、NCI-H2452和MeT-5A中LOX基因的表達水平。結(jié)果表明，與MeT-5A細胞相比，3種人MPM細胞中LOX蛋白和mRNA的表達水平均提高(P<0.05)。本實驗還通過RT-qPCR對9例MPM組織及其配對正常胸膜組織中LOX mRNA的相對表達量進行檢測，發(fā)現(xiàn)與正常胸膜組織相比，MPM組織中LOX mRNA表達量增加(P<0.05)。最近，Kim等[10]已將LOX鑒定為MPM的潛在診斷生物學標志物，與非MPM組織相比，4種MPM生物學標志物的候選物LOX、LOXL1、LOXL2和鋅指蛋白FOG家族成員2(Zinc finger protein, FOG family member 2, ZFPM2)在MPM組織中的表達均顯著增加，這與本實驗結(jié)果一致。本組還對Oncomine基因芯片數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)挖掘，并分析了人類正常組織和MPM組織中LOX mRNA的表達差異，發(fā)現(xiàn)LOX基因在正常肺組織和正常胸膜組織中均呈低表達，而在MPM組織中高表達。通過病理相關(guān)性分析得出，LOX mRNA的表達量與腫瘤T分型顯著相關(guān)。這提示腫瘤患者T分期越高，LOX mRNA的表達量越高。Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，LOX基因高表達MPM患者的總生存率低于LOX基因低表達患者，提示LOX基因高表達的患者預后不良。其原因可能是LOX表達上調(diào)的腫瘤患者易發(fā)生局部轉(zhuǎn)移，進而影響轉(zhuǎn)移灶部位正常組織細胞的生長，從而影響相應器官和組織的代謝機能，導致患者的生存率下降[21]。Cox多因素分析結(jié)果表明，非上皮型腫瘤和LOX基因高表達是MPM患者預后不良的獨立危險因子。目前，EFEMP1、MSLN、CALB2、SULF1、THBS2、CDH11已被文獻報道作為MPM診斷的生物學標志物[10]?；虮磉_相關(guān)性分析結(jié)果表明，MSLN、CALB2基因與LOX基因表達呈顯著負相關(guān)，而THBS2基因與LOX基因的表達呈顯著正相關(guān)。同時，MPM中LOX家族中的LOXL2和LOXL4基因與LOX基因表達呈顯著正相關(guān)，提示LOX基因家族各成員之間可能是相互作用、協(xié)調(diào)表達的。目前，MPM的診斷及治療較棘手，早期診斷可以顯著提高患者的生存率，一些用于早期診斷的分子標志物，包括MSLN、CEA、CA125、CA153、CA199和CD90等的敏感性和特異性均有限。上述結(jié)果提示，MPM的發(fā)病機制極為復雜，通過多個生物學標志物的聯(lián)合應用可以更為準確有效地進行早期診斷。因此，LOX基因有望成為MPM診斷的新型腫瘤標志物。

本實驗采用TCGA數(shù)據(jù)庫提供的mRNA二代測序數(shù)據(jù)進行的分析，僅局限于LOX mRNA的表達水平，并未涉及到LOX蛋白表達水平的檢測結(jié)果。但本組納入的樣本量相對較大，臨床資料客觀完整，可信度高，能為進一步的實驗研究提供線索和依據(jù)。在后續(xù)研究中，本實驗將進一步通過免疫組化和Western blot檢測等方法，對LOX蛋白在MPM組織中的表達進行驗證，分析其預后意義，并深入探討LOX蛋白在MPM發(fā)生、發(fā)展中的功能和作用機制。另一方面，本組還將通過構(gòu)建LOX基因沉默的MPM細胞模型，探討其對于MPM細胞增殖和生長的影響，為臨床MPM的治療提供一定的實驗依據(jù)。