關(guān) 琦，張化蓮*，張珊珊，秦紅娟

1.駐馬店市中心醫(yī)院 產(chǎn)科，河南 駐馬店 463000

2.河南省人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450000

妊娠期高血壓疾?。╤ypertension disorder complicating pregnancy，HDCP）是孕婦常見疾病之一，其發(fā)生與先兆子癇、剖宮產(chǎn)、腦血管疾病、胎兒生長受限、早產(chǎn)以及孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡等密切相關(guān)[1-2]。HDCP使妊娠復(fù)雜化，嚴(yán)重危及母嬰安全[3]。HDCP病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，越來越多的研究表明，HDCP與多種因素引起的母胎代謝或免疫平衡有關(guān)，而胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞作為妊娠建立和維持的基礎(chǔ)，其功能異常后會(huì)導(dǎo)致胎盤形成受阻，釋放大量炎性因子，使血管內(nèi)皮受損，最終導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生[4-5]。

竹節(jié)參Panax japonicus(T.Nees) C.A.Mey.是五加科人參屬植物，竹節(jié)參總皂苷是其主要有效成分，具有鎮(zhèn)痛、抗衰老、抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)以及神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)等作用[6-7]。竹節(jié)參總皂苷對(duì)Triton WR-1339誘導(dǎo)的高脂血癥小鼠具有一定的調(diào)血脂作用[8]，而竹節(jié)參總皂苷在HDCP中的作用至今卻未見報(bào)道。人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞株HTR-8/SVneo是一種永生化的滋養(yǎng)層細(xì)胞系，具有許多與人類原代滋養(yǎng)層細(xì)胞相似的特性，目前已成為研究胎盤功能和妊娠相關(guān)疾病的主要細(xì)胞系。本研究采用亞硝基左旋精氨酸甲酯（N-nitro-L-arginine methylester，L-NAME）干預(yù)HTR-8/SVneo細(xì)胞模擬HDCP微環(huán)境，探討竹節(jié)參總皂苷對(duì)HDCP胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及自噬的影響，并初步探究其作用機(jī)制，從而為HDCP的研究及診治提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。公司；CCK-8試劑盒（批號(hào)42022ES34）和Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（批號(hào)40302ES20）購自北京全式金生物科技公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（批號(hào)A00312）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（批號(hào)A00132）、谷胱甘肽（glutataione，GSH）檢測試劑盒（批號(hào)A00512）購自南京建成生物工程研究所；TRIzol試劑盒（批號(hào)15596-026）、SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒（批號(hào)RR047A）購自日本Takara公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)050720190702）購自上海生工生物工程有限公司；細(xì)胞裂解液（批號(hào)P0013）、BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)P0010S）、PVDF膜（批號(hào)P0016S）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；脂肪酸結(jié)合蛋白4（fatty acid binding protein 4，F(xiàn)ABP4）抗體（批號(hào)3579S）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-II（microtubule associated protein 1 light chain 3 II，LC3-II）抗體（批號(hào)3868S）、LC3-I抗體（批號(hào)4599S）、p62抗體（批號(hào)3534S）、自噬效應(yīng)蛋白（Beclin-1）抗體（批號(hào)3495S）購自美國CST公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號(hào)TA-1203）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體（批號(hào)ZB-2306）購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.3 儀器

1 材料

1.1 細(xì)胞

HTR-8/SV-neo細(xì)胞購自上海瑞鹿生物技術(shù)有限公司。

1.2 藥品與試劑

竹節(jié)參總皂苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85.4%）由首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；L-NAME（批號(hào)1115878）購自美國Sigma公司；胎牛血清（批號(hào)2166446）、青霉素-鏈霉素（批號(hào)20190909）購自美國Gibco公司；DMEM/F12培養(yǎng)基（批號(hào)C11995500CP）購自美國Thermo Fisher Scientific

BC-J160S細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；低溫高速離心機(jī)（德國Heraeus公司）；MACSQuant Analyzer流式細(xì)胞儀（德國Miltenyi公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；DYY-6C電泳儀（北京六一儀器廠）；PCR擴(kuò)增儀（美國ABI公司）；M340651酶標(biāo)儀（北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HTR-8/SV-neo細(xì)胞用含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）的DMEM/F12培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液1次，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代，使用第3～5代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 竹節(jié)參總皂苷對(duì)HTR-8/SV-neo細(xì)胞活力的影響

取處于對(duì)數(shù)生長期的HTR-8/SV-neo細(xì)胞，以4×104/mL接種至96孔板，培養(yǎng)12 h。設(shè)置對(duì)照組、模型組和竹節(jié)參總皂苷（20、40、80 μg/mL）[9]組，模型組和各給藥組加入L-NAME（100 μmol/L）處理48 h；各給藥組再加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，加入10 μL CCK-8試劑，孵育1 h，采用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度（A）值。

2.3 竹節(jié)參總皂苷對(duì)HTR-8/SV-neo細(xì)胞凋亡的影響

按“2.2”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞和分組，收集細(xì)胞，以PBS洗滌2次，加入500 μL 1×Binding Buffer重懸，加入5 μL Annexin V-FITC和PI試劑，室溫避光孵育15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

2.4 竹節(jié)參總皂苷對(duì)HTR-8/SV-neo細(xì)胞上清液中MDA、SOD和GSH的影響

按“2.2”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞和分組，收集上清液，按試劑盒說明書檢測細(xì)胞上清液中MDA、SOD和GSH水平。

2.5 竹節(jié)參總皂苷對(duì)HTR-8/SV-neo細(xì)胞FABP4、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62和Beclin-1蛋白表達(dá)的影響

按“2.2”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞和分組，收集細(xì)胞，加入裂解液，10 000×g離心20 min，取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶于室溫封閉2 h，分別加入FABP4、LC3-II、LC3-I、p62、Beclin-1和GAPDH抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；TBST洗滌后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體（1∶5000），室溫孵育2 h，加入ECL化學(xué)發(fā)光液，采用凝膠成像儀曝光成像，BandScan5.0軟件分析條帶灰度值。

2.6 竹節(jié)參總皂苷對(duì)HTR-8/SV-neo細(xì)胞FABP4 mRNA表達(dá)的影響

按“2.2”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞和分組，收集細(xì)胞，按照試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列：FABP4上游引物5’-AAGAGAAAACGAGAGGATGATAAAC-3’，下游 引 物5’-ATGCGAACTTCAGTCCAGGTC-3’；GAPDH上游引物5’-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3’，下 游 引 物5’-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3’。

2.7 竹節(jié)參總皂苷對(duì)HTR-8/SV-neo細(xì)胞LC3表達(dá)影響

取處于對(duì)數(shù)生長期的HTR-8/SV-neo細(xì)胞，以1×104/孔接種至24孔板內(nèi)的無菌玻片上，培養(yǎng)12 h。按“2.2”項(xiàng)下方法分組，收集細(xì)胞，PBS洗滌，于4%多聚甲醛中室溫固定20 min，加入0.5%TritonX-100透膜15 min，加入10%山羊血清室溫封閉2 h，加入LC3抗體（1∶150），4 ℃孵育過夜；PBS洗滌，滴加Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體，室溫避光孵育1 h；PBS洗滌，滴加DAPI染色10 min；PBS洗滌，封片，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞LC3表達(dá)情況。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 竹節(jié)參總皂苷對(duì)HTR-8/SV-neo細(xì)胞活力的影響

如圖1所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.05）。

圖1 竹節(jié)參總皂苷對(duì)HTR-8/SV-neo細(xì)胞活力的影響(±s , n=3)Fig.1 Effect of total saponins from P.japonicus on viability of HTR-8/SV-neo cells (±s , n=3)

3.2 竹節(jié)參總皂苷對(duì)HTR-8/SV-neo細(xì)胞凋亡的影響

如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.01）。

圖2 竹節(jié)參總皂苷對(duì)HTR-8/SV-neo細(xì)胞凋亡的影響 (±s , n=3)Fig.2 Effect of total saponins from P.japonicus on apoptosis of HTR-8/SV-neo cells (±s , n=3)

3.3 竹節(jié)參總皂苷對(duì)HTR-8/SV-neo細(xì)胞上清液中MDA、SOD和GSH的影響

如表1所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞上清液中SOD和GSH水平顯著降低（P＜0.01），MDA水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞上清液中SOD和GSH水平顯著升高（P＜0.01），MDA水平顯著降低（P＜0.01）。

表1 竹節(jié)參總皂苷對(duì)HTR-8/SV-neo細(xì)胞上清液中MDA、SOD和GSH的影響 (±s , n=3)Table 1 Effect of total saponins from P.japonicus on levels of MDA, SOD and GSH in supernatant of HTR-8/SV-neo cells(±s , n=3)

表1 竹節(jié)參總皂苷對(duì)HTR-8/SV-neo細(xì)胞上清液中MDA、SOD和GSH的影響 (±s , n=3)Table 1 Effect of total saponins from P.japonicus on levels of MDA, SOD and GSH in supernatant of HTR-8/SV-neo cells(±s , n=3)

與對(duì)照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：##P＜0.01**P ＜ 0.01 vs control group; ##P ＜ 0.01 vs model group

組別 劑量/(μg·mL-1) MDA/(μmol·L-1) SOD/(μmol·L-1) GSH/(μmol·L-1)對(duì)照 — 6.56±0.62 104.01±9.77 112.81±10.21模型 — 25.87±2.31** 54.01±5.51** 64.13±6.76**竹節(jié)參總皂苷 20 17.06±2.01## 69.81±6.49## 72.84±7.62##40 12.21±1.45## 78.60±7.33## 90.61±8.81##80 10.53±0.91## 80.41±7.92## 96.89±9.07##

3.4 竹節(jié)參總皂苷對(duì)HTR-8/SV-neo細(xì)胞FABP4 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞FABP4mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞FABP4mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。

圖3 竹節(jié)參總皂苷對(duì)HTR-8/SV-neo細(xì)胞FABP4 mRNA (A) 和蛋白 (B) 表達(dá)的影響 (±s , n=3)Fig.3 Effect of total saponins from P.japonicus on expressions of FABP4 mRNA (A) and protein (B) in HTR-8/SV-neo cells(±s , n=3)

3.5 竹節(jié)參總皂苷對(duì)HTR-8/SV-neo細(xì)胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62和Beclin-1蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），p62蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），竹節(jié)參總皂苷（40、80 μg/mL）組p62蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。

圖4 竹節(jié)參總皂苷對(duì)HTR-8/SV-neo細(xì)胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62和Beclin-1蛋白表達(dá)的影響 (±s , n=3)Fig.4 Effect of total saponins from P.japonicus on expressions of LC3-Ⅰ, LC3-Ⅱ, p62 and Beclin-1 in HTR-8/SV-neo cells(±s , n=3)

3.6 竹節(jié)參總皂苷對(duì)HTR-8/SV-neo細(xì)胞LC3表達(dá)的影響

如圖5所示，對(duì)照組細(xì)胞LC3熒光染色弱，模型組細(xì)胞LC3熒光染色較強(qiáng)，各給藥組細(xì)胞LC3熒光染色較模型組降低。

圖5 竹節(jié)參總皂苷對(duì)HTR-8/SV-neo細(xì)胞LC3表達(dá)的影響 (×100)Fig.5 Effect of total saponins from P.japonicus on LC3 expression in HTR-8/SV-neo cells (× 100)

4 討論

近年來HDCP約占妊娠的10%，盡管目前關(guān)于HDCP已開展了大量的研究，但HDCP仍然是婦產(chǎn)科中最棘手的難題[2]。HDCP的發(fā)病機(jī)制起源于胎盤異常，其中心環(huán)節(jié)是滋養(yǎng)細(xì)胞功能異常所致的胎盤生理性障礙。胎盤發(fā)揮著母體與胎兒之間營養(yǎng)物和氧氣交換的作用，從而使胎兒能夠正常生長和發(fā)育。當(dāng)胎盤功能受損時(shí)，胎兒的生長受到影響，從而導(dǎo)致胎兒生長受限[10]。因此，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞在HDCP發(fā)病中起著關(guān)鍵作用。以一氧化氮合酶抑制劑L-NAME干預(yù)人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞，可以模擬HDCP的微環(huán)境，從而開展HDCP的相關(guān)研究[11-12]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)L-NAME處理后，HTR-8/SV-neo細(xì)胞活力明顯降低，細(xì)胞出現(xiàn)大量的凋亡，表明HDCP中可能會(huì)引發(fā)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)功能異常；竹節(jié)參總皂苷能夠提高HTR-8/SV-neo細(xì)胞活力，并抑制細(xì)胞的異常凋亡現(xiàn)象，表明竹節(jié)參總皂苷對(duì)HDCP中的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞可能發(fā)揮一定作用。

氧化劑與抗氧化劑的產(chǎn)生以及能力之間的不平衡會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)?；钚匝踉诮M織和器官中的積累會(huì)誘發(fā)心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥、癌癥、呼吸系統(tǒng)疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及與妊娠相關(guān)疾病的發(fā)生[13-14]。與正常孕婦相比，患有HDCP的孕婦體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)增加。SOD和GSH具有抗氧化物酶性質(zhì)，能夠通過協(xié)同清除活性氧和自由基來減輕氧化性損傷；MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量的高低可以體現(xiàn)氧化反應(yīng)的狀態(tài)[15]。本研究結(jié)果顯示，L-NAME干預(yù)后HTR-8/SV-neo細(xì)胞上清液中SOD和GSH水平降低，MDA水平升高，表明HTR-8/SV-neo細(xì)胞發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)；竹節(jié)參總皂苷組細(xì)胞上清液中SOD和GSH水平升高，MDA水平降低，表明氧化應(yīng)激反應(yīng)被抑制。

自噬是細(xì)胞內(nèi)分解代謝的穩(wěn)態(tài)機(jī)制，可以將細(xì)胞內(nèi)組分轉(zhuǎn)移至溶酶體進(jìn)行降解和氨基酸循環(huán)。Beclin-1是自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，在其啟動(dòng)和進(jìn)程中均起著重要作用，可以通過激活各種細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)控自噬發(fā)生；存在于細(xì)胞質(zhì)中的p62能夠與經(jīng)泛素化蛋白結(jié)合，并與LC3-II結(jié)合形成復(fù)合物，在溶酶體內(nèi)發(fā)生降解。自噬是維持細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制之一，能夠在早期胎盤缺氧和營養(yǎng)受限的環(huán)境中對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞起到重要的保護(hù)作用，但過度的自噬可能會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生異常死亡[16-17]。然而，自噬是否與妊娠相關(guān)疾病的胎盤功能障礙的病理過程有關(guān)，是否存在由于氧化應(yīng)激損傷而導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞過度自噬，以及這些過程發(fā)生的潛在機(jī)制尚待證實(shí)。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)L-NAME干預(yù)后，HTR-8/SV-neo細(xì)胞LC3熒光染色增強(qiáng)，LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)水平均升高，p62蛋白表達(dá)水平降低，表明HTR-8/SV-neo細(xì)胞發(fā)生過度自噬；竹節(jié)參總皂苷組LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)水平降低，p62蛋白表達(dá)水平升高，表明竹節(jié)參總皂苷能夠改善HDCP中胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的過度自噬現(xiàn)象。

FABPs是脂質(zhì)分子伴侶的家族成員，能夠通過調(diào)節(jié)幾種脂質(zhì)信號(hào)通路來促進(jìn)系統(tǒng)性代謝。FABP4在細(xì)胞和組織中的異常表達(dá)與疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，通過特異性抑制劑、中和抗體或未知受體拮抗劑對(duì)FABP4功能的藥理修飾將是針對(duì)肥胖癥、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病的新型治療策略[18-19]。Tu等[20]通過檢測妊娠期前3個(gè)月患者血漿中FABP4水平發(fā)現(xiàn)，妊娠早期較高的FABP4水平與妊娠期糖尿病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。在肥胖誘發(fā)的非酒精性脂肪肝中，F(xiàn)ABP4表達(dá)顯著增加，過氧化酶體增殖物激活受體 γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ）具有抑癌基因的作用，而FABP4能夠促進(jìn)疾病的發(fā)生[21]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)L-NAME干預(yù)后，HTR-8/SV-neo細(xì)胞中FABP4mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高；竹節(jié)參總皂苷顯著抑制FABP4mRNA和蛋白表達(dá)水平，表明竹節(jié)參總皂苷可能通過調(diào)控FABP4表達(dá)來改善HDCP中胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞損傷。

綜上所述，竹節(jié)參總皂苷能夠抑制L-NAME干預(yù)的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞活力降低以及細(xì)胞凋亡，并改善細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷與過度自噬，其機(jī)制可能與調(diào)控FABP4表達(dá)有關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突