HPLC-CAD法分離測(cè)定三金片中同分異構(gòu)體積雪草苷B和羥基積雪草苷

鄒 準(zhǔn)，閔建國(guó)，吳敏菊，鐘小清，周艷林，鄒節(jié)明

桂林三金藥業(yè)股份有限公司，廣西 桂林 541004

三金片由積雪草、金櫻根、金沙藤等5味中藥組成，具有清熱解毒、利濕通淋、益腎之功效，臨床應(yīng)用于治療急、慢性腎盂腎炎，膀胱炎、尿路感染及慢性非細(xì)菌性前列腺炎等泌尿系感染疾病，臨床療效確切，成長(zhǎng)為中藥大品種之一。

自《中國(guó)藥典》2000年版收載以來(lái)，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不斷提升完善，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)【含量測(cè)定】采用HPLCELSD法測(cè)定處方藥味積雪草的主要藥效成分羥基積雪草苷含量[1]。研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn)，按照《中國(guó)藥典》2020年版方法檢測(cè)的羥基積雪草苷，實(shí)際混雜有難以分離的同分異構(gòu)體積雪草苷B[2]。有關(guān)二者的分離測(cè)定研究，一直是制藥行業(yè)的難點(diǎn)，特別是在處方中含積雪草藥材的中成藥制劑中二者的準(zhǔn)確定量分析[3-4]和純化分離研究富有挑戰(zhàn)性[5]，2個(gè)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 羥基積雪草苷和積雪草苷B的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of madecassoside and asiaticoside B

為了真實(shí)反映其內(nèi)在質(zhì)量屬性，本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性地利用C30色譜柱進(jìn)行分離，并結(jié)合近年來(lái)發(fā)展應(yīng)用于無(wú)紫外吸收物質(zhì)檢測(cè)的新型通用型電噴霧檢測(cè)器（CAD）分析測(cè)定了其中積雪草苷B和羥基積雪草苷的含量[6]，結(jié)果表明該方法具有靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，可用于本品藥典質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升研究。

1 儀器、藥品與試劑

1.1 儀器

賽默飛Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀，配三元泵、Corona Veo電噴霧檢測(cè)器和變色龍色譜軟件（7.1版），美國(guó)賽默飛世爾科技公司；BG-60超聲儀，必能信（上海）有限公司。

1.2 對(duì)照品來(lái)源及純度

羥基積雪草苷，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110893-201403，質(zhì)量分?jǐn)?shù)91.4%；積雪草苷B為自制，并按《中藥新藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究用對(duì)照品研究技術(shù)要求》進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確證和純度檢查。

1.2.1 積雪草苷B結(jié)構(gòu)鑒定 白色無(wú)定形粉末。mp 217～220 ℃；UV (CH3OH)λmax: 192 nm；IR (KBr)cm-1: 3 418.3 (OH), 2 935.8 (C-H), 1 732.2 (COO-),1 644.3 (C=C), 1 460.3, 1 382.4, 1 262.6, 1 238.0,1 062.9 (C-O), 1 033.8, 812.5；ESI-MSm/z: 1019, 974,503；1H-NMR (400 MHz, C5D3N)δ: 6.32 (1H, d,J=8.0 Hz, -C=CH), 5.12 (12H, 4-CH2OH), 0.98 (3H, d,J= 8.0 Hz), 1.29 (3H, s), 1.83, 1.93 (6H, s), 1.99 (3H,s), 2.17 (3H, s)；13C-NMR (125 MHz, C5D3N)δ: 47.5(C-1), 69.4 (C-2), 78.7 (C-3), 43.2 (C-4), 49.2 (C-5), 68(C-6), 42.1 (C-7), 39.8 (C-8), 49.2 (C-9), 38.6 (C-10),24 (C-11), 123.5 (C-12), 143.9 (C-13), 44.9 (C-14),28.7 (C-15), 24.4 (C-16), 44.9 (C-17), 42.1 (C-18), 47.4(C-19), 31.1 (C-20), 33.4 (C-21), 32.9 (C-22), 66.6 (C-23), 16.4 (C-24), 18.9 (C-25), 19.5 (C-26), 26.4 (C-27),176.9 (C-28), 33.4 (C-29), 24 (C-30), 96.1 (Glu C-1′),74.4 (Glu C-2′), 78.6 (Glu C-3′), 70.7 (Glu C-4′), 76.9(Glu C-5′), 70.7 (Glu C-6′), 105.2 (Glu C-1′′), 75.7 (Glu C-2′′), 76.9 (Glu C-3′′), 78.3 (Glu C-4′′), 76.9 (Glu C-5′′), 61.7 (Glu C-6′′), 103.1 (Rha C-1′′′), 72.9 (Rha C-2′′′), 73.1 (Rha C-3′′′), 74.4 (Rha C-4′′′), 69.4 (Rha C-5′′′), 19.2 (Rha C-6′′′)。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的積雪草苷B數(shù)據(jù)一致[7]。

1.2.2 積雪草苷B純度檢測(cè) 精密稱(chēng)取干燥至恒定質(zhì)量的積雪草苷B對(duì)照品適量，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含1 mg/mL積雪草苷B對(duì)照品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)測(cè)定3次，用歸一化法計(jì)算平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%，RSD為0.22%，符合定量用對(duì)照品純度要求，色譜圖如圖2所示。

圖2 積雪草苷B純度檢測(cè)色譜圖Fig.2 HPLC chromatography of asiaticoside B

1.3 藥品與試劑

三金片由桂林三金藥業(yè)股份有限公司提供，批號(hào)分別為170320、170501、170910、180402、180409、180420、181208、190936、191001、191005、191102。流動(dòng)相甲醇和乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Thermo AcclaimTMC30色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），甲醇-乙腈-水（35∶8∶57）為流動(dòng)相，柱溫為35 ℃，體積流量為1 mL/min，電噴霧檢測(cè)器（corona veo）的氣化溫度為50 ℃。供試品溶液、對(duì)照品溶液及缺積雪草陰性溶液的色譜圖如圖3所示。

圖3 積雪草苷B (a)、三金片樣品 (b)、羥基積雪草苷 (c)及缺積雪草陰性樣品 (d) 的HPLC圖Fig.3 HPLC of asiaticoside B (a), Sanjin Tablets sample (b),madecassoside (c), and negative sample without Centella asiatica (d)

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取干燥至恒定質(zhì)量的積雪草苷B和羥基積雪草苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解并分別稀釋至25、10 mL，配制成質(zhì)量濃度分別為1.228、3.135 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取三金片30片（小片）或20片（大片），研細(xì)，取約1.0 g，精密稱(chēng)定，精密加入甲醇50 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W、頻率40 kHz）45 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液25 mL，回收溶劑至干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

取“2.2.1”項(xiàng)下各對(duì)照品溶液，按5、10、20、25、50倍稀釋配制系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。以各對(duì)照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為積雪草苷BY＝33.654 3X－0.034 0，r＝0.999 3；羥基積雪草苷Y＝30.674 8X＋0.768 6，r＝0.998 4。結(jié)果表明，積雪草苷B在進(jìn)樣量0.240 7～2.406 9 μg、羥基積雪草苷在進(jìn)樣量0.573 1～5.730 8 μg與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品（批號(hào)181208），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算積雪草苷B和羥基積雪草苷的含量。結(jié)果積雪草苷B的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.80 mg/g，RSD為0.80%，羥基積雪草苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.06 mg/g，RSD為1.78%。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品（批號(hào)181208），平行制備6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別測(cè)定，結(jié)果積雪草苷B的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.77 mg/g，RSD為1.37%；羥基積雪草苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.98 mg/g，RSD為1.49%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液（批號(hào)181208），分別于制備后0、3、6、9、12、24、48 h的時(shí)間間隔測(cè)定，結(jié)果積雪草苷B平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.79 mg/g，RSD為1.48%；羥基積雪草苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.98 mg/g，RSD為1.11%。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取重復(fù)性試驗(yàn)同一批號(hào)樣品（批號(hào)181208），平行取6份，各約0.5 g，精密稱(chēng)定，分別精密加入積雪草苷B對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為1.228 mg/mL）0.6 mL和羥基積雪草苷對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為3.135 mg/mL）0.7 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備加樣回收供試品溶液，并分別測(cè)定和計(jì)算加樣回收率。結(jié)果積雪草苷B、羥基積雪草苷平均加樣回收率分別為100.26%、98.32%，RSD分別為0.69%、1.78%。

2.8 方法耐用性試驗(yàn)

取重復(fù)性試驗(yàn)同一批號(hào)樣品（批號(hào)181208），經(jīng)不同體積流量（1±0.1）mL/min、不同色譜柱溫（35±4）℃和流動(dòng)相中乙腈比例（8±1）%單因素影響實(shí)驗(yàn)，以及不同廠家色譜柱（YMC carotenoid C30250 mm×4.6 mm，5 μm；Welch Ultimate?XBC30250 mm×4.6 mm，5 μm和Thermo Scientific AcclaimTMC30250 mm×4.6 mm，5 μm）考察，上述各測(cè)定結(jié)果與重復(fù)性測(cè)定樣品中2指標(biāo)成分測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異，RSD小于3%。

2.9 定量限考察

取“2.3”項(xiàng)下羥基積雪草苷和積雪草苷B對(duì)照品溶液，加甲醇依次稀釋成適宜的質(zhì)量濃度，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，使信噪比為10∶1，結(jié)果測(cè)得羥基積雪草苷和積雪草苷B的定量限分別為57.308 ng和60.172 ng（羥基積雪草苷對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度為5.730 8 μg/mL，積雪草苷B對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度為6.017 2 μg/mL）。

2.10 樣品測(cè)定

取各批次三金片樣品，按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液和“2.1”色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。可見(jiàn)，11批樣品中積雪草苷B在1.65～3.18 mg/g，羥基積雪草苷在3.49～7.90 mg/g，二者總量在5.14～11.08 mg/g。上述檢測(cè)結(jié)果表明，三金片中2個(gè)指標(biāo)成分較穩(wěn)定，低含量批次與高含量批次范圍在2倍以內(nèi)，且表現(xiàn)出同增同減的關(guān)聯(lián)性。

表1 11批三金片樣品含量測(cè)定結(jié)果 (n = 2)Table 1 Determination results of 11 batches of Sanjin Tablets (n = 2)

3 討論

三金片為《中國(guó)藥典》2020年版收載品種，其【含量測(cè)定】項(xiàng)以羥基積雪草苷作為測(cè)定指標(biāo)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，常規(guī)C18色譜柱未能將互為同分異構(gòu)體的積雪草苷B和羥基積雪草苷有效分離。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[8-9]，在流動(dòng)相添加β-環(huán)糊精（β-CD）可以實(shí)現(xiàn)二者有效分離，但添加β-CD的流動(dòng)相存在顯著缺陷，積雪草苷B色譜峰容易受到流動(dòng)相中β-CD的濃度變化而發(fā)生保留時(shí)間飄移，且β-CD易導(dǎo)致色譜柱柱壓升高及損耗色譜柱[10]。C30色譜柱采用聚合型的鍵合方式方法，在硅膠表面形成致密的多層C30烷基鏈，因而有比常規(guī)單層鍵合的C18色譜柱更長(zhǎng)的烷基鏈，有更強(qiáng)的疏水性，因而對(duì)非極性溶質(zhì)的保留能力和分辨率更高，同時(shí)對(duì)長(zhǎng)鏈的異構(gòu)體有非常好的分離能力，故而張勇等[11]利用C30色譜柱分離齊墩果酸同分異構(gòu)體有較好的表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)系列研究篩選出C30色譜柱，采用常規(guī)流動(dòng)相，即可實(shí)現(xiàn)有效分離并準(zhǔn)確評(píng)價(jià)三金片中積雪草苷B和羥基積雪草苷含量，可供齊墩果烷型和烏蘇烷型同分異構(gòu)體皂苷的分離測(cè)定提供參考，相關(guān)的分離原理有待下一步深入研究。

三金片成分復(fù)雜，對(duì)比了超聲提取、加熱回流提取等不同提取方法，超聲處理30、45、60 min及回流2 h不同提取時(shí)間，甲醇、無(wú)水乙醇、95%乙醇不同提取溶液的效果，結(jié)果表明甲醇50 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）45 min為最簡(jiǎn)便高效提取條件。

原標(biāo)準(zhǔn)采用正丁醇提取純化皂苷成分，實(shí)際操作繁瑣，且易產(chǎn)生操作誤差，現(xiàn)改進(jìn)為甲醇超聲處理得到提取液，蒸干后直接采用流動(dòng)相（甲醇-乙腈-水混合溶劑）進(jìn)行沉淀除雜純化，能有效富集目標(biāo)成分，具有效果好、經(jīng)濟(jì)環(huán)保、簡(jiǎn)單快捷的特點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)比較了相同液相條件下，C30色譜柱聯(lián)合不同類(lèi)型檢測(cè)器（UV、ELSD和CAD）測(cè)定二者含量的方法。結(jié)果表明，UV檢測(cè)法中，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm時(shí)，色譜圖中的2個(gè)目標(biāo)成分難以達(dá)到基線分離，無(wú)法進(jìn)行有效積分；ELSD檢測(cè)法中，平行進(jìn)樣中2個(gè)目標(biāo)成分積分面積偏差較大（重復(fù)性實(shí)驗(yàn)RSD為8.5%），特別對(duì)含量較低的積雪草苷B影響更為顯著。CAD檢測(cè)法具有靈敏度高的特點(diǎn)[12]，適用于紫外吸收較弱的成分檢測(cè)，較目前常用的蒸發(fā)光散射檢測(cè)器靈敏度顯著提高，較紫外檢測(cè)器基線干擾小，可以為此類(lèi)含量偏低吸收偏弱成分的定量檢測(cè)提供更好的選擇。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突