柴靜茹，盧彤巖，王荻，陳福廣，李紹戊

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.黑龍江省水生動物病害與免疫重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070；3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306）

隨著產(chǎn)業(yè)規(guī)模化程度的提高，養(yǎng)殖鮭鱒魚患病死亡風(fēng)險大幅提高。細菌性冷水病（Bacterial coldwater disease,BCWD）是一種廣泛流行的細菌性疾病，患病鮭鱒的死亡率為10%～90%，給鮭鱒產(chǎn)業(yè)帶來嚴重經(jīng)濟損失[1]。BCWD 的病原嗜冷黃桿菌Flavobacterium psychrophilum 呈革蘭氏陰性，細長桿狀，直徑0.20～0.75 μm，長1.5～7.5 μm，具有圓形末端，雖無鞭毛或菌毛，但能產(chǎn)生滑動運動，最佳培養(yǎng)溫度為15～18℃[2-6]。嗜冷黃桿菌宿主譜廣泛且主要感染鮭科魚類，目前已報道感染的鮭科魚類有虹鱒Oncorhynchus mykiss、銀鮭O.kisutch、大鱗鮭O.stshawytscha、山鱒O.clarkii、北極紅點鮭Salvelinus alpinus、湖紅點鮭S.namaycush、大西洋鮭Salmo salar、海鱒Salmo trutta trutta 和褐鱒Salmo trutta lacustris 等，其中虹鱒和銀鮭最易感[7]。第一株嗜冷黃桿菌分離自美國，現(xiàn)已分布世界，在全球多個國家和地區(qū)的養(yǎng)殖或野生魚類中均有報道[8,9]。

嗜冷黃桿菌屬需氧菌，對營養(yǎng)和培養(yǎng)條件要求很苛刻，通常在腦心浸液瓊脂、胰蛋白酶大豆瓊脂、三糖鐵瓊脂和血瓊脂等高營養(yǎng)濃度的培養(yǎng)基上不生長[7]。關(guān)于嗜冷黃桿菌增殖培養(yǎng)基的報道較多。最早用于分離嗜冷黃桿菌的培養(yǎng)基是Cytophaga 培養(yǎng)基，由0.05%胰蛋白胨、0.05%酵母提取物、0.02%乙酸鈉和0.02%牛肉提取物配制而成（pH 7.0～7.2）[10]。Obach 等[11]在Cytophaga 培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清促進了嗜冷黃桿菌的生長，但胎牛血清成本較高。Daskalov 等[12]利用Cytophaga 培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入0.5 g/L 的D-半乳糖、D-葡萄糖、L-鼠李糖和脫脂牛奶，在改良培養(yǎng)基上得到的菌落尺寸比單用Cytophaga 培養(yǎng)基大一倍，嗜冷黃桿菌的生長速度更快，產(chǎn)菌量更高，但也只達到106CFU/mL。目前科研領(lǐng)域使用最廣泛的是胰蛋白酵母提取物培養(yǎng)基（tryptone yeast extract salts,TYES）的配方是：0.4%胰蛋白胨、0.04%酵母提取物、0.05%七水硫酸鎂、0.05%無水氯化鈣（pH 7.2）[13]。然而使用TYES培養(yǎng)基培養(yǎng)時間較長，一般需要至少4 d。本實驗以TYES 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，嘗試篩選一種培養(yǎng)時間短、產(chǎn)菌量高、活力好、成本低及制備方法操作簡單的嗜冷黃桿菌培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 材料

供試嗜冷黃桿菌CH06 株、CH07 株和CH08 株由本實驗室分離自臨床患病虹鱒的病灶及脾臟，并鑒定和保存。健康虹鱒購自遼寧本溪艾格莫林有限公司，平均體質(zhì)量20～30 g。

TYES 液體培養(yǎng)基的制備：1 L 蒸餾水，4 g/L 胰蛋白胨，0.5 g/L 酵母提取物，0.2 g/L 無水氯化鈣，0.5 g/L 七水硫酸鎂，pH 調(diào)至7.2，121℃高壓滅菌15 min。Biolog GEN III 微平板、接種液No.72401-IF-A和無菌一次性接種棉簽購自美國BIOLOG 公司；L-脯氨酸購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 碳源的篩選

通過Biolog 微平板法確定嗜冷黃桿菌利用率最高的碳源。Biolog Gen III 96 孔微平板含71 種碳源、23 種化學(xué)敏感物質(zhì)及陰性和陽性對照。將-80℃凍存的嗜冷黃桿菌CH06、CH07 和CH08 株于TYES 固體培養(yǎng)基上劃線復(fù)蘇，18℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，直至長出單菌落且沒有雜菌。

將Biolog Gen III 96 孔微平板從4℃冰箱中取出，室溫條件下放置30 min，擦干凈接種管外壁，放入濁度儀中，將濁度儀透光度調(diào)至100%，用無菌一次性接種棉簽蘸取單菌落，放入接種液中攪拌，使菌落均勻分散，制成濁度為90%～98%T 的懸濁液，加入Biolog Gen III 96 孔板中，每孔100 μL。每隔24 h 使用酶標儀讀取每個孔在590 nm 和750 nm波長下的吸光度值，連續(xù)讀取7 d。以Gen III 微平板的A10 孔為對照，其他孔的吸光度值小于A10 孔的一半，定為“陰性”反應(yīng)；其他孔的吸光度值大于A10 孔一半，定為“陽性”反應(yīng)[14]。陽性反應(yīng)的碳源為可利用碳源。微生物對不同碳源的利用能力，用顏色平均變化率（Average Well Color Development，AWCD）表示，計算菌株的AWCD 值隨時間的變化，得到其利用碳源的平均活性[15]。

1.2.2 單因素試驗

初步篩選出利用率最高的碳源后，進一步研究該碳源添加濃度對嗜冷黃桿菌增殖的影響，以確定最佳添加濃度。設(shè)置碳源的添加濃度分別為0.3 g/L、0.5 g/L 和1.0 g/L，將方法1.2.1 中復(fù)蘇的嗜冷黃桿菌CH06 株按1∶100 的比例分別接種到TYES液體培養(yǎng)基、TYES+0.3 g/L 碳源液體培養(yǎng)基、TYES+0.5 g/L 碳源液體培養(yǎng)基和TYES+1.0 g/L 碳源液體培養(yǎng)基中，每組3 個重復(fù)，18℃150 r/min 震蕩培養(yǎng)，每隔24 h 利用平板計數(shù)法計算菌落數(shù)量。隨后選取CH07 和CH08 株進行結(jié)果驗證。

1.2.3 添加碳源對菌落形態(tài)的影響

為比較各組不同配方培養(yǎng)基上生長的嗜冷黃桿菌形態(tài)有無差異，分別利用革蘭氏染色和掃描電鏡方法比較菌落的形態(tài)和大小。

1.2.4 添加碳源對菌株致病性的影響

為比較添加碳源培養(yǎng)基與TYES 培養(yǎng)基上生長的嗜冷黃桿菌毒力差異，給實驗魚尾柄肌肉按0.1 mL/尾的劑量注射菌懸液。菌懸液的初始濃度為1×108CFU/mL，每組10 尾。注射后每日投喂兩次，投餌量為體質(zhì)量的1.0%，每天記錄臨床癥狀和死亡情況，取瀕死或死亡的實驗魚病灶及內(nèi)臟器官進行細菌再分離和鑒定?？瞻讓φ战M實驗魚注射等劑量的TYES 液體培養(yǎng)基。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA）,多重比較采用Duncan’s法，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 三株嗜冷黃桿菌對碳源的利用情況

Biolog 分析結(jié)果表明，三株嗜冷黃桿菌的陽性反應(yīng)很明顯，對鑒定板中碳源的利用情況不完全相同。由圖1 可知，CH06 株能夠利用碳源L-脯氨酸、L-谷氨酸、L-組胺、葡糖醛酰胺、乙酸、龍膽二糖和奎寧酸；CH07 株能夠利用碳源L-脯氨酸、L-谷氨酸、L-組胺、葡糖醛酰胺和乙酸；CH08 株能夠利用碳源L-脯氨酸、L-谷氨酸、葡糖醛酰胺、乙酸、L-組胺和L-蘋果酸。

圖1 三株嗜冷黃桿菌在GEN III 微平板上的反應(yīng)Fig.1 Reactions of 3 strains of F.psychrophilum on GEN III microplates

三株嗜冷黃桿菌的碳源利用隨時間而變化。AWCD 值分析結(jié)果表明，菌株CH06 株在培養(yǎng)初始階段對L-脯氨酸的利用率最高，且持續(xù)到碳源消耗殆盡；對L-谷氨酸、L-組胺、葡糖醛酰胺、乙酸、龍膽二糖和奎寧酸也有利用，但是利用率顯著低于L-脯氨酸（圖2-A）。CH07 株在前24 h 對葡糖醛酰胺的利用率最高；從24 h 開始，CH07 株對L-脯氨酸的利用率持續(xù)增高，48 h 及以后利用率顯著高于L-谷氨酸、L-組胺、葡糖醛酰胺和乙酸（圖2-B）。在培養(yǎng)初始階段，CH08 株能利用葡糖醛酰胺、L-谷氨酸、乙酸和L-脯氨酸，48 h 才開始利用L-組胺，72 h 開始利用L-蘋果酸（圖2-C）。結(jié)果表明，嗜冷黃桿菌對碳源的利用效率由高至低依次為：L-谷氨酸＞L-脯氨酸＞葡糖醛酰胺＞乙酸＞L-蘋果酸＞L-組胺。

圖2 三株嗜冷黃桿菌對不同碳源的利用率隨時間的變化Fig.2 Changes in utilization of carbon sources by three strains of F.psychrophilum with time

2.2 單因素試驗

對不同碳源的利用表明，三株嗜冷黃桿菌對L-脯氨酸的利用率最高。因此，進一步比較了該碳源不同添加劑量對嗜冷黃桿菌CH06 株生長的影響。由表1 可知，CH06 株在添加不同濃度L-脯氨酸的TYES 培養(yǎng)基上生長24 h 后，細菌濃度達到8×106CFU/mL，顯著高于TYES 組（P＜0.05）；48 h 時，0.5 g/L L-脯氨酸TYES 組的細菌濃度為3.5×107CFU/mL，分別是1.0 g/L、0.3 g/L L-脯氨酸TYES 組和TYES 組的1.59 倍、1.94 倍和11.67 倍；72 h 時，TYES 組的活菌數(shù)量降低，而實驗組的活菌數(shù)量持續(xù)升高，0.5 g/L L-脯氨酸TYES 組的菌液濃度達5×107CFU/mL，是1.0 g/L 和0.3 g/L L-脯氨酸TYES組的2.50 倍，是TYES 組的250 倍。

表1 不同培養(yǎng)基對嗜冷黃桿菌CH06 株生長的影響Tab.1 Effects of different media on the growth of CH06 strain

2.3 CH07 株和CH08 株驗證添加碳源的最佳濃度

在添加0.5 g/L L-脯氨酸的TYES 培養(yǎng)基上，嗜冷黃桿菌CH07 和CH08 株的生長結(jié)果表明（表2），CH07 和CH08 株在添加L-脯氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h、48 h 和72 h 后，細菌濃度顯著升高，高于TYES 對照組，與CH06 株結(jié)果一致。

表2 不同培養(yǎng)基對嗜冷黃桿菌CH07、CH08 株生長的影響Tab.2 Effects of different media on the growth of CH07 and CH08 strains

2.4 L-脯氨酸對嗜冷黃桿菌菌落形態(tài)的影響

染色結(jié)果表明（圖3），在TYES 基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加L-脯氨酸的TYES 培養(yǎng)基培養(yǎng)的三株嗜冷黃桿菌均為革蘭氏陰性細長桿菌，形態(tài)無明顯變化。掃描電鏡觀察顯示，在TYES 基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長的嗜冷黃桿菌平均長度為（1.83±0.22）μm，平均直徑為（0.25±0.03）μm；在添加L-脯氨酸的TYES 培養(yǎng)上生長的嗜冷黃桿菌平均長度為（1.84±0.2）μm，平均直徑為（0.25±0.02）μm。不同培養(yǎng)基上生長的嗜冷黃桿菌在形態(tài)和規(guī)格上無差異（圖4）。

圖3 革蘭氏染色觀察CH06 株形態(tài)變化Fig.3 The morphological observation of CH06 strain by Gram staining

圖4 掃描電鏡觀察CH06 株形態(tài)變化Fig.4 The morphological observation of CH06 strain under a scanning electron microscope

2.5 L-脯氨酸對嗜冷黃桿菌致病性的影響

人工感染試驗結(jié)果表明，在添加L-脯氨酸的TYES 培養(yǎng)基上培養(yǎng)的CH06、CH07 和CH08 株對虹鱒幼魚均具有較強的致病性。試驗魚在攻毒48～72 h 后行動萎靡、食欲不振，注射處開始膿腫潰爛；剖檢可見鰓蒼白、肝臟蒼白和脾臟腫大，伴有腸炎。與TYES 培養(yǎng)基上生長的嗜冷黃桿菌相比，添加L-脯氨酸培養(yǎng)的CH06、CH07 和CH08 株感染虹鱒后引發(fā)的臨床病征出現(xiàn)時間和死亡率等均無顯著差異。對照組魚僅在肌肉注射處有輕微腫脹，無其他臨床癥狀且無死亡（圖5）。從人工感染試驗魚脾臟及注射肌肉處均分離到嗜冷黃桿菌。

圖5 虹鱒幼魚感染嗜冷黃桿菌后臨床病征Fig.5 Clinical symptoms in juvenile rainbow trout infected with F.psychrophilum

3 討論

鮭鱒魚病原體嗜冷黃桿菌的培養(yǎng)難度較大，一是需要在低營養(yǎng)濃度的培養(yǎng)基上生長，二是需要較長的培養(yǎng)時間。面對嗜冷黃桿菌引起的BCWD 發(fā)病機制的研究和疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)這兩大問題，急需研發(fā)一種培養(yǎng)時間短、產(chǎn)菌量高、成本低及制備方法操作簡單的嗜冷黃桿菌培養(yǎng)基。國外已經(jīng)報道過幾種改良的嗜冷黃桿菌培養(yǎng)基，除了Cytophaga 培養(yǎng)基，還有一種富含胰蛋白胨的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，即Anacker-Ordal 肉湯，其配方為：0.5%胰蛋白胨、0.05%酵母提取物、0.02%牛肉提取物和0.02%乙酸鈉[2]。Daskalov 等[12]以Cytophaga 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加D-半乳糖、D-葡萄糖、L-鼠李糖和脫脂牛奶，培養(yǎng)嗜冷黃桿菌后盡管細菌量增多，也只有106CFU/mL。Crump 等[17]開發(fā)了胰蛋白酵母提取物麥芽糖培養(yǎng)基。Oplinger 等[17]研究表明，添加0.2%脫脂牛奶和1%馬血清可以促進嗜冷黃桿菌增殖，提高培養(yǎng)效果，二者豐富了培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)含量，增加了嗜冷黃桿菌可用蛋白質(zhì)來源的多樣性，但馬血清成本較高，且脫脂牛奶和馬血清都需要過濾滅菌，操作不夠便捷。Cepeda 等[18]在TYES 基礎(chǔ)上，添加0.5 g/L 葡萄糖，培養(yǎng)的嗜冷黃桿菌在穩(wěn)定期能達到5×109CFU/mL，高于TYES培養(yǎng)基（2×108CFU/mL）和CCM培養(yǎng)基（3×107CFU/mL）。嗜冷黃桿菌一直被認為是一種無法利用碳水化合物的細菌，葡萄糖在生長中的作用尚無法解釋，有待深入研究[19]。

Biolog Gen III 96 孔微平板含碳源種類豐富，71種碳源中有單糖類、磷酸己糖類、氨基酸類、己糖酸類、羧酸類、酯類和脂肪酸類。本研究用Biolog Gen III 微平板法篩選適合添加及利用率最高的碳源。結(jié)果表明，氨基酸類中的L-脯氨酸為嗜冷黃桿菌CH06 和CH07 株利用率第一的碳源，為CH08 株利用率第二的碳源，綜合三株菌利用碳源的情況選用L-脯氨酸作為添加碳源。

L-脯氨酸是一種結(jié)構(gòu)與性質(zhì)獨特的生物蛋白質(zhì)氨基酸，為亞氨基酸，分子量較小，水溶性比任何氨基酸都大，能發(fā)揮多方面生理功能。據(jù)報道，L-脯氨酸的積累與細菌滲透脅迫耐受性密切相關(guān)。Csonka[20]研究表明，鼠傷寒沙門氏菌Salmonella typhimurium 的L-脯氨酸高產(chǎn)菌株獲得了滲透抗性；Zaprasis 等[21,22]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌Bacillus subtlis 可積累胞內(nèi)L-脯氨酸，對抗高滲透壓的脅迫。劉玉霞等[23]最新研究發(fā)現(xiàn)：耐氧突變株Clostridium sp.Aeroto-AUH-JLC108 在有氧條件下生長時，獲得了積累脯氨酸的能力，所以在相同接種條件下，在有氧條件下耐氧突變株的生長速度明顯快于原出發(fā)菌株，生物量是原出發(fā)菌株在厭氧條件下的2～3 倍。這些研究結(jié)果或許能作為L-脯氨酸在嗜冷黃桿菌培養(yǎng)中發(fā)揮作用的依據(jù)。

盡管已有研究通過改良嗜冷黃桿菌培養(yǎng)基而提高了產(chǎn)菌量，但是缺乏改良培養(yǎng)基對菌株形態(tài)、大小和致病性影響的分析。本研究對TYES 培養(yǎng)基添加L-脯氨酸后培養(yǎng)的嗜冷黃桿菌進行革蘭氏染色和掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)仍為細長、兩端鈍圓的革蘭氏陰性菌，平均長度和直徑與TYES 培養(yǎng)基培養(yǎng)的該菌幾乎沒有差異，也在文獻報道范圍內(nèi)。為了判斷改良培養(yǎng)基是否影響嗜冷黃桿菌毒力，本研究用嗜冷黃桿菌人工感染了虹鱒幼魚，出現(xiàn)臨床癥狀的時間、死亡率與對照組無明顯差異，說明改良培養(yǎng)基不影響該細菌的毒力。本研究結(jié)果對于嗜冷黃桿菌的體外培養(yǎng)及規(guī)?；a(chǎn)具有重要指導(dǎo)意義。