毛文點(diǎn)　庹玲玲　齊文續(xù)　蘇睿智　鄧常清　鄒龍

〔摘要〕 目的 觀察黃芪-當(dāng)歸不同配比對(duì)毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花素、阿魏酸及洋川芎內(nèi)酯I含量的影響。方法 采用水提法制備黃芪、當(dāng)歸及黃芪-當(dāng)歸不同配比（5∶1、1∶1、1∶5）的藥液，通過(guò)高效液相色譜法對(duì)6種主要成分分別進(jìn)行線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性及回收率檢測(cè)。結(jié)果 6種對(duì)照樣品線性關(guān)系良好，儀器的精密度、樣品的重復(fù)性及回收率均滿(mǎn)足標(biāo)準(zhǔn)。黃芪-當(dāng)歸5∶1配伍時(shí)，6種成分的溶出量均未達(dá)90%;當(dāng)配伍為1∶1和1∶5時(shí)，6種成分的溶出大多高于或接近100%。結(jié)論 黃芪-當(dāng)歸以1∶1和1∶5配伍時(shí)可促進(jìn)兩者主要成分的溶出，且1∶1配伍時(shí)溶出效果最好，說(shuō)明在1∶1配伍時(shí)當(dāng)歸對(duì)有效成分的溶出有促進(jìn)作用。

〔關(guān)鍵詞〕 高效液相色譜法;黃芪;當(dāng)歸;黃酮類(lèi)成分;阿魏酸;洋川芎內(nèi)酯I;含量測(cè)定

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R284.2? ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.03.005

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of different ratios of Huangqi （Astragali Radix）-Danggui （Angelicae Sinensis Radix） on the contents of calycosin-7-O-glucoside， calycosin， ononin， formononetin， ferulic acid and senkyunolide I. Methods The medicinal solutions of Huangqi （Astragali Radix）， Danggui （Angelicae Sinensis Radix） and Huangqi （Astragali Radix）-Danggui （Angelicae Sinensis Radix） in different ratios （5∶1， 1∶1， 1∶5） were prepared by water extraction method， and the linear relationship， precision， repeatability and recovery rate of the 6 main components were tested by high performance liquid chromatography. Results The linear relationship of the 6 control samples was good， and the precision of the instrument， the repeatability of the sample and the recovery rate all met the standards. When the Huangqi （Astragali Radix）-Danggui （Angelicae Sinensis Radix） 5∶1 compatibility， the dissolution of the 6 components was lower than the 90%; when the compatibility was 1∶1 and 1∶5， the dissolution of the 6 components was mostly higher than or close to 100%. Conclusion Huangqi （Astragali Radix）-Danggui （Angelicae Sinensis Radix） can promote the dissolution of most ingredients in the medicine when the compatibility is 1∶1 and 1∶5， and the dissolution effect is the best when the compatibility is 1∶1， indicating that Danggui （Angelicae Sinensis Radix） can promote the dissolution of active ingredients in the 1∶1 compatibility.

〔Keywords〕 high performance liquid chromatography; Huangqi （Astragali Radix）; Danggui （Angelicae Sinensis Radix）; flavonoids; ferulic acid; senkyunolide I; assay

藥對(duì)是中醫(yī)學(xué)精粹之一，是中醫(yī)臨床遣藥組方常用的配伍形式，許多藥對(duì)已成為經(jīng)典名方。黃芪-當(dāng)歸配伍是常用的補(bǔ)氣生血類(lèi)藥對(duì)，通常用于治療血液系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)及其腫瘤等疾病，在臨床上應(yīng)用頻繁[1-4]。在中藥復(fù)方中，名同實(shí)異的當(dāng)歸補(bǔ)血湯有很多，其中，使用最多的源自李東垣所創(chuàng)《內(nèi)外傷辨惑論》，該方由黃芪5倍于當(dāng)歸配伍組成[5]。

已有研究表明，黃芪中的主要活性成分為黃酮、皂苷以及多糖[6]。當(dāng)歸中的主要成分為當(dāng)歸多糖、有機(jī)酸和揮發(fā)油等[7]，在兩者配伍中，黃芪中的黃芪甲苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素和當(dāng)歸中的阿魏酸均有較高含量[8]。黃芪當(dāng)歸不同配比，主要成分含量會(huì)發(fā)生不同改變。研究發(fā)現(xiàn)，毛蕊異黃酮為典型的植物雌激素，產(chǎn)生雌激素樣作用，還有抗氧化、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用[9];毛蕊異黃酮苷具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用[10];芒柄花素具有抗氧化、抗病毒等作用[11];阿魏酸是當(dāng)歸中的主要成分之一，具有抗氧化、抗血栓、降血脂等作用[12];洋川芎內(nèi)酯I具有抗氧化損傷、抗炎鎮(zhèn)痛以及抗凝及抗血小板聚集等作用[13]。中藥中的有效成分眾多，不同成分之間的藥理作用有一定差異，兩藥合用會(huì)對(duì)藥理作用及各成分的含量等方面產(chǎn)生一定影響。本文通過(guò)研究黃芪-當(dāng)歸不同比例配伍下6種主要藥效成分的含量變化，以探求其配伍規(guī)律，為接下來(lái)研究各成分在動(dòng)物體內(nèi)外的吸收情況提供研究基礎(chǔ)，同時(shí)也為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）;AR224CN電子分析天平（奧豪斯儀器有限公司）;SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市中天儀器科技有限公司）;H3-20KR臺(tái)式高速冷凍離心沉淀機(jī)（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）;Eppendorf微量移液器（德國(guó)艾本德股份公司）;超聲清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2? 實(shí)驗(yàn)用藥

黃芪、當(dāng)歸均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供并鑒定，當(dāng)歸樣品為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis （Oliv.） Diels的干燥根，黃芪為豆科植物膜莢黃芪Astragalus membranaceus （Fisch.） Bge.的干燥根。毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花素、阿魏酸及洋川芎內(nèi)酯I均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)分別為R31A10F96530、Y11J10H92789、

P03A10F84910、F27J7S18516、H27J7L16718、P16A10

F85918，純度均≥98%。乙腈、甲醇均為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3? 色譜條件

Welchrom HPLC C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相0.1%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～16 min 20% B，16～25 min 20%～32% B，25～34 min 32%～34% B，34～45 min 34%～48% B，45～65 min 48%～65% B），柱溫35 ℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

1.4? 對(duì)照品溶液的制備

應(yīng)用電子分析天平精密稱(chēng)取適量對(duì)照品毛蕊異黃酮苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素，分別置于10 mL的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成濃度分別為600、620、520、540、580、630 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

1.5? 黃芪當(dāng)歸不同配伍水提液的制備

設(shè)立以下5個(gè)組，單用當(dāng)歸組、單用黃芪組、黃芪-當(dāng)歸5∶1、1∶1、1∶5組。按照以上比例分別稱(chēng)取適量藥材飲片，以水熱回流法提取3次，第1次8倍量的水提取1 h，第2、3次6倍量的水提取1 h，合并3次提取液，真空減壓濃縮至生藥量1.0 g/mL備用[14]。

1.6? 供試品溶液的制備

精密量取各不同比例配伍的藥液1 mL，置于10 mL離心管中，加甲醇8 mL，混合，3 000 r/min離心12 min，離心半徑為9 cm，吸取上清液，甲醇溶液定容至10 mL，搖勻，經(jīng)0.22 μL微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2 結(jié)果

2.1? 方法學(xué)考察

2.1.1? 線性關(guān)系考察? 精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，分別加甲醇定容至5 mL的容量瓶中，得到毛蕊異黃酮苷的濃度為1.875、3.75、7.5、15、30、60、120 μg/mL，阿魏酸的濃度為3.875、7.75、15.5、31、62、124 μg/mL，洋川芎內(nèi)酯I的濃度為1.625、3.25、6.5、13、26、52 μg/mL，芒柄花苷的濃度為3.125、6.25、13.5、21.6、27、54 μg/mL，毛蕊異黃酮的濃度為1.719、3.438、6.875、13.75、27.5、55 μg/mL，芒柄花素的濃度為1.575、3.15、6.3、12.6、25.2、50.4 μg/mL。按照“1.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并記錄其峰面積，以各成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得6種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)R以及線性范圍。見(jiàn)表1。

2.1.2? 精密度實(shí)驗(yàn) 取黃芪-當(dāng)歸1∶1組的供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，測(cè)得毛蕊異黃酮苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值分別為0.20%、0.14%、0.07%、0.19%、0.15%、1.08%，表明儀器精密度好。

2.1.3? 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)? 取黃芪-當(dāng)歸1∶1配伍組的供試品溶液，在配制后的0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣分析，每次進(jìn)樣10 μL，測(cè)得毛蕊異黃酮苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值分別為0.57%、3.43%、0.12%、0.31%、0.43%、1.34%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4? 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)? 精密量取黃芪-當(dāng)歸1∶1配伍組的原藥液6份，每份1 mL，配制供試品溶液，各進(jìn)樣10 μL，測(cè)得毛蕊異黃酮苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值分別為1.76%、2.47%、1.56%、1.54%、1.46%、1.16%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5? 加樣回收率實(shí)驗(yàn)? 精密量取已知6種化合物含量的黃芪-當(dāng)歸1∶1配伍組的原藥液6份，每份1 mL，制備供試品溶液，每份中精密加入毛蕊異黃酮苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素峰標(biāo)準(zhǔn)品19.9、7.6、3.7、6.0、1.75、1.7 μg。色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算各對(duì)照品的加樣回收率。見(jiàn)表2。

2.2? 供試品含量測(cè)定

精密量取各配伍組藥液1 mL，制備成供試品溶液，各配伍組均平行配制3份，在“1.3項(xiàng)”色譜條件下進(jìn)樣分析，測(cè)定不同配伍劑量藥液中6種主要成分的實(shí)際含量及溶出率。溶出率（%）=不同配比提取液的實(shí)測(cè)含量/該配比下的理論含量×100%，理論含量指單味藥材在此配伍下應(yīng)測(cè)得的含量值。結(jié)果顯示，黃芪-當(dāng)歸為傳統(tǒng)5∶1配伍時(shí)，6種成分的溶出率均低于90%;1∶5配伍時(shí)，芒柄花素的溶出顯著增加，毛蕊異黃酮?jiǎng)t明顯降低，其余成分與理論值接近;1∶1配伍時(shí)，除阿魏酸溶出率明顯降低外，其他5種成分的溶出率均高于或接近100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在傳統(tǒng)黃芪-當(dāng)歸5∶1配伍下毛蕊異黃酮苷及芒柄花苷的總含量高于1∶1組，其余各成分含量顯著低于或接近1∶1組分，黃芪-當(dāng)歸以1∶1和1∶5配伍時(shí)可促進(jìn)藥液中大多數(shù)成分的溶出，尤其在1∶1配伍時(shí)，當(dāng)歸對(duì)黃芪中有效成分的溶出有顯著的促進(jìn)作用。見(jiàn)表3。

3 討論

3.1? 色譜條件的考察

本試驗(yàn)分別考察了甲醇-0.3%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.3%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水對(duì)于黃芪與當(dāng)歸中 6種成分的洗脫能力，結(jié)果表明，當(dāng)流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水時(shí)，在梯度洗脫的條件下，對(duì)于目標(biāo)成分的分離效果均較好。同時(shí)，在乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脫的條件下，也考察了在20、25、30、35 ℃不同溫度下的影響，結(jié)果表明，隨著溫度的升高，分離度也逐步增加，35 ℃時(shí)分離效果最佳。

3.2? 指標(biāo)成分的選擇

以當(dāng)歸補(bǔ)血湯中的藥物“黃芪”“當(dāng)歸”為關(guān)鍵詞，通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP）數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)當(dāng)歸補(bǔ)血湯中的成分，分析得當(dāng)歸補(bǔ)血湯中共有27個(gè)活性成分，其中23個(gè)屬于黃芪，4個(gè)屬于當(dāng)歸[15]，此藥對(duì)中黃芪活性成分遠(yuǎn)多于當(dāng)歸，且劉傲雪[16]研究當(dāng)歸補(bǔ)血湯在體代謝過(guò)程中黃芪甲苷、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ為7種原型成分。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)指紋圖譜發(fā)現(xiàn)除黃芪甲苷外的其余6種成分響應(yīng)值較高，因此，選擇這幾種作為指標(biāo)成分來(lái)檢測(cè)不同配比的溶出效果，為后續(xù)的大鼠吸收實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

3.3? 不同配伍比例的設(shè)立

本課題組前期研究表明，黃芪和當(dāng)歸配伍在減輕血管局部炎性反應(yīng)中，單用當(dāng)歸及黃芪-當(dāng)歸1∶1配伍時(shí)作用較強(qiáng)[17]，在促進(jìn)造血的功效中，黃芪與當(dāng)歸以1∶1、1∶2.5、1∶5比例配伍時(shí)的促造血作用較佳[18]。本實(shí)驗(yàn)以黃芪-當(dāng)歸1∶1配伍為基礎(chǔ)，設(shè)立不同的配伍比例，以比較主要成分的溶出效果，與后期藥理實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，可望找出有效配伍比例。

3.4? 配伍前后主要化學(xué)成分變化及其意義

當(dāng)歸補(bǔ)血湯中黃芪與當(dāng)歸的配伍比例不同時(shí)，主要成分含量及藥理作用均會(huì)發(fā)生較大變化[19]，顧志榮等[20]研究中黃芪-當(dāng)歸傳統(tǒng)5∶1配伍時(shí)，毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、阿魏酸、Z-藁本內(nèi)酯5種指標(biāo)性成分含量降低顯著。唐蓉等[21]對(duì)黃芪-當(dāng)歸配伍比例10∶1、5∶1、1∶1、1∶5中的主要化學(xué)成分進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，黃芪-當(dāng)歸按10∶1和5∶1配伍時(shí)，其主要化學(xué)成分的含量與理論值相近或較低。而黃芪-當(dāng)歸1∶1和1∶5配伍時(shí)，可促進(jìn)藥物中部分成分的溶出。本研究對(duì)唐蓉研究進(jìn)行優(yōu)化，刪減溶出率較低的10∶1配伍組，同時(shí)新增含量較高且具有增強(qiáng)免疫功能、抗缺血性損傷等作用的芒柄花苷及具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗凝和抗血小板聚集等作用的洋川芎內(nèi)酯I作為考察對(duì)象，為本課題組后期研究黃芪-當(dāng)歸配伍改善病理性血管重構(gòu)提供理論依據(jù)。結(jié)論得出，黃芪-當(dāng)歸5∶1配伍時(shí)，6種成分的實(shí)際含量均低于理論含量，而1∶1和1∶5配伍時(shí)，主要成分含量溶出增加，且1∶1溶出效果最好。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃芪當(dāng)歸以5∶1配伍時(shí)促血管新生療效最好[22]。黃小平等[18]用當(dāng)歸黃芪單體及不同比例配伍對(duì)抑制骨髓造血功能模型小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，各配比均可不同程度地提高骨髓造血功能，其中當(dāng)歸黃芪按1∶1、1∶2.5、1∶5配比時(shí)效果最好。當(dāng)歸補(bǔ)血湯中黃芪-當(dāng)歸不同配比其作用效果并不固定，應(yīng)根據(jù)不同需要靈活應(yīng)用。綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)黃芪-當(dāng)歸在不同配伍時(shí)其主要成分的溶出率的考察，可為后期研究黃芪當(dāng)歸配伍改善病理性血管重構(gòu)的藥效物質(zhì)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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