王 帥，馬 達，張 勇，孫志宏*

分離自傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶的益生菌干酪乳桿菌Zhang（LCZ），除了在體外具有良好的耐酸性、人工胃腸液耐受性及膽鹽耐受性等益生特性外，在動物試驗中已被證明具有改善腸道菌群、拮抗致病菌、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、預防治療腫瘤等多種有益功能[1-2]。關于LCZ 對機體認知能力的影響卻鮮有報道。此外，諸多研究表明腸道與大腦之間的雙向交流會影響焦慮、抑郁、認知和社交互動等行為[3-4]。同時，腸道菌群組成的龐大微生物系統(tǒng)寄居于腸道，并與宿主之間存在著共生的關系，使得微生物也參與腸道與大腦之間的雙向應答[5-6]。

目前，測試動物模型藥物干預后行為學的方法主要有：巴恩斯迷宮、莫里斯水迷宮、條件性恐懼試驗、新目標和新方位識別試驗、曠場試驗及轉(zhuǎn)輪試驗等[7-8]。其中，巴恩斯迷宮（Barnes）是美國學者Carol A Barnes 于1979年發(fā)明的用于檢測動物空間學習記憶能力的模型[9]，利用嚙齒類動物喜歡黑暗幽閉環(huán)境的天性建立，對動物的應激性刺激較小，不需要食物剝奪和足底電擊，也能夠一定程度上排除測試中大鼠肢體運動功能障礙對試驗的影響，在認知常規(guī)測試具有較高的認可度[10-11]。Pardo 等[12]利用Barnes 迷宮評估IGF-I 基因治療對老年雌性大鼠空間記憶能力的影響，結果發(fā)現(xiàn)經(jīng)IGF-I 基因治療的大鼠較對照組在Barnes 迷宮中對目標洞口的探查頻率高，空間記憶能力強。Savignac 等[13]在研究雙歧桿菌對BALB/c 小鼠認知能力的影響時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)雙歧桿菌干預的小鼠，其在Barnes 迷宮中探索錯誤洞口的次數(shù)較對照組少，空間學習能力強。本研究選擇巴恩斯迷宮試驗來評估益生菌LCZ 對大鼠的空間學習記憶能力的影響，以期為LCZ 干預對認知能力的影響提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF 級7 周齡SD 健康雄性大鼠（動物許可證號：SCXK（京）2016-0006），北京維通利華實驗動物技術有限公司；大小鼠生長維持飼料（大豆多肽占飼料質(zhì)量比2%），北京華阜康生物科技股份有限公司；益生菌LCZ，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳品生物技術與工程教育部重點試驗室；Barnes 迷宮 （型號：XR-XB108），上海欣軟信息科技有限公司。

1.2 動物分組及灌胃設計

將20 只大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠2 只，每天晝夜循環(huán)光照12 h，環(huán)境溫度20～25 ℃，相對濕度50%～60%。自由進食進水，每天更換飼料和飲水。適應性飼喂1 周后，隨機分組，設為對照組（NC 組，n=10）及益生菌LCZ 組（LCZ 組，n=10）。NC 組大鼠在適應性飼喂后的第1 周～第11 周每天灌胃生理鹽水1 mL，共10 周；LCZ 組大鼠在適應性飼喂后的第1 周～第11 周每天灌胃含有4×109CFU/mL 的LCZ 活菌液1 mL，共10 周。

1.3 大鼠體重與攝食量的測定

每周稱量大鼠體重并記錄。兩組大鼠于適應后的第1 周起每天早9：00 投放飼料，第2 天早9：00 稱量剩余飼料并記錄，最后計算出每周每只大鼠的攝食量情況。

1.4 Barnes 迷宮試驗測試大鼠的空間學習記憶能力

1.4.1 Barnes 迷宮設備 Barnes 迷宮是利用嚙齒類動物避光喜暗的特性而建立的，它由一個圓形平臺構成，在平臺的周邊布滿20 個穿透平臺的小洞，圓盤直徑122 cm，洞口直徑10 cm。在其中一個洞的底部連接一個黑暗的躲避盒，被稱為目標洞，試驗場所四周可以設置視覺參考物，經(jīng)過訓練，動物學習并記憶目標洞的位置。迷宮設置在光線暗的安靜房間，測試時可予探照白熾燈照耀其平臺上，還可配以規(guī)律的噪音以促進大鼠能盡快逃至目標箱。每次訓練后都用70%酒精噴灑清洗，轉(zhuǎn)動圓盤變換洞口對應的圓盤位置，但是目標洞的空間置不變，以防止大鼠通過嗅覺線索找到目標洞口，避免對行為學測試結果的干擾。試驗時將大鼠置于迷宮中央，在圓盤的頂部采用強光照射（200 W） 刺激試驗動物尋找并進入躲避洞口，采用視頻跟蹤系統(tǒng)軟件ANY maze 記錄試驗動物每次找到目標洞的時間。

1.4.2 Barnes 迷宮試驗

1.4.2.1 空間學習能力訓練 本研究在大鼠結束10 周灌胃后的第7 天開始采用Barnes 迷宮進行為期4 d 的空間學習能力訓練，每天訓練2 次，訓練開始時將大鼠放置在圓盤中央，開啟強光刺激，直到大鼠找到并進入目標洞，立即停止強光刺激，并讓其在目標洞中停留30 s，如果大鼠在240 s 內(nèi)仍然不能找到目標洞，則將其引導至目標洞并讓其在目標洞也停留30 s，每次訓練測試間隔15 min，記錄測試中大鼠到達目標洞的時間 （潛伏期）。

1.4.2.2 短期空間記憶能力的測試 大鼠在空間學習能力訓練開始后的第5 天進行一次空間記憶功能的測試，測試大鼠對訓練所獲得的短期空間記憶能力。測試時，將大鼠放置在圓盤中央，開啟強光刺激，直到大鼠找到并進入目標洞，但不讓大鼠在目標洞內(nèi)停留，記錄大鼠到達目標洞的時間（潛伏期）與運動軌跡。

1.5 統(tǒng)計學方法

用SPSS 22.0 統(tǒng)計分析軟件處理試驗數(shù)據(jù)，對于巴恩斯迷宮試驗中空間學習能力訓練期的行為學數(shù)據(jù)，以不同組別和訓練天數(shù)（重復測量數(shù)據(jù)）作為方差來源，采用有重復測量數(shù)據(jù)的雙因素方差分析。對于巴恩斯迷宮試驗短期空間記憶能力測試以及其它試驗的組間比較，采用獨立樣本t檢驗比較各組指標的差異顯著性，P<0.05 為差異顯著，各項指標以平均數(shù)±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 大鼠攝食量與體重測定結果

兩組大鼠于適應后的第1 周起每天早9：00投放飼料，第2 天早9：00 稱量剩余飼料并記錄，最后計算出每周每只大鼠的攝食量，結果如圖1所示，兩組大鼠第1～4 周攝食量均較高，其中NC組大鼠攝食量為 （24.91±0.86）g/只/d，LCZ 組大鼠攝食量為（24.98±0.09）g/只/d。第4～5 周其攝食量均降低，其中NC 組攝食量降低（3.11±0.68）g/只/d，LCZ 組大鼠攝食量降低（2.76±1.43）g/只/d。兩組大鼠在第4～9 周之間，攝食量出現(xiàn)波動，其中NC組大鼠在第4～6 周先增加（1.57±0.57）g/只/d，而后在第6～7 周降低（3.23±0.51）g/只/d，此后基本穩(wěn)定；而LCZ 組大鼠在第5～6 周增加至（23.15±2.01）g/只/d，此后在 第6～8 周下降至（20.44±0.33）g/只/d，第8～9 周又增加為（21.51±3.34）g/只/d。第8～11 周，兩組大鼠的攝食量變化趨勢一致，均降低。雖然整體來看，LCZ 組大鼠從第3～4 周開始攝食量高于NC 組，但兩組大鼠之間并沒有顯著性差異（P>0.05）。

圖1 大鼠第1～11 周的攝食量測定結果Fig.1 The food intake of rats from week 1 to 11

NC 組大鼠與LCZ 組大鼠于適應后的第1 周起分別灌胃生理鹽水與4×109CFU/mL 的LCZ 活菌液各1 mL，持續(xù)10 周，結果如圖2所示，對兩組大鼠的體重變化情況進行分析，發(fā)現(xiàn)兩組大鼠在前4 周的體重增長較快，其中NC 組大鼠的體重由（190.09±11.14）g 增至（366.75±26.65）g，每周體重增長（44.17±5.64）g；LCZ 組大鼠的體重由（193.00±7.72）g 增至（366.10±14.33）g，每周體重增長（43.28±2.45）g。從第5 周開始體重增長趨于平緩，其中NC 組大鼠的體重由（366.75±26.65）g增至（460.83±30.28）g，每周體重增長（13.44±1.39）g；LCZ 組大鼠的體重由（366.10±14.33）g 增至（454.53±24.75）g，每周體重增長（12.63±2.72）g。雖然整個試驗周期NC 組大鼠的體重均略高于LCZ組大鼠體重，但兩組之間沒有顯著性差異（P>0.05）。

圖2 大鼠第0～11 周的體重測定結果Fig.2 The body weight of rats from week 0 to 11

2.2 Barnes 迷宮行為學測試結果

在空間學習能力訓練的過程中，有重復測量數(shù)據(jù)的雙因素方差分析結果顯示訓練天數(shù)對大鼠潛伏期具有顯著性影響（圖3），與第1 天相比，大鼠第3 天潛伏期縮短顯著（P=0.049）（圖3），第4天潛伏期縮短極顯著（P=0.001）（圖3）。兩組大鼠在4 d 的空間學習能力訓練期間潛伏期均逐漸縮短，NC 組大鼠雖然在第3 天出現(xiàn)延長，但隨后再次縮短，差異并不顯著（圖3）。兩組大鼠第1 天的潛伏期幾乎一致，其中NC 組大鼠的潛伏期為（212.61±34.92）s，LCZ 組大鼠為（207.59±42.38）s。從第2 天開始兩組大鼠潛伏期明顯縮短，其中NC組大鼠的潛伏期比第1 天縮短 （25±86.31）s，為（187.61±75.73）s，而LCZ 組大鼠的潛伏期為（139.99±74.98）s，比第1 天縮短（67.6±51.71）s。之后，兩組出現(xiàn)顯著差異，第3 天，LCZ 組大鼠的潛伏期（115.10±87.38）s，比NC 組顯著縮短（95.63 s±86.78 s，P<0.05）。NC 組大鼠第4 天的潛伏期較第3 天縮 短（38.53±90.82）s，為（172.20±84.65）s，而LCZ 組大鼠為 （87.80±63.18）s，顯著短于NC 組（P<0.05）。結果表明，益生菌LCZ 可顯著改善大鼠空間學習能力。

圖3 大鼠Barnes 迷宮空間學習能力訓練結果Fig.3 The spatial learning of rats in Barnes maze

在短期空間記憶的測試中（空間學習能力訓練后的第1 天） 獨立樣本t 檢驗分析結果顯示LCZ 組大鼠潛伏期為（93.65±71.88）s 顯著短于NC組（174.42 s±77.51 s，P<0.05）（圖4a）。空間學習能力訓練后的第1 天，如圖4b 所示，圖中藍色圓形表示迷宮圓形平臺，中央紅色實心點表示大鼠起始位置，紅色圓形表示目標箱位置，綠色線條表示大鼠運動軌跡，由圖可知，NC 組大鼠軌跡分布雜亂，很難找到目標洞口，而LCZ 組大鼠軌跡分布更清晰，目標更明確，能夠較迅速找到目標洞口并進入。結果表明，益生菌LCZ 可顯著改善大鼠短期空間記憶能力。

圖4 大鼠Barnes 迷宮短期空間記憶測試結果Fig.4 The short-term spatial memory of rats in Barnes maze

3 討論

本研究為探討益生菌LCZ 對大鼠的認知能力的影響，以LCZ 為研究對象，基于LCZ 組每只大鼠攝入4×109CFU/d 的活菌液劑量進行10 周的大鼠飼喂試驗與5 d 的Barnes 迷宮試驗。

體重是反映生物體健康狀況的一項重要指標，與攝食量保持精確的能量代謝動態(tài)平衡。本研究中，試驗期間兩組大鼠的體重雖無顯著性差異但呈逐漸增長的趨勢。其中兩組大鼠第1～4 周的攝食量較多，第0～4 周的體重增長較快，此階段大鼠為6～10 周齡，屬青春期[14]。兩組大鼠第5～11 周的攝食量較少，第5～11 周體重增長較緩且逐漸趨于穩(wěn)定，此階段大鼠為11 周齡以上，屬成年期[14]。

本研究首先提出了利用益生菌LCZ 干預大鼠來研究其對大鼠空間學習記憶能力的影響。在Barnes 迷宮試驗中，LCZ 組大鼠在訓練期間潛伏期顯著短于NC 組大鼠，其空間學習能力更強，與Savignac 等[13]報道中，經(jīng)長雙歧桿菌或短雙歧桿菌干預的BALB/c 小鼠在Barnes 迷宮訓練期間的潛伏期均低于對照組大鼠的結果相近，值得一提的是本研究結果具有顯著性差異；LCZ 組大鼠在測試期間潛伏期顯著短于NC 組大鼠，其短期空間記憶能力更強，與趙寧軍[15]發(fā)現(xiàn)缺血并給予Boc-D-CMK 治療組的大鼠定位到目標逃離暗箱的時間明顯短于缺血組大鼠的結果相一致。以上結果表明，益生菌LCZ 可以顯著改善大鼠空間學習記憶能力。

腸道菌群參與了宿主的營養(yǎng)、免疫、代謝甚至神經(jīng)發(fā)育等多個過程，認為是宿主的第二套基因組[16]。益生菌作為腸道菌群中的一員，被證明具有調(diào)節(jié)腸道菌群結構的功能。LCZ 干預對腸道菌群多樣性有著重要的影響。Zhang 等[17]通過小規(guī)模人群試驗評價了LCZ 對不同年齡人群腸道微生物群落的影響，結果發(fā)現(xiàn)LCZ 干預顯著增加了有益菌如雙歧桿菌、短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌和抗炎癥細菌的豐度。LCZ 與腸道中考拉桿菌的數(shù)量呈負相關的關系，同時下調(diào)了條件致病菌梭菌、沙雷氏菌、腸球菌和志賀氏菌的豐度。這說明LCZ 干預對腸道菌群多樣性有著重要的影響。

近年來，諸多研究表明腸道微生物可以調(diào)節(jié)宿主的認知能力，其主要通過調(diào)控迷走神經(jīng)、免疫因子和下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）進而調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)改變宿主的認知和行為[18]。迷走神經(jīng)由大約80%的傳入神經(jīng)構成，主要收集從食道到結腸的感覺信號，將之傳入到中樞。Goehler 等[19]利用空腸彎曲桿菌引入雄性CF1 小鼠胃腸道，并在4～12 h 后通過免疫組織化學評估迷走感覺神經(jīng)元和大腦中神經(jīng)元激活標記c-Fos 的表達發(fā)現(xiàn)，空腸彎曲桿菌的干預導致迷走神經(jīng)節(jié)兩側神經(jīng)元的c-Fos 表達顯著增加，小鼠表現(xiàn)出了明顯的焦慮行為，而循環(huán)中的促炎細胞因子水平卻沒有升高，表明在這個階段機體主要的免疫反應未啟動，從而證明該現(xiàn)象不是由細胞因子介導的。而在慢性細菌感染的試驗中，Bercik 等[20]使用幽門螺桿菌慢性感染BALB/c 小鼠，發(fā)現(xiàn)可導致該小鼠胃排空延遲及內(nèi)臟敏感性下降，從而出現(xiàn)異常攝食行為，該異常攝食行為伴有血漿生長素釋放肽和餐后肌酸激酶升高、腫瘤壞死因子α（正中隆起）升高和POMC（弓狀核）mRNA 降低，表現(xiàn)為進食次數(shù)增多而進食量少，其進食模式的機制可能與弓狀核POMC的下調(diào)和下丘腦正中突起的前炎癥因子的表達增多有關。HPA 軸也是腸道菌群影響中樞的重要途徑。Sudo 等[21]利用無菌小鼠首次探究了腸道菌群和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的相關性，其結果表明無菌小鼠的HPA 應激反應較SPF 級小鼠明顯增強，無菌小鼠的血漿促腎上腺皮質(zhì)激素和皮質(zhì)酮在抑制應激反應中也顯著升高。隨后經(jīng)嬰兒雙歧桿菌干預的無菌小鼠，其HPA 應激反應與干預前相比明顯減弱。相比之下，經(jīng)腸致病性大腸桿菌干預的無菌小鼠，其HPA 應激反應與干預前相比明顯增強。這表明，腸道菌群可以影響小鼠HPA 應激反應。因此，本研究中LCZ 組大鼠的空間學習能力與短期空間記憶能力得到顯著改善，可能是益生菌LCZ通過增加微生物的多樣性和益生菌豐度改善腸道菌群進而調(diào)節(jié)迷走神經(jīng)或免疫因子或下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）從而調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)改善大鼠空間學習記憶能力。

本研究中，NC 組大鼠在訓練期的第3 天潛伏期出現(xiàn)延長隨后又在第4 天縮短，與Mchail 等[22]利用Barnes 迷宮探究幼年大鼠空間導航能力的研究中，大鼠在訓練期間潛伏期出現(xiàn)波動的結果相近，這可能是大鼠個體差異導致。

4 結論

本研究首先提出了利用益生菌LCZ 干預大鼠來研究其對大鼠空間學習記憶能力的影響。通過評估大鼠在Barnes 迷宮中的潛伏期，證實了益生菌LCZ 對大鼠空間學習記憶能力具有顯著的改善作用。通過研究益生菌LCZ 對大鼠空間學習記憶能力的影響，為益生菌干預對認知能力的影響的方法提供一定的理論依據(jù)。