李瀾鵬，廖莎，王鵬翔，孫啟梅，師文靜，李曉姝，張霖，彭紹忠

（中國石油化工股份有限公司大連石油化工研究院，遼寧 大連 116045）

近10 年來，中國的石油消費量和石油進口量快速增加，要依賴進口來補充。能源多元化是保障能源安全，實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的一個重要方向。生物燃料是傳統(tǒng)化石燃料的理想替代品[1]。

微藻作為細胞工廠具有諸多優(yōu)勢，如生長周期短、可以捕集CO2、光合效率高，CO2固定效率一般可達陸生植物的10～50 倍[2]。微藻生長速度快還能積累淀粉、油脂等高附加值產(chǎn)品，且不占用耕地，有廣闊的發(fā)展前景[3,4]。

藻種是重要的自然資源，藻種的保藏是一項重要的基礎(chǔ)研究工作[5]。從自然界獲得優(yōu)良藻種來之不易，保障藻種在科研和生產(chǎn)過程中的優(yōu)良性能，減少藻種的退化和死亡，具有十分重要的意義[6]。常用的微藻保存方法有繼代法保存、固定化法保存、超低溫保存、濃縮低溫保存、冷凍真空干燥保存和低溫甘油生理鹽水保存[7,8]。目前在微藻養(yǎng)殖技術(shù)的開發(fā)和微藻育種方面開展了許多有益的工作，紛紛建立了自己的藻種資源庫。各類藻種庫一般采用低溫液體傳代保藏法和瓊脂固體傳代保藏法保藏藻種，但保藏時間一般不超過1 年，頻繁傳代容易污染藻種，引發(fā)突變，導(dǎo)致藻種性能下降。本文從自然界中篩選到10 株產(chǎn)油微藻，選取5 株作為研究對象進行分子生物學(xué)鑒定，研究含油微藻的冷凍保藏方法，為含油脂類微藻的穩(wěn)定保藏提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

二乙酸熒光素購自Sigma。

1.1.2 儀器

顯微鏡，徠卡公司；智能光照培養(yǎng)箱，杭州會爾公司；冷凍離心機，日本日立公司；冷凍干燥機，美國SIM 公司；微型生物反應(yīng)器（BioLector），M2P-Labs；紫外分光光度計，美國PE 公司；CASY，德國INNOVATIS 公司。

1.2 藻種的篩選

1.2.1 微藻的篩選及分離純化

將采自東北地區(qū)水域含有浮游微藻的藻液水樣用紗布過濾去掉較大的沉淀物，取100 mL 濾液轉(zhuǎn)入500 mL 的三角搖瓶中，加入100 mL BG11 培養(yǎng)基進行富集培養(yǎng)[9]。培養(yǎng)基成分為：NaNO31.5 g，K2HPO4·3H2O 0.04 g，MgSO4·7H2O 0.075 g，CaCl2·2H2O 0.036 g，檸檬酸0.006 g，檸檬酸鐵銨0.006 g，EDTA 0.001 g，NaCO30.02 g 和A5+Co 溶液1 mL。其中A5+Co 溶液的配方為：H3BO32.86 g，MnCl2·H2O 1.81 g，ZnSO4·7H2O 0.222 g，CuSO4·5H2O 0.079 g，Na2MoO4·2H2O 0.390 g 和Co（NO3）2·6H2O 0.049 g。在恒溫光照振蕩搖床中進行，培養(yǎng)溫度為25～28℃，光照強度為3 000 Lux，光暗時間比為14∶10，搖床轉(zhuǎn)速為120 r·min-1，培養(yǎng)至溶液呈現(xiàn)明顯綠色的富集藻液。

采用稀釋涂布法對分離純化富集藻液。采用梯度法稀釋富集藻液，用無菌滴管移取1～2 滴稀釋藻液于瓊脂的邊緣，均勻涂于平板的瓊脂表面封口膜密封，在溫度為25℃，光照強度為3 000 Lux，光暗時間比為14∶10 的恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)到長出單菌落后挑取單克隆進行平板劃線，重復(fù)多次直至得到純種微藻。

1.2.2 藻種的培養(yǎng)

得到的純種微藻經(jīng)靜置培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，按接種量5%分別接種至微藻柱式光照反應(yīng)器上進行生長評價，反應(yīng)器中裝液量為200 mL，溫度為25～28℃，光暗比為14∶10，通入空氣量為0.5 L·min-1，每天通入大約1 min CO2來調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH，培養(yǎng)至穩(wěn)定期。

1.3 藻種冷凍保藏的方法

選擇5 株生長快速且含油量高的藻種為目標(biāo)藻種的新鮮藻液.分別離心（4 000 r·min-1，3 min），去離子水洗兩次后，加入新鮮培養(yǎng)基重懸，取出部分微藻加入不同保護劑，分別放置于-18℃和-80℃保藏。一個月后，將保藏微藻取出，解凍、搖勻、離心，用生理鹽水洗兩次，去除保護劑后一部分檢測細胞活性評價，一部分接種到新鮮培養(yǎng)基進行生長評價。取5 種保護劑∶甘油（GLY）、二甲基亞砜（DMSO）、蔗糖（SUC）、聚乙二醇（PEG）和羥二基淀粉（HES）。確定保護劑后進一步考察保護劑濃度（10%、20%、30%、40%和50%）和3 個月、6 個月、9個月以及1 年保藏時間。

1.4 分析方法

1.4.1 生物量

采用Lambda45 UV/VIS Spectromete 在698 nm處檢測生物量，取兩個測量誤差在±10%平行樣的平均值。

取4 mL 藻液，7 000 r·min-1離心5 min，用去離子水洗滌2 次，置于80℃烘箱中烘至衡重，取兩個測量誤差在±10%平行樣的細胞干重平均值。

1.4.2 油脂含量分析

采用乙酸乙酯正己烷法測定總脂含量[9]。稱量100 mg 左右干藻粉（重量計為m），放入瓷研缽中，加入適量石英砂和液氮，待液氮揮發(fā)后，研磨破壁，放入離心管。加入體積比為1 的乙酸乙酯和正己烷混合有機溶劑，超聲清洗儀處理20 min，50℃恒溫水浴中提取45 min。提取后離心15 min，收集上清液至離心管中。提取液中加入等體積的蒸餾水，震蕩混勻后離心4 min，收集上層有機相至已烘干的玻璃試管中，玻璃管凈重為W0。80℃水浴蒸發(fā)玻璃試管中的溶劑后，80℃烘箱烘干至恒重，重量為W1。計算藻細胞的總脂含量為C（%）：C＝100×（W1-W0）/m。

1.4.3 細胞活力表征

對比熒光素二醋酸酯染色法（FDA）、I2-KI 試劑染色法、總?cè)~綠素檢測法和快速細胞計數(shù)法四種檢測存活率的方法，建立了適合目標(biāo)藻種檢測方法。用新鮮培養(yǎng)的藻液計算微藻活細胞的活力，以死細胞做對照。在10 mL 藻細胞液中加入1 mL 魯哥氏溶液，于黑暗中放置48 h，使細胞固定。固定后的細胞已全部失去活性，但細胞個體沒有破碎分解[10]。固定后的藻細胞液在3 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心，用培養(yǎng)基重懸3～4 次，直到將魯哥氏溶液清洗干凈，溶液變成無色。重懸后的細胞作為死亡細胞進行染色或檢測。

碘染色法[11]：稱取0.65 g I2和2.0 g KI 于燒杯中，加少許去離子水，攪拌使其溶解，用去離子水定容至500 mL，配置成0.01 N I2-KI 試劑貯存于棕色瓶中，放入4℃冰箱中。取1 mL 試劑加入樣品中，振蕩混勻進行染色。用吸管吸取少量目標(biāo)微藻保藏樣品置于載玻片中央，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下計數(shù)細胞。相對存活率%＝保藏后細胞數(shù)/保藏前細胞數(shù)。

總?cè)~綠素檢測法[12]：取新鮮藻液10 mL，4 000 r·min-1離心3 min，棄上清液，藻泥中加入適量的丙酮，冰浴研磨5 min，4 000 r·min-1離心后，上清液轉(zhuǎn)入10 mL 容量瓶。繼續(xù)用上述方法對藻體沉淀、萃取，紙質(zhì)藻體沉淀成白色未知。定容后在紫外分光光度計上測定其吸收峰值。狹縫寬度0.5 nm，吸收峰I 波長663 nm，吸收峰II 波長645 nm，計算公式為：藻總?cè)~綠素值＝OD663×8.02+OD645×20.21。

快速細胞技術(shù)分析法。采用CASY 快速細胞活力分析儀，檢測目標(biāo)微藻活細胞和死細胞的活力范圍，被檢樣品通過檢測直接得到存活率。

二醋酸熒光素法[13]染色：將4.16 mg 二醋酸熒光素溶于10 mL 丙酮中配制成濃度為1 mmol 的母液，置于在-18℃冰箱中保存。新鮮藻液離心，用無菌去離子水清洗1～2 次，用去離子水懸浮細胞。取5 mL 上述稀釋藻液，加入60 μmol FDA，振蕩混勻進行熒光染色，每5 min 振蕩一次，于室溫下避光放置30 min。染色結(jié)束后取樣鏡檢。同時，取樣點在48 孔熒光分析用黑板上，每孔1 mL，置于BioLector在525 nm 下檢測熒光值（FDA 激發(fā)波長為480 nm），2 個平行樣。細胞活力的計算公式為：相對細胞活性（%）＝（處理組保藏后稀釋液的熒光值/對照細胞懸液的熒光值）×100%。以水作空白對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞活性評價

對比四種細胞活性表征方法的結(jié)果如下。理論上采用I2-KI 試劑染色微藻細胞，存活細胞的核及色素體被染色后變?yōu)樯詈稚?，而死亡細胞的?nèi)含物則基本不被染色，據(jù)此可以確定微藻的存活率[12]。I2-KI 試劑微藻染色情況如圖1 所示，外觀上顯示，I2-KI 試劑起到一定的染色效果，但從顯微鏡檢觀察看，染色效果不明顯，無法判斷微藻是否存活。

圖1 藻細胞的I2-KI 染色Fig.1 I2-KI staining of the microalga

微藻細胞中的葉綠素含量反應(yīng)微藻的生長和存活狀態(tài)。檢測發(fā)現(xiàn)：新鮮細胞總?cè)~綠素為302.9098，死細胞總?cè)~綠素為144.2848（空白對照0）。死藻細胞值與空白差異較大，表明該方法檢測誤差較大。

采用CASY 快速細胞活力分析儀檢測活細胞和死細胞的活力范圍時，把細胞懸浮在容器中，以恒定的速度通過一個精確的圓孔，通過電極進行測量。測量細胞孔時，體積不同表現(xiàn)出不同的電解量。完整的細胞被當(dāng)作絕緣體，具很高的電阻。相反，死細胞細胞膜不再成為電阻，從而得到細胞的分布。經(jīng)CASY 分析儀得到目標(biāo)微藻細胞分布圖（圖2），4.0～6.15 為活細胞，6.15～15 為死細胞。

圖2 微藻細胞分布Fig.2 Distribution of microalgae cells

1966 年，Rotman 和Papermaser 提出采用熒光素二醋酸酯（FDA）染色來顯示細胞生活力[14,15]。熒光素二醋酸酯自身不產(chǎn)生熒光，它進入細胞后，與胞內(nèi)的內(nèi)酯酶發(fā)生反應(yīng)分解產(chǎn)生熒光素，使細胞發(fā)出熒光。死細胞內(nèi)酯酶失活，不顯示熒光。早期，人們采用美藍（0.02%）和沙黃（0.1%）染色鑒定藍藻細胞活力。該方法簡單快捷，但效果不穩(wěn)定。郭厚良采用二醋酸酯分析藍藻細胞生活力[16]。對比研究表明：該方法可行、可靠。目標(biāo)微藻染色后取樣鏡檢結(jié)果見圖3。以水做空白，檢測得空白熒光值（FDA）為0.964，死細胞熒光值1.007，活細胞熒光值為44.901。死細胞熒光值和空白基本接近，表明方法檢測比較準(zhǔn)確。在此基礎(chǔ)上考察生物量同F(xiàn)DA 的關(guān)系，當(dāng)OD689小于5.0 時，OD 與FDA 成近似線性關(guān)系，OD 對FDA 的影響不太大。因此，當(dāng)OD689＜5.0時，相對細胞活性（%）＝（處理組保藏后稀釋液的熒光值/OD）/（對照細胞懸液的熒光值/OD）×100%；當(dāng)OD689＞5.0 時，相對細胞活性（%）＝（處理組保藏后稀釋液的熒光值/ 對照細胞懸液的熒光值）×100%。

圖3 微藻細胞二醋酸染色Fig.3 FDA staining of the microalgae

2.2 自然界中含油藻種的選育

從東北地區(qū)水域種篩選出17 株微藻，經(jīng)搖瓶光照培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，以5%的量接種至柱式光照反應(yīng)器上進行篩選評價（圖4）。培養(yǎng)第4 d 微藻進入快速生長階段，隨后緩慢生長，以生長為指標(biāo)評價挑選出HCSB1、MHB3、MHJB4、SFB1、SSB1、SSB6、SSB7、SHJB1、SHJB2 和Y3 10 株藻種的油脂產(chǎn)量。

圖4 篩選藻種的生長情況Fig.4 Growth curves of selected microalgae

經(jīng)過柱式光照生物反應(yīng)器培養(yǎng)至穩(wěn)定期，測定了10 株生長較快的微藻生長及油脂含量（表1）。10株微藻中SHJB1 和Y3 生長相對較慢，油脂產(chǎn)率幾乎都在20 mg·L-1·d-1以上，其中HCSB1 生物量最大達到1.8305 g·L-1，SSB7 油脂產(chǎn)率最大達到29 mg·L-1·d-1。由表2 可知：HCSB1 油脂含量較低，綜合微藻來源地區(qū)、微藻形態(tài)、生長速率和油脂含量，選擇HCSB1、MHB4、SHJB1、SFB1 和SSB6 作為研究對象考察冷凍保藏方式對含油微藻的影響，用18S rDNA 測定了5 株微藻菌株的基因片段，運用NCBI 數(shù)據(jù)庫中的BLAST 工具進行序列比對，獲得目標(biāo)同源序列；然后運用Clustal W 對獲得的同源序列進行多重比對,根據(jù)此結(jié)果，運用MEGA7.0 軟件，基于最大似然算法，選1 000 次重復(fù)的bootstrap 進行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹確定了微藻種屬（表2）。

表1 藻種生物量及油脂含量Tab.1 Biomass and oil content of selected microalgae

表2 藻種的鑒定與表征Tab.2 Identification and morphology of the microalgae

2.3 冷凍保藏方法

2.3.1 保護劑對微藻冷凍保藏的影響

按能否滲透到細胞內(nèi)，保護劑種類通常分為滲透型和非滲透性兩種[17]。本研究選取滲透型保護劑甘油（GLY）和二甲基亞砜（DMSO），非滲透型保護劑蔗糖（SUC）、聚乙二醇（PEG）和羥二基淀粉（HES）。五種保護劑對不同微藻保護作用程度不同（圖5）。聚乙二醇（PEG）對微藻的保護效果最差，復(fù)蘇培養(yǎng)后生長也最差。綜合比較甘油（GLY）、二甲基亞砜（DMSO）和蔗糖（SUC）保藏效果相對較好。綜合兩個溫度段，總體考量甘油（GLY）和二甲基亞砜（DMSO）對五種微藻的保藏效果更好。

圖5 不同保護劑的保藏效果Fig.5 The effect of different cryoprotectants on cryopreservation

2.3.2 保護劑濃度對微藻冷凍保藏的影響

滲透性保護劑在保護細胞的同時，也具有一定程度的毒害作用。保護劑的濃度是微藻冷凍保藏的重要指標(biāo)。-18℃下，甘油（GLY）保藏SSB6、MHB4、SFB1、HCSB1 和SHJB1，最佳保護濃度分別為50%、40%、10%、50%和30%；二甲基亞砜（DMSO）保藏SSB6、MHB4、SFB1、HCSB1 和SHJB1，最佳保護濃度分別為30%、40%、10%、50%和30%（圖6）。試驗表明，同種微藻，相同保護劑濃度，甘油（GLY）保藏微藻的存活率高于二甲基亞砜（DMSO）；同種微藻不同保護劑，最佳保護劑濃度基本一致。

圖6 不同濃度保護劑的保藏效果Fig.6 The effect of different cryoprotectant concentrations on cryopreservation of the microalgae

圖7 不同濃度保護劑保藏微藻的復(fù)蘇效果Fig.7 The effect of microalgae cryopreservation on resuscitation

采用-18℃20%甘油對5 種微藻均保藏一年，保藏前后生物量和油脂含量的變化如圖8。除SFB1外，其他4 株微藻保藏前后生物量和油脂含量均保持穩(wěn)定。結(jié)果表明，該方法適用于多數(shù)含油微藻，且可保持至少一年。

圖8 微藻保藏一年的生物活性Fig.8 The cell activity after storing for one year

3 討論

3.1 藻種選育及細胞活力表征

本研究從東北地區(qū)河流或湖泊中篩選出10 株具有產(chǎn)油性能的微藻，最高生物量達到1.8305 g·L-1，最高油脂產(chǎn)率達29 mg·L-1·d-1。從中挑選出5 株作為研究對象進行18S rDNA鑒定，分別為Scenedesmus、Desmodesmus、Monoraphidium、Chlorella 和Mono -raphidium。4 種染色方法表征細胞活力，原理和使用儀器各不相同。碘染色法，染色前后變化不大，無法準(zhǔn)確判斷死活細胞；總?cè)~綠素法快捷，但結(jié)果不太準(zhǔn)確；快速細胞計數(shù)法，方便結(jié)果準(zhǔn)確，但CASY 快速細胞活力分析儀容易發(fā)生毛細管堵塞；FDA 染色法，方便快捷，可同時分析多個樣品且結(jié)果相比準(zhǔn)確。值得注意的是，二醋酸酯染液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，放置時間過長染色效果下降，氣溫超過20℃，細胞的熒光也會很快消退[16]。對比4 種細胞活力表征方法，二醋酸熒光素檢測快速且準(zhǔn)確。

3.2 不同保護劑對藻種冷凍保藏的影響

微藻處于冷凍狀態(tài)時代謝活動幾乎停止，達到長期保存的目的。但過低的溫度使微藻細胞內(nèi)的水分形成冰晶，引起細胞，特別是細胞膜的損傷。采取快速冷凍，微藻細胞內(nèi)產(chǎn)生的冰晶小，減少對細胞的損傷；冷凍時添加保護劑也能緩解對細胞的損傷。甘油（GLY）和二甲基亞砜（DMSO）為滲透性保護劑，是許多化合物良好的溶劑，這種保護劑容易進入細胞，在胞內(nèi)與水很好地互溶，發(fā)生水合作用保持水分且增加溶液粘性，防止冷凍過程細胞脫水及產(chǎn)生冰晶，更好地保持細胞活性。蔗糖（SUC）、聚乙二醇（PEG）和羥二基淀粉（HES）均屬于非滲透性保護劑，它們只能吸附在細胞表面形成黏液層，阻止水分進出細胞,同時利用增大溶液黏度來阻止冰晶的生長對細胞的破壞。

本研究結(jié)果表明，滲透性保護劑的效果優(yōu)于非滲透性保護劑。從細胞活性和細胞復(fù)蘇的結(jié)果比較看，保藏效果不能單一從細胞活性角度，應(yīng)綜合細胞復(fù)蘇的效果來驗證。從整體綜合來看，-18℃保藏微藻時，兩種保護劑濃度為20%時，微藻生長較好；-80℃保藏微藻時，兩種保護劑濃度為10%時，微藻生長較好。當(dāng)保護劑濃度超過20%時，大多數(shù)微藻表觀細胞活力未受影響。細胞復(fù)蘇生長結(jié)果表明，高濃度的保護劑對微藻具一定毒害，影響細胞生長。二甲基亞砜（DMSO）比甘油毒性更大，因此采用-18℃20%甘油（GLY）或-80℃10%甘油（GLY）對微藻進行冷凍保藏，該方法適用于大多數(shù)含油微藻，且可保藏微藻至少1 年，微藻細胞生物量和油脂含量穩(wěn)定，為未來微藻生產(chǎn)生物柴油奠定了基礎(chǔ)。